一种仿生抗排异的多孔钛合金植入物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种仿生抗排异的多孔钛合金植入物及其制备方法与应用。

背景技术

随着中国人口老龄化的趋势，由于骨质疏松、骨关节炎、肿瘤和意外所导致的骨缺损或需要进行骨替换的患者越来越多，往往需要使用骨固定或骨替代植入物进行治疗来满足日常运动需求。当前临床常用金属材料为不锈钢、钛合金和钴铬合金，其中钛合金具有优异生物性能被广泛应用，但其均为生物惰性材料，难以与骨组织产生生物化学结合，同时金属植入物还会引起人体的排异炎症反应，例如纤维组织包裹或由于磨屑而导致长期的局部炎症，进而导致植入部位骨吸收和界面松动，最终植入失败，患者因此需要承受局部疼痛肿胀、行走困难和二次手术创伤等副作用。

CN 106222723 A公开了一种植入体复合生物活性涂层，由以下原料制备而得，以重量份计为：磷酸三钙25-38份、磷酸四钙10-18份、纳米羟基磷灰石7-15份、水化硅酸钙5-12份、氧化石墨烯1-4份、聚酰胺2-5份、纳米镁1-3份、磷酸氢锶4-8份、氧化铍1-4份、明胶2-6份、氯化镧0.5-3份、赖氨酸0.2-2份、聚乙烯吡咯烷酮0.8-2.5份、海藻酸钠2-8份、碳酸银0.1-0.6份、二水柠檬酸钠1-4份、磷脂酰胆碱0.3-2份、聚乙二醇0.6-2.4份。但采用在植入体表面涂层的方式通常操作复杂，生物相容性差，难以长久维持润滑性和抗菌性，抗排异炎症反应能力弱。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种仿生抗排异的多孔钛合金植入物及其制备方法与应用，其解决了钛合金植入物生物相容性差、植入物与骨组织界面结合困难、排异炎症反应强烈的技术问题。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种仿生抗排异的多孔钛合金植入物，在多孔钛合金植入物表面均匀负载仿生抗排异炎症反应生物改性剂，所述仿生抗排异炎症反应生物改性剂由前驱体溶液与包含亚精胺交联剂的溶液反应而成，前驱体溶液含有蛋白、氨基衍生化阳离子多糖、羧基衍生化阴离子多糖。

可选地，所述蛋白包括猪皮、明胶或胶原蛋白；

所述氨基衍生化阳离子多糖包括脱乙酰壳聚糖、几丁质、羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖中的至少一种；

所述羧基衍生化阴离子多糖包括透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸钠、肝素中的至少一种。

优选地，所述氨基衍生化阳离子多糖为羧甲基壳聚糖，所述羧基衍生化阴离子多糖为海藻酸钠。

可选地，所述仿生抗排异炎症反应生物改性剂的制备方法，包括：

将蛋白、氨基衍生化阳离子多糖和羧基衍生化阴离子多糖溶解于与细胞渗透压一致的溶剂中，加热搅拌，充分溶解后灭菌，在30min内冷却至0～-2℃，得到仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液；

将亚精胺与小分子二醛或醛基修饰的高分子材料在乙醇溶液中通过席夫碱反应形成亚精胺交联剂；

将仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液与亚精胺交联剂混合，静置，使亚精胺交联剂中剩余醛基与凝胶前体溶液中的氨基反应形成席夫碱，反应后，得到仿生抗排异炎症反应生物改性剂。

可选地，所述与细胞渗透压一致的溶剂包括生理盐水或磷酸盐缓冲液；

所述加热搅拌的温度为50-70℃，加热的时间为至少30min，搅拌的转速为1000-2000RPM。

优选地，将小分子二醛或醛基修饰的高分子材料溶于乙醇中，再加入亚精胺，静置至少30min，得到亚精胺交联剂。

优选地，将仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液与亚精胺交联剂混合，在40-45℃条件下静置10-30min，得到仿生抗排异炎症反应生物改性剂。

可选地，所述仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液中，蛋白的浓度为6wt.％-15wt.％，氨基衍生化阳离子多糖的浓度为0.5wt.％-2wt.％，羧基衍生化阴离子多糖的浓度为0.5wt.％-2wt.％，且氨基衍生化阳离子多糖和羧基衍生化阴离子多糖的总体浓度为1wt.％-3wt.％。

可选地，所述亚精胺交联剂中，小分子二醛或醛基修饰的高分子材料中的醛基数量为亚精胺中的氨基数量的1-2倍；

当仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液与亚精胺交联剂混合后，混合物中所述亚精胺交联剂的浓度为0.1-1mmol/L；

所述小分子二醛为戊二醛、对苯二甲醛、邻苯二甲醛、间苯二甲醛中的至少一种；所述醛基修饰的高分子材料为氧化海藻酸钠、醛基封端聚乙二醇中的至少一种。

优选地，所述小分子二醛为对苯二甲醛，所述亚精胺交联剂为亚精胺与对苯二甲醛通过席夫碱反应得到的。

本发明的亚精胺交联剂的中，醛基的数量需要大于氨基的数量，优选为醛基数量为氨基数量的1-2倍。在交联形成寡聚物之后，寡聚物的两端一定是醛基，以便与明胶和羧甲基壳聚糖上的氨基进行交联。交联反应之后，能够减缓生物改性剂的降解，相当于让亚精胺更加缓慢的在体系中释放，达到缓释抗炎的效果。

第二方面，本发明提供一种仿生抗排异的多孔钛合金植入物的制备方法，包括如下步骤：

S1、通过3D打印的方法制备孔径为400-1500μm的多孔钛合金植入物，并在植入物表面进行喷砂、退火、碱热处理；

S2、将步骤S1得到的3D打印多孔钛合金植入物浸没到所述仿生抗排异炎症反应生物改性剂中，加热处理，然后使用离心或真空抽取的方法将所述仿生抗排异炎症反应生物改性剂灌注到多孔钛合金植入物中；

S3、将负载了所述仿生抗排异炎症反应生物改性剂的多孔钛合金植入物在-80℃～-85℃中静置10-20min，使仿生抗排异炎症反应生物改性剂初步固化，然后置于离子溶液中进行物理交联，即得。

可选地，步骤S1中，3D打印的方法包括金属浆料直写3D打印法、选择性激光熔化3D打印法、金属粘合剂喷射3D打印法或者直接能量沉积3D打印法。3D打印方法的产品尺寸和形状更精确，当然亦可采用其他方式成型“多孔钛合金植入物”。

3D打印所用金属粉末质量应为医用级。

在植入物表面进行喷砂、退火可以弥补3D打印技术所带来的表面质量问题，使植入物表面光滑。

可选地，步骤S1中，所述碱热处理为在碱浓度1-15mol/L，温度为25-90℃的环境下，处理12-48h，使多孔钛合金植入物表面亲水化。

优选地，所述碱热处理所用的碱液为氢氧化钾、氢氧化钠、氨水中的一种。

可选地，步骤S2中，所述加热的温度为45-60℃，所述离心的转速为不少于30000RPM，所述离心的时间为10-15min；

步骤S3中，所述离子溶液为氯化钙溶液，其浓度为3-10wt.％，置于离子溶液中进行物理交联的时间为30-300s。

物理交联后用生理盐水冲洗植入物，去除植入物表面残留的氯化钙。

本发明将负载了所述所述仿生抗排异炎症反应生物改性剂的3D打印多孔钛合金植入物仿生抗排异炎症反应生物改性剂前应进行碱热处理(包括但不限于氢氧化钾、氢氧化钠等)，且使用真空灌注或离心的方法进行双相复合，再使用离子溶液，如氯化钙，进行物理交联，最终得到双网络交联生物改性剂包覆的植入物。

第三方面，本发明提供一种仿生抗排异的多孔钛合金植入物在植入式骨组织中的应用。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：本发明通过仿生学思想，利用金属3D打印技术，设计与缺损部位相匹配的相互连接的微孔结构，制造能够负载仿生抗排异炎症反应生物改性剂的同时提供足够的机械性能支持缺损部位的3D打印多孔钛合金植入物。在3D打印多孔钛合金植入物的表面负载外源性亚精胺的仿细胞外基质的仿生抗排异炎症反应生物改性剂，构成“软硬贯穿”仿生抗排异3D打印多孔钛合金植入物。通过局部缓释亚精胺的方法调节植入部位微环境，缓解骨植入物带来的免疫排异反应，赋予骨植入物生物相容性和抗排异炎症反应性能。

亚精胺是从氨基酸中提取的天然有机阳离子，在生物体内分布广泛，能够结合核酸和蛋白质并调节信号通路，参与增殖、分化和凋亡等各种生物过程，具有调节生物体自噬、免疫细胞分化、线粒体呼吸等功能，在炎症相关自身免疫性疾病中具有保护作用，并且能够增强骨和软骨的生长发育。细胞外基质主要由胶原蛋白、蛋白/糖胺聚糖、弹性蛋白等构成，是调节细胞生理功能、维持正常体内平衡的重要成分。骨骼是由胶原蛋白和矿物质组成的多孔结构组织。因此，本发明的仿生抗排异的多孔钛合金植入物能具有良好的生物相容性，植入物与骨组织界面更容易结合，能减轻植入物的排异炎症反应。

本发明通过明胶和壳聚糖上的氨基与亚精胺交联剂中的醛基进行交联反应，能够减缓多孔钛合金植入物表面负载的仿生抗排异炎症反应生物改性剂的降解速度，使亚精胺在体系中更加缓慢地释放，具有持续抗炎的效果，对于减轻植入物的排异炎症长久有效。

附图说明

图1为本发明的仿生抗排异的多孔钛合金植入物的制备方法流程图；

图2为本发明实施例1制备的仿生抗排异炎症反应生物改性剂的实物图；

图3为使用金属直写式3D打印方法制备的钛合金实物图；

图4为本发明实施例1制备的仿生抗排异的多孔钛合金植入物的实物图；

图5为含亚精胺的仿生抗排异炎症反应生物改性剂浸提液对RAW 264.7细胞的IL-6释放作用的影响；

图6为含亚精胺的仿生抗排异炎症反应生物改性剂浸提液对RAW 264.7细胞的TNF-α释放作用的影响；

图7为含亚精胺的仿生抗排异炎症反应生物改性剂浸提液对MC3t3-E1细胞的毒性；

图8为本发明的仿生抗排异炎症反应生物改性剂在不同时间的失重百分比。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明的仿生抗排异的多孔钛合金植入物的制备方法，制备工艺流程如图1所示，包括以下步骤：

S1、制备3D打印多孔钛合金植入物，其中孔隙大小设置为400-1500μm。

S2、将原料粉末溶解于溶剂中，其中蛋白的浓度为6wt.％-15wt.％，氨基衍生化阳离子多糖的浓度为0.5wt.％-2wt.％，羧基衍生化阴离子多糖的浓度为0.5wt.％-2wt.％，且氨基衍生化阳离子多糖和羧基衍生化阴离子多糖的总体浓度为1wt.％-3wt.％，在温度为50-70℃，转速为1000-2000转每分钟条件下溶解，其中仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液应保持50-70℃至少30分钟，并迅速冰上急冷，保证在30min内冷却至0～-2℃，得到仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液。

S3、将亚精胺与小分子二醛或醛基修饰的高分子材料混合，小分子二醛或醛基修饰的高分子材料中的醛基数量为亚精胺中的氨基数量的1-2倍，静置至少为30min，得到亚精胺交联剂。

S4、将3D打印多孔钛合金植入物置于碱液中，应在碱浓度1-15摩尔每升，溶液温度为25-90摄氏度的环境下，处理时间12-48小时。

S5、将仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液与亚精胺交联剂进行混合后，静置一段时间，静置温度为40-45℃，静置时间为10-30分钟，得到仿生抗排异炎症反应生物改性剂。

S6、将仿生抗排异炎症反应生物改性剂浸没3D打印多孔钛合金植入物，加热至45-60℃后，进行离心或抽真空进行灌注，离心速率应大于30000转每分，真空压力应按照3D打印多孔钛合金的渗透率和仿生抗排异炎症反应生物改性剂流变性能确定，得到生物改性剂剂负载的3D打印多孔钛合金植入物。

S7、将生物改性剂剂负载的3D打印多孔钛合金植入物置于-80℃冰箱10-20分钟，待仿生抗排异炎症反应生物改性剂初步固化后，置于氯化钙溶液中氯化钙溶液浓度为3-10wt.％，浸没时间为30-300秒，物理交联后应使用溶剂冲洗三次，去除表面残留氯化钙。

以下结合较佳实施例对本发明方案和效果具体说明。

实施例1

制造3D打印多孔钛合金植入物：采用CATIA V5建立直径10mm高度5mm的圆柱体，作为3D打印金属样件的模型，导入至Simplify3D进行切片，孔隙大小设置为400-1500μm，生成G-code文件，并通过Simplify3D控制金属打印机进行多孔钛合金植入物3D打印，样件制作完毕后将3D打印多孔钛合金植入物置于浓度为10M的氢氧化钠溶液中，25℃下震荡24h，之后取出，用无水乙醇与丙酮分别超声15min三次，烘箱烘干，得到亲水表面的3D打印多孔钛合金植入物。

配制仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液：将600mg明胶、75mg羧甲基壳聚糖、75mg海藻酸钠溶解于10mL的生理盐水中，60℃水浴加热，转子搅拌转速为1000rpm充分搅拌3h，待粉末全部溶解后，升温至70℃搅拌30min，迅速放在冰上，使其30min内急冷至0℃，通过高低温迅速变化，除去其中的大部分微生物，提高其保质期，防止存储过程中易生霉菌。4℃冰箱冷藏储存，得到明胶质量分数为6wt.％，羧甲基壳聚糖质量分数为0.75wt.％，海藻酸钠质量分数为0.75wt.％的仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液。

配制亚精胺交联剂：将8mg对苯二甲醛置于5mL无水乙醇中，涡旋混匀，充分溶解，再加入7.85μL亚精胺，得到亚精胺浓度为2.5mM的亚精胺交联剂。

配制仿生抗排异炎症反应生物改性剂：将仿生抗排异炎症反应生物改性剂前体溶液与亚精胺交联剂以体积比9:1的比例混匀，充分搅拌，置于40℃恒温箱静置30min，得到含亚精胺浓度为250μM的仿生抗排异炎症反应生物改性剂。

将3D打印多孔钛合金植入物浸没仿生抗排异炎症反应生物改性剂中，水浴加热50℃，置于高速离心机中，转速30000rpm，持续10min，之后取出3D打印多孔钛合金植入物，置于-80℃环境中15min，待仿生抗排异炎症反应生物改性剂初步固化后，将3D打印多孔钛合金植入物浸没5wt.％的氯化钙溶液中保持1min，再取出使用生理盐水冲洗三次，用无菌纸擦干后置于4℃环境下保存待用，得到含亚精胺浓度为250μM的“软硬贯穿”仿生抗排异3D打印多孔钛合金植入物。

图2为制备的仿生抗排异炎症反应生物改性剂，其具有温度敏感性，在30℃以下为凝胶弹性体，30℃以上为粘性流体。

图2中，左侧瓶为30℃以上，为流动状态；右侧瓶为室温状态，倒置时无法流下。

说明本发明制备的仿生抗排异炎症反应生物改性剂具有温度敏感性，即可以在30℃以上时利用其流动性的特点，通过高速离心等简单的方式即可将改性剂灌注至具有小孔径的金属植入物中，降低温度后会将改性剂固定在孔隙中，不会流失。

图3为使用金属直写式3D打印方法制备的钛合金样件，多孔钛合金也可使用本发明所提出的其他增材制造方法进行样件制备。图3中展示了孔隙边长为600μm(左上)、400μm(右上)两种不同孔径的多孔样件体视显微镜图像。

图4为使用亚甲基蓝染色后的仿生抗排异炎症反应生物改性剂与孔径为400μm的金属直写式3D打印方法制备的多孔钛合金植入物复合效果图一例，可见多孔样件内部几乎无气泡，仿生抗排异炎症反应生物改性剂能够完全填充孔隙，证明凝胶的流变性能够满足灌注工艺。

实施例2

依照实施例1中制备方法，制备含有亚精胺交联剂浓度为0mmol/L、0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.25mmol/L的生物改性后的多孔钛合金样件，使用与亚精胺分子式相似的小分子多胺二乙烯基三胺(DETA)作为对照组。

根据国标ISO 10993-12:2021,IDT，按照样件与DMEM高糖培养基0.2g/mL的比例，在37℃下浸泡24小时，取浸提液过滤除菌后，置于4℃备用。

在12孔板中接种RAW 264.7细胞，接种密度为每孔50000个，培育12h，待细胞贴壁完全后，更换培养基为含有1000ng/mL的脂多糖的浸提液，孵育24h后使用EILSA试剂盒检测上清液中的促炎因子IL-6和TNF-α的含量。

图5和图6中，Control为对照组，即不使用本发明的生物改性剂浸提液；LPS

实施例3

依照实施例1中制备方法，制备含有亚精胺交联剂浓度为0mmol/L、0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L的生物改性后的多孔钛合金样件。

根据国标ISO 10993-12:2021,IDT，按照样件与DMEM高糖培养基0.2g/mL的比例，在37℃下浸泡24小时，取浸提液过滤除菌后，置于4℃备用。

在96孔板中接种MC3t3-E1细胞，接种密度为每孔5000个，培育12h，待细胞贴壁完全后，更换培养基为不同浓度的生物改性剂浸提液，孵育24h或48h后使用CCK-8试剂盒检测细胞活性。

图7中，可以发现添加亚精胺交联剂的生物改性剂浸提液在一定浓度范围内具有促进细胞活性的作用，且随着时间延长，细胞存活率未出现明显下降。证明本发明的多孔钛合金样件具有良好的生物相容性。

实施例4

依照实施例1中的方法，制备了含有或不含有亚精胺交联剂的不同羧甲基壳聚糖和海藻酸钠配比的生物改性剂前体溶液，并置于37℃生理盐水中震荡21天，在1天、3天、5天、7天、14天、21天取出，用滤纸擦干后称重，计算降解质量百分比进行绘图。

如图8所示，图中，GO

GO

GOS

SPD-TA@GOHS表示生物改性剂前体溶液中，羧甲基壳聚糖浓度为1wt.％，海藻酸钠浓度为0.5wt.％，且含有亚精胺交联剂制备的生物改性剂。

SPD-TA@GOESE表示生物改性剂前体溶液中，羧甲基壳聚糖浓度为0.75wt.％，海藻酸钠浓度为0.75wt.％，且含有亚精胺交联剂制备的生物改性剂。

SPD-TA@GOSH表示生物改性剂前体溶液中，羧甲基壳聚糖浓度为0.5wt.％，海藻酸钠浓度为1wt.％，且含有亚精胺交联剂制备的生物改性剂。

可以看出生物改性剂降解能力随海藻酸钠浓度升高而升高，且亚精胺交联剂提高了生物改性剂的体外抗降解能力，延长了降解时间，使亚精胺能够缓慢持续释放。主要因为氨基衍生化阳离子多糖中富含氨基，蛋白中赖氨酸残基同样为氨基。在亚精胺交联剂中，二胺和二醛会因西弗碱反应形成聚合度不同的寡聚物，但反应前氨基和醛基投料比为1：1.2，因此理论上每种寡聚物的末端应都为醛基。将亚精胺交联剂与生物改性剂前体溶液混合后，亚精胺交联剂末端的醛基会和氨基衍生化阳离子多糖和蛋白中的氨基形成西弗碱，从而实现交联剂与凝胶前体溶液的共价结合。因此，本发明的生物改性剂应用到多孔钛合金植入物上，作为植入式骨组织，具有持续抗炎的作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。