一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种组织型纤溶酶原激活剂tPA或其突变体的CTP融合蛋白及其制备工艺以及其在医疗上的应用。

背景技术

组织型纤溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator，tPA)是纤溶酶原激活剂的一种，主要由血管内皮细胞合成和释放，存在于哺乳动物的血浆中，是一种丝氨酸蛋白酶。tPA高效特异的与血栓中的纤维蛋白结合，所产生的tPA-纤维蛋白复合物能够快速高效地激活血凝块中的纤溶酶原，产生纤溶酶，使纤维蛋白降解成可溶性产物，达到溶解血栓，使栓塞的血管重新畅通的目的。tPA与纤维蛋白特异性结合后，其激活纤溶酶原的活性相较于游离状的tPA提高100倍，同时由于正常血液中极少有纤维蛋白生成，因此tPA不会使正常人发生系统性纤溶状态。高效、特异的溶栓性能使tPA成为治疗栓塞性疾病的理想药物。但由于tPA容易与血液中的纤溶酶原激活抑制剂(PAI)形成复合物而丧失活性，同时因为可与肝细胞膜上的特异性受体结合而导致其半衰期仅4～6分钟，这就使得其用于溶栓时具有一定的局限性。由于存在以上问题影响溶栓效率，为达到治疗效果，tPA的治疗剂量高达100～150mg，而高剂量就增加了由系统性纤溶引起的出血风险。而通常情况下脑缺血开始发病后需要在3小时以内输入tPA才能达到治疗效果，超过时间窗后使用反而会增加出血风险，治疗时间窗短，也在一定程度上限制了tPA的使用。

基于tPA存在的药代动力学特性差，给药方式复杂，给药时间长，出血风险高，治疗时间窗短的问题，研究人员从结构入手，利用基因工程手段主要从延长体内半衰期、提高纤维蛋白的亲和力、增加纤溶酶原的催化活性、抗PAI形成以及延长治疗时间窗的方向进行改造，其中的代表性药物是由美国基因泰克公司研制开发的tPA多点突变体TNK-tPA(TNKase)，其于2000年被美国FDA批准用于治疗急性心肌梗塞。通过对天然tPA序列进行Thr103Asn突变(T)、Asn117Gln突变(N)和KHRR296-299AAAA突变(K)，TNK-tPA半衰期从3～5min延长至起始20～24min和终末90～130min，特异性增强10-14倍，极少消耗纤维蛋白原，抗PAI-1能力增强80倍，溶栓活性更强。在临床上应用时，TNKase相比于之前的溶栓药物，从静脉输入给药时间30min～90min提高到弹丸式静脉推注5～10s，大大提高了给药的便捷性，无需负荷剂量，免疫原性进一步降低，90min血管开通率可达80％以上，TIMI3级血流改善60％以上，治疗时间窗延长至6小时，同时并未增加患者的脑出血及中风发生率。

然而，虽然TNKase的溶栓效率相较于天然tPA已大幅提升，半衰期和治疗窗口期也已大大延长，但在临床实践中，仅有少数病人能够在几小时内接受溶栓治疗，且溶栓时仍存在一定的出血风险，因此需要进一步提高tPA的溶栓效率，降低出血风险，延长tPA变体在体内的半衰期且尽可能获得拓宽的治疗时间窗。

由于tPA的空间结构较为复杂也较为脆弱，蛋白翻译后保证正确折叠，形成有活性的空间构象进而保持tPA的酶活性较为困难，其中tPA的C-末端的丝氨酸结构域与其功能密切相关，在tPA的C端进行改造时面临着更大的挑战。正因如此，对于tPA的长效化改造多集中于对其进行突变体改造，对其C端的改造鲜有报道，仅有少数现有技术报道了使用IgG抗体FC片段、人血清白蛋白HAS在tPA或其突变体的C端进行融合改造。

综上所述，在现有技术基础上，开发一种全新的稳定的tPA或其变体的C端融合蛋白以提升现有tPA药物的治疗活性，延长其半衰期，获得拓宽的治疗时间窗，减少纤维蛋白原的消耗，降低潜在的出血风险具有重要价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种tPA或其突变体的CTP融合蛋白，其相较于现有tPA药物溶栓效果更好，PAI-1亲和性更低，热稳定性更高，纤维蛋白原消耗更少，半衰期更长，潜在出血风险更低。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白，其结构为tPA-(L-CTP)n，其中L为柔性肽接头或不存在，n为1～4的整数，tPA为天然tPA或具有相似功能的tPA变体，CTP为人hCGβ羧基末端肽序列或其突变体，CTP通过或不通过柔性肽接头连接到tPA的C端。

进一步地，CTP为人hCGβ羧基末端肽，其氨基酸序列为SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:1)。

CTP可以增加重组融合蛋白唾液酸含量，唾液酸能增加黏蛋白的黏度，遮蔽蛋白上的糖链，使其不被糖苷酶水解，保护蛋白质免受蛋白酶降解，同时可提高蛋白糖基化程度，增加分子量，因此可以延长药物的体内半衰期。同时由于CTP是人体自身的肽序列，因此免疫原性非常低。

进一步地，tPA是具有相似功能的tPA变体TNK-tPA或TNKA-tPA，TNK-tPA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；TNKA-tPA的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步地，柔性肽接头含有1-20个氨基酸，选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。

优选地，柔性肽接头的氨基酸序列为(GGGGS)m，其中m为1～4的整数。

更优选地，柔性肽接头氨基酸序列为GGGGS(SEQ ID NO:4)。

进一步地，柔性肽接头不存在。

进一步地，n为1或2。

进一步地，所述重组蛋白结构为TNK-tPA-(CTP)

进一步地，所述重组蛋白结构为TNKA-tPA-CTP，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

另一方面，本发明提供编码以上所述的重组蛋白的DNA序列。

进一步地，所述的DNA序列编码所述重组蛋白TNK-tPA-(CTP)

进一步地，所述的DNA序列编码所述重组蛋白TNKA-tPA-CTP，如SEQ ID NO:8所示。

再一方面，本发明提供一种载体，该载体包含以上所述的编码上述重组蛋白的DNA序列。

再一方面，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体。

本发明所述的宿主细胞是指通过基因工程手段或者其它方法使其包含本发明所述载体、核酸序列或者蛋白序列的各种具有生物学意义的细胞及其它可能的形式。

进一步地，所述的宿主细胞是CHO的衍生细胞株。

再一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂以及有效量的以上所述的重组蛋白。

再一方面，本发明提供一种上述重组蛋白的制备方法。该制备方法采用上述宿主细胞制备上述重组蛋白。

再一方面，本发明提供一种上述重组蛋白在制备用于预防和/或治疗血栓栓塞性疾病的药物中的应用。

在本发明范围内，“血栓栓塞性疾病”尤其包括疾病例如具有ST段抬高(STEMI)和不带有ST段抬高(无STEMI)的心肌梗塞，稳定/不稳定心绞痛，冠状动脉介入治疗例如血管成形术或主动脉冠状动脉旁路手术后的再阻塞和再狭窄，外周血管闭塞性疾病、肺栓塞、深度静脉血栓形成和肾静脉血栓形成，暂时性缺血发作以及血栓形成型和血栓栓塞型脑卒中，包括中风、脑缺血、全身血栓栓塞和缺血，急性、间歇性或持续性心脏心律不齐、心脏复律、心脏瓣膜疾病等心脏性血栓栓塞等。

进一步地，所述疾病选自急性心肌梗塞、急性肺栓塞、急性缺血性脑卒中。

再一方面，本发明提供一种上述重组蛋白在制备与人类血液或组织接触的医疗器械或生物医学材料的表面涂层药物中的应用。

在本发明范围内，表面涂层药物是指本发明的重组蛋白可通过化学结合方式或吸附方式涂覆在医疗器械或生物医学材料的表面，如人工心脏瓣膜、血管支架、心脏起搏器等的表面。

在本发明中，发明人创造性地对TNK-tPA进一步改造，改造方法主要包括在TNK-tPA的C端或在其473位的Ala突变为其它氨基酸如Ser获得的突变体TNKA-tPA的C端通过或不通过一段通用的柔性肽接头(linker)与CTP片段融合，获得了半衰期更长且具有较好生物学活性的TNK-tPA或TNKA-tPA的CTP融合蛋白。

综上，本发明通过将一个或多个CTP序列通过或不通过柔性肽接头连接到tPA或其变体的C端获得了一种全新的组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白。与现有技术相比，本发明的重组蛋白溶栓效果更好，与PAI-1的亲和力显著降低，热稳定性更高，半衰期更长，能够减少纤维蛋白原消耗率，降低潜在出血风险，具有更高的安全性。

附图说明

下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：

图1显示了重组表达Pcgs3.2-TNK-tPA-(CTP)

图2显示了融合蛋白1和融合蛋白2的SDS-PAGE的检测结果图。

图3显示了通过高效液相色谱对融合蛋白1和融合蛋白2进行单双链比例分析所得的色谱图。

图4显示了融合蛋白1和融合蛋白2的气泡上升法标准曲线。

图5显示了不同浓度rt-PA(A)、TNK-tPA(B)、融合蛋白1(C)和融合蛋白2(D)与PAI-1的结合性曲线。

图6显示了不同浓度TNK-tPA、融合蛋白1和融合蛋白2溶栓3h后溶栓体系中纤维蛋白原的含量检测结果。

图7显示了TNK-tPA、融合蛋白1和融合蛋白2的大鼠给药后不同时间点血浆中的药物含量测定结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.融合蛋白1和融合蛋白2重组表达载体的构建

本发明所构建的融合蛋白1为2个CTP(SEQ ID NO:1)不经过柔性肽接头连接至TNK-tPA(SEQ ID NO:2)的C端，所得融合蛋白TNK-tPA-(CTP)

1)为了便于将目的片段插入表达载体的特定位点，在所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为Hind III和EcoR I。

2)分别将全长1824bp和1749的DNA片段插入转移载体如pUC57中的EcoRV限制性酶切位点间，分别获得了携带有TNK-tPA-(CTP)2和TNKA-tPA-CTP编码基因的中间质粒pUC57-TNK-tPA-(CTP)2和pUC57-TNKA-tPA-CTP。

3)对中间质粒所含TNK-tPA-(CTP)

4)目的基因测序无误后，通过基因工程方式将目的片段TNK-tPA-(CTP)

5)分别将含有目的片段TNK-tPA-(CTP)

6)挑取5)中单菌落接种至含100mg/mL Kan的LB液体培养基中，放入恒温摇床37℃，220rpm，培养6-8小时。

7)离心：12000rpm，4℃，2min。

8)弃上清，收集沉淀，然后通过质粒提取试剂盒提取重组表达载体质粒pCHO3.2-TNK-tPA-(CTP)

9)对8)质粒进行DNA测序，验证所携带的目的基因TNK-tPA-(CTP)

实施例2.融合蛋白在转染细胞系中表达

将实施例1构建的重组的表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达融合蛋白1TNK-tPA-(CTP)

1)取生长状态良好的CHOzn细胞，通过细胞计数仪计数后，用新鲜培养基将细胞密度调整为2.5×10

2)调整电穿孔仪参数：电压300V，电容950μF，选择指数衰减，进行电转操作，将重组表达载体质粒pCHO3.2-TNK-tPA-(CTP)

3)将电转后的细胞转移到装有5mL完全培养基的T-25悬浮细胞培养瓶中，在37℃和5％ CO

4)使用有限稀释法进行单克隆铺板和单克隆成像系统拍照留作单克隆源性证据，获得单克隆细胞株。

实施例3.融合蛋白的生产

1)种子细胞培养：分别取实施例2获得的稳定表达融合蛋白1和融合蛋白2的单克隆细胞株各1支，接种至含EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium培养基的无菌摇瓶中，在37℃、5％CO2、转速为130rpm的恒温摇床中进行培养.

2)传代培养：培养至细胞密度为3×10

3)每天检测培养液中细胞密度和细胞活率，细胞活率下降至80％左右停止培养和流加培养基。

4)离心：1200rpm，4℃，20min。

5)离心结束后弃掉沉淀，收获上清液。

实施例4.融合蛋白的纯化与定量

1)用稀HCl将实施例3中收获的上清的pH调节至6.2，经0.45μm膜过滤，备用。

2)离子交换层析：将预处理后的样品以5ml/min的速度上样至用20mM HAC-NaAC+0.043％TW20缓冲液平衡后的阳离子交换层析柱(SP)。

3)冲洗：上样结束后用20mM HAC-NaAC+0.043％TW20缓冲液冲洗5个柱体积。

4)洗脱：提高NaCl盐浓度至0.3M进行洗脱，收集洗脱液。

5)亲和层析：洗脱液用NaOH调节pH至7.2，上样至经20mM PB7.2+0.043％TW20平衡的Lysine HyperD亲和层析柱。

6)洗脱：用20mM PB7.2+0.1M Arg+0.043％TW20组成的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液即为纯化后的样品，经0.22μm无菌滤膜过滤后，-70℃冻存。

7)蛋白浓度测定：以BSA作为标准品，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。

实施例5.融合蛋白的质量分析

1)表观分子量测定：分别取10μL左右2μg经变性处理(DTT和高温变性)后的融合蛋白1和融合蛋白2，加样至含10％聚丙烯酰胺的分离胶的上样孔(含5％聚丙烯酰胺的浓缩胶)中；将胶片及固定器放入电泳槽中，加入电泳液，调节电泳仪电压90V，运行10分钟左右，再将电压调至140V，继续运行40分钟左右，去下胶片放入考马斯亮蓝染色液中染色10分钟，再用脱色液进行脱色处理，脱色完毕后放入凝胶成像系统观察电泳结果，并通过标准蛋白条带的位置判断融合蛋白1和融合蛋白2的表观分子量。由SDS-PAGE测得纯化后的融合蛋白1和融合蛋白2的表观分子量约为76和73kDa，检测结果见附图2。由于融合蛋白C端CTP的糖基化影响电泳的迁移率，因此实际表观分子量更大。

2)融合蛋白单双链含量测定：依现行《中华人民共和国药典》(通则0512)中的方法测定其单双链含量。色谱柱Tsk-Gel2000SWxl(7.8mm×300mm)；洗脱液0.2mol/L PB-0.1％SDS水溶液；流速0.5ml/min；检测波长：214nm；检测时间：30min；柱温：23℃；进样量：20μl；样品处理：将纯化后的融合蛋白1和融合蛋白2用流动相稀释至1.0mg/ml，取1.0ml，加入3.0ml 0.02mol/L DTT水溶液，混匀，80℃水浴5min，放置至室温。经检测融合蛋白1单链含量为75.58％，双链含量为24.42％，详见附图3所示。

3)气泡上升法测定融合蛋白1和融合蛋白2的比活，方法如下：

a)反应A液的配制：凝血酶溶液120μl分别和120ul含不同梯度TNK-tPA标准品(绘制标准曲线用)以及待测样品融合蛋白1和融合蛋白2进行混匀，放入冰水浴备用.

b)反应B液的配制：1000μl牛纤维蛋白原溶液和20ul纤溶酶原在试管中混匀，冰水浴放置备用。

c)将200μl A液加入B液管中，快速混匀，37℃孵育，开始计时。

d)当气泡全部上升到表面时(个别气泡沾到壁上可以不计)为终点，记录时间。

e)以各稀释度标准品TNK-tPA的活性对数为横坐标(X)，气泡上升时间对数为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到回归方程。根据样品的气泡上升时间可求得样品的活性。融合蛋白1和融合蛋白2比活分别为6.12×10

实施例6.融合蛋白与PAI-1亲和力的测定

1)准备2mL PBS和0.05％ Tween-20(PBST)。

2)用PBST稀释rt-PA、TNK-tPA、融合蛋白1(TNK-tPA-(CTP)

3)准备200μl PBS稀释的PAI-1-NHS(50nmol/L)，每组实验中，向16个PCR管中各加入10μlPAI-1-NHS并混匀；

4)使用毛细管吸取混合好的样品，将吸有梯度浓度样品溶液的毛细管放入Monolith大分子互作仪上样托盘，将托盘放入Monolith大分子互作仪测定融合蛋白与PAI-1的Kd值。

人组织型纤溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)是导致人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)失活的主要因素，同时也是影响其体内半衰期的重要因素，试验结果表明与第二代溶栓剂rt-PA(Kd＝0.45μM)和替奈普酶TNK-tPA(Kd＝1.93μM)相比，本发明的融合蛋白1和融合蛋白2与PAI-1的亲和力显著降低，分别为6.53μM和9.28μM，结果如附图5和表1所示，表明本发明的融合蛋白1和融合蛋白2对PAI-1的耐受性显著提高。

表1不同溶栓样品同PAI-1亲和力计算结果

实施例7.融合蛋白热稳定性分析

用PBS将参比制剂TNK-tPA(铭复乐，由广州铭康生物工程有限公司提供)和本发明所述融合蛋白1(TNK-tPA-(CTP)

表2热力学参数的定义及其评价标准

通过快速热稳定分析生物大分子在溶液中的热力学参数如Tm、Tsize、Ton/agg、Kd、rh、PDI等能够快速评估生物大分子在该溶剂体系中的稳定性，为初步判定大分子结构的稳定性提供参考依据，同时也可以通过某种大分子在不同溶液中的热稳定性分析为大分子药物制剂配方的筛选提供重要参考依据。通过快速热稳定分析仪Panta(NanoTemp公司，德国)对TNK-tPA和本发明所述融合蛋白1和融合蛋白2的各参数进行快速检测的检测结果如下表3。

表3三种溶栓剂热力学参数测定结果

由以上结果可知，融合蛋白2Tm值略小于融合蛋白1以及TNP-tPA。随着温度的增加，各蛋白分子结构中的第一个结构域打开，TNK-tPA、融合蛋白1和融合蛋白2的粒径均开始增加，其中融合蛋白1粒径增加较快，TNK-tPA和融合蛋白2相对缓慢；随着温度的进一步增加，TNK-tPA、融合蛋白1和融合蛋白2分子结构中的第二个结构域组件打开，TNK-tPA、融合蛋白1和融合蛋白2粒径均进一步增加，但TNK-tPA粒径在增加的过程中形成大的聚集体，而融合蛋白1和融合蛋白2均未出现大的聚集体。另外，三种蛋白在PBS中的PDI均大于0.25小于1，表明样品为多分散体系，均有聚集体。三种蛋白在PBS中的扩散相互参数KD均为负值，表明在PBS溶液中三种溶栓剂均呈现相互吸引的倾向。通过各参数的定义以及评价标准，综合分析来看TNK-tPA和融合蛋白1热稳定性相当，相比二者，融合蛋白2热稳定性更高，分子结构更加稳定。

实施例8.融合蛋白体外溶栓活性测定

本试验采用4例混合人源血浆进行试验，重复3次。考察100nmol/L的溶栓剂TNK-tPA、融合蛋白1(TNK-tPA-(CTP)

公式1：TR

公式1中TR

表4体外溶栓模型的构建方法及试验体系

体外溶栓实验结果如下表5所示。结果表明，在抑制剂PAI-1存在的血栓模型中，TNK-tPA、融合蛋白1和融合蛋白2在给药2h后均表现出不同程度的溶栓效果；与不加PAI-1的血栓模型相比，三种溶栓剂在PAI-1血栓模型中具有更高的溶栓率，表明添加PAI-1后更有利于血栓的形成，模型与人体血栓环境更一致。与TNK-tPA给药组相比较，在不同浓度的PAI-1的血栓模型中融合蛋白1和融合蛋白2均表现出更优的溶栓效果，溶栓率显著高于TNK-tPA。

表5不同溶栓剂对添加不同浓度PAI-1人源血浆血栓溶栓率的影响

注：与相同终浓度TNK比较：

实施例9.融合蛋白体外溶栓动力学试验

根据实施例9中的试验结果，血浆中PAI-1的最适浓度为200～400nmol/L，因此确定PAI-1终浓度为300nmol/L作为血栓模型的添加物。本次试验采用4例混合人源血浆进行试验，每个给药组设置3次重复(n＝3)。考察不同浓度(10、30、100、300nmol/L)的溶栓剂对血栓的溶栓作用的动力学过程，实验结果如下表6所示。

试验结果表明，不同浓度的三种溶栓剂融合蛋白1、融合蛋白2和TNK-tPA在体外具有相似的溶栓过程，均达到了相似的溶栓终点；与TNK-tPA相比，10nM的融合蛋白2在给药2h后具有更高的溶栓率。

表6不同浓度的溶栓剂在不同的给药时间的对体外血栓模型的溶栓率。

注：与相同终浓度TNK比较：

实施例10.融合蛋白纤维蛋白原消耗测定

本试验采用体外混合人源血浆进行试验，观察TNK-tPA、融合蛋白1、融合蛋白2在添加PAI-1反应体系的溶栓作用及纤维蛋白原消耗率。试验设置TNK-tPA、融合蛋白1、融合蛋白2的终浓度分别为：100nmol/L和300nmol/L，PAI-1终浓度为：300nmol/L。各给药组反应3h后，将血栓从96孔板取出，按照纤维蛋白原检测试剂盒说明测定各给药组的血栓中纤维蛋白原浓度，并计算消耗率(Fibrinogen consumption rate，FCR)和单位纤维蛋白原消耗率(FCR per thrombolysis rate，FPTR)，计算方法如公式2和公式3所示。

公式2：FCR(％)＝(模型组纤维蛋白原含量-药物组纤维蛋白原含量)/模型组纤维蛋白原含量×100％公式3：FPTR(％)＝FCR/TR(注：TR为溶栓率)

各给药组溶栓3h后，各反应体系中纤维蛋白原含量以及单位纤维蛋白原消耗率测定及计算结果如表7和附图6所示。结果表明，与模型对照组相比，不同给药浓度下的三种溶栓剂TNK-tPA、融合蛋白1、融合蛋白2给药3h后，各体系中的纤维蛋白原的含量均显著降低(P<0.05～0.01)，表明各给药组溶栓过程中均有不同程度的纤维蛋白原的消耗。与相同终浓度的TNK-tPA比较，融合蛋白1及融合蛋白2的纤维蛋白原消耗率(P<0.05～0.01)均显著降低，单位纤维蛋白原消耗效率下降25％～50％，表明融合蛋白1和融合蛋白2对体外人血栓模型的纤维蛋白原的消耗均显著低于TNK-tPA。由于纤维蛋白原消耗情况是临床溶栓过程中与出血风险密切相关的参数，以上结果表明融合蛋白1和融合蛋白2具有更低的出血风险，更高的安全性。

表7不同溶栓剂对人源血浆血栓溶栓后试验系统单位溶栓率条件下纤维蛋白原消耗率的影响(Mean±SEM，n＝3)

实施例11.融合蛋白体内药效学研究及出血风险评估

选用健康雄性SD大鼠，体重240～260g，异氟烷气体麻醉后，仰卧位固定于手术台上，颈正中线切开皮肤，分离皮下筋膜，游离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。剥离与ICA伴行的迷走神经，至鼓骨下缘可见ICA颅外唯一分支翼额动脉，结扎该动脉。在颈动脉分叉远端7～10mm处用6/0丝线将ECA双线结扎并切断，留取近心端线头下拉与ICA成一直线。用微动脉夹夹闭ICA及CCA，用丝线在ECA起始处打一松结，在ECA上距颈动脉分叉3mm处剪一小口，将PE50导管(内径0.58mm,外径0.96mm)插入ECA内，将丝线结扎紧，去掉ICA上的微动脉夹，在该导管颅外端引入栓子。切取长度为5mm栓子，吸入特制的PE50管末端中，用0.4mL生理盐水将血栓推入颅内，小心抽出插管，结扎ECA。另设10只大鼠作为假手术组，只分离皮下筋膜。本研究设置假手术组、模型对照组、融合蛋白1和融合蛋白2设置高(6mg/kg)和低(3mg/kg)两个剂量组、阳性对照药替奈普酶TNK-tPA设置3、6mg/kg组，每组10只动物。按照各供试品推荐的给药方法进行单次静脉给药。

各给药组分别静脉注射相应药物，注射体积2mL/kg，假手术及模型对照组注射等体积生理盐水。

通过大鼠脑栓塞模型对融合蛋白1、融合蛋白2和TNK-tPA进行了体内药效学研究，分别设置了高(6mg/kg)、低(3mg/kg)两个给药剂量，给药方式均为尾静脉给药，给药6h后对各给药组大鼠的脑梗死面积和出血情况进行分析和比较，结果如表8和表9所示。结果表明，与模型组相比，融合蛋白1、融合蛋白2和TNK-tPA高低两个剂量组对模型动物均有效，脑梗死面积均小于模型组；融合蛋白1低剂量组给药后的大鼠脑梗死面积在所有实验组中最小。融合蛋白1和融合蛋白2的出血风险均低于TNK-tPA。

表8大鼠脑梗塞模型给药后脑梗死面积分析结果

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表9大鼠脑梗塞模型给药后出血情况统计及评分结果

实施例12.融合蛋白的药代动力学(PK)研究

取健康SD颈静脉插管大鼠，每组6只，雌雄各半，分别通过单次尾静脉注射给以50nmol/kg的TNK-tPA、融合蛋白1、融合蛋白2，每组动物给药后0、2min、5min、10min、20min、40min、60min、120min、180min、240min、360min通过颈静脉插管取血，分离血浆后，对血浆中的药物通过ELISA检测试剂盒进行定量分析，并通过药代动力学分析软件DAS 3.0进行分析，药物-时间曲线和主要动力学参数计算结果如附图7和表10所示。

结果表明融合蛋白1和融合蛋白2分布相半衰期t

综上所述，与TNK-tPA相比，融合蛋白1半衰期与TNK-tPA相当，融合蛋白2优于TNK-tPA。另外，融合蛋白1和融合蛋白2在分布项清除速率均高于TNK-tPA，表明给药后融合蛋白1和融合蛋白2能够在血液中快速分布，迅速到达血栓部位，这对于其发挥快速溶栓作用是十分有利的；在消除项融合蛋白2有较低的清除速率，这对于其持续发挥溶栓作用具有重要作用。

表10本发明所述融合蛋白药代动力学(PK)参数计算结果

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。