兴安独活中香豆素类化合物的快速定性定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种兴安独活中多种香豆素类化合物的检测方法。

背景技术

兴安独活(Heracleum dissectum Ledeb.)为伞形科、独活属多年生草本植物，俗称老山芹。其幼嫩茎叶可食用，是深受国内外尤其东北大兴安岭地区人们喜食的山野菜；并且兴安独活作为一种民间草药，可用于降“三高”、祛风除湿和止痛等，作为东北林区特色食药用植物资源具有重要开发利用价值。香豆素类化合物是兴安独活中重要的生物活性物质，适量食用或药用具有一定保健功能，但过量食用或药用存在中毒风险。对兴安独活食药用产品的品质检测及食药用安全性分析、或开展兴安独活香豆素类化合物的相关研究工作，都需要对兴安独活中香豆素类化合物进行定性或定量检测分析。

兴安独活中含有7-羟基香豆素、东莨菪内脂、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内脂、欧前胡素、异补骨脂素、异茴芹内脂、香豆素等多种香豆素类化合物，并且不同植物器官和发育时期兴安独活中香豆素类化合物的种类、含量存在较大差异。目前国内外缺乏能同时对兴安独活中这些香豆素类化合物进行快速定性、定量的检测方法，影响了兴安独活及其加工产品中香豆素类化合物的分析检测。

发明内容

本发明的目的是为了现有香豆素类化合物检测方法难于同时定性和定量检测兴安独活中香豆素类化合物的技术问题，提供了一种兴安独活中香豆素类化合物的快速定性定量检测方法。

兴安独活中香豆素类化合物的快速定性定量检测方法如下：

一、兴安独活中香豆素类化合物的提取：

将干燥粉碎或新鲜破碎后的兴安独活样品用体积分数为50％～100％的甲醇水溶液提取，兴安独活样品与甲醇水溶液的比例为1g:(15～25)mL，在28℃～38℃震荡或超声提取20～40min，以8500～11000rpm的离心速度离心，收集上清液，离心后沉淀与甲醇水溶液按照1g:(15～25)mL的比例，在28℃～38℃震荡或超声提取20～40min，以8500～11000rpm的离心速度离心并收集上清液，采用震荡或超声提取2～4次，合并上清液，过滤上清液并离心抽真空浓缩成固体，得到提取物；

二、兴安独活中香豆素类化合物的纯化：

分别用1～3倍柱体积的甲醇和去离子水处理HC-C18 SPE小柱，HC-C18 SPE小柱干燥后备用；

将步骤一得到的提取物溶解于体积分数为50％～100％的甲醇水溶液，得到提取物溶液，取提取物溶液过HC-C18 SPE柱，提取物溶液中香豆素类化合物总量不超过纯化柱填料量5％，过柱10～15min后用体积分数80％的甲醇水溶液洗脱HC-C18 SPE柱，并收集洗脱液，将洗脱液真空离心浓缩，再用体积分数50％～100％甲醇溶液溶解，得到兴安独活香豆素类化合物提取物溶液；

三、兴安独活中香豆素类化合物的检测：

利用配备光电二级阵列管作为液相检测器的高效液相系统进行高效液相色谱和紫外光谱检测，色谱柱为以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱，样品进样量为10～20μL，流动相A为甲醇，流动相B为水；

流动相梯度洗脱程序:

0min，40％～60％A；5min，50～70％A；25min，70～90％A；30min，80～100％A；流速为0.8～1mL/min，色谱柱温度为20～25℃，压力为100～180bar，定量检测波长为250～320nm；紫外光谱检测波长为210～400nm；洗脱过程中的任意时刻流动相A与流动相B的体积百分数之和为100％；流动相流速为：0.8～1.2mL/min；

对不同浓度的7-羟基香豆素、东莨菪内脂、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内脂、欧前胡素、异补骨脂素、异茴芹内脂、香豆素标准品溶液和兴安独活香豆素类化合物提取物溶液进行检测分析；

四、检测数据分析与计算：

(1)兴安独活中香豆素类化合物的定性分析

通过标准品高效液相色谱保留时间和紫外光谱图确定兴安独活样品中香豆素类化合物的种类；

(2)兴安独活样品中香豆素类化合物的定量计算

测定各种标准品的保留时间及标准品不同浓度对应的峰面积，并分别绘制各标准品浓度与峰面积之间的标准曲线、测定样品中不同保留时间香豆素类化合物的峰面积，根据标准曲线计算样品浓度，根据样品浓度计算兴安独活样品中香豆素类化合物的含量，完成定量分析；

所述香豆素类化合物为7-羟基香豆素、东莨菪内脂、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内脂、欧前胡素、异补骨脂素、异茴芹内脂或香豆素。

步骤一所述超声提取的超声频率为30KHz～50KHz。

步骤三中所述甲醇为光谱纯。

步骤三中所述以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱填料为Hypersil BDSC18，尺寸为4.6mm×250mm。

本方法可在12min内完成兴安独活中9种香豆素类化合物的定性、定量检测分析，为兴安独活中多种香豆素类化合物的检测分析提供了有效方法。

本发明解决了现有方法难于同时定性和定量检测兴安独活中7-羟基香豆素、东莨菪内脂、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内脂、欧前胡素、异补骨脂素、异茴芹内脂、香豆素等多种香豆素类化合物的问题。本发明内容包括兴安独活中香豆素类化合物的提取、纯化、色谱及光谱检测以及数据分析与计算。该方法对检测设备要求较低，易于实现和操作、并且用时短(小于12min)、检测线性范围宽(0.122mg/L～500mg/L)，灵敏度较高(检出限小于0.17mg/L、定量限小于0.2mg/L)，重现性好(保留时间日内和日间相对标椎偏差小于0.004％，峰面积的日内和日间相对标椎偏差小于0.026％)、准确性较高(加标回收率均值97％～125％，加标回收率相对标椎偏差小于4.6％)。

附图说明

图1是本发明检测数据分析比对中涉及的东莨菪内脂紫外光谱；

图2是本发明检测数据分析比对中涉及的7-羟基香豆素紫外光谱；

图3是本发明检测数据分析比对中涉及的香豆素紫外光谱；

图4是本发明检测数据分析比对中涉及的花椒毒素紫外光谱；

图5是本发明检测数据分析比对中涉及的补骨脂素紫外光谱；

图6是本发明检测数据分析比对中涉及的异补骨脂素紫外光谱；

图7是本发明检测数据分析比对中涉及的异茴芹内脂紫外光谱；

图8是本发明检测数据分析比对中涉及的佛手柑内脂紫外光谱；

图9是本发明检测数据分析比对中涉及的欧前胡素紫外光谱；

图10是实施例1中香豆素类化合物标准品与兴安独活香豆素类化合物提取物样品的液相色谱对比图；

图11是实施例1中花椒毒素与兴安独活香豆素类化合物提取物中1号峰物质的紫外光谱；

图12是实施例1中异茴芹内脂和兴安独活香豆素类化合物提取物中2号峰物质的紫外光谱；

图13是实施例1中佛手柑内脂与兴安独活香豆素类化合物提取物中3号峰物质的紫外光谱；

图14是实施例1中欧前胡素与兴安独活香豆素类化合物提取物中4号峰物质的紫外光谱；

图15是实施例1中花椒毒素定量分析的标准曲线；

图16是实施例1中佛手柑内脂定量分析的标准曲线；

图17是实施例1中和欧前胡素定量分析的标准曲线。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式兴安独活中香豆素类化合物的快速定性定量检测方法如下：

一、兴安独活中香豆素类化合物的提取：

将干燥粉碎或新鲜破碎后的兴安独活样品用体积分数为50％～100％的甲醇水溶液提取，兴安独活样品与甲醇水溶液的比例为1g:(15～25)mL，在28℃～38℃震荡或超声提取20～40min，以8500～11000rpm的离心速度离心，收集上清液，离心后沉淀与甲醇水溶液按照1g:(15～25)mL的比例，在28℃～38℃震荡或超声提取20～40min，以8500～11000rpm的离心速度离心并收集上清液，采用震荡或超声提取2～4次，合并上清液，过滤上清液并离心抽真空浓缩成固体，得到提取物；

二、兴安独活中香豆素类化合物的纯化：

分别用1～3倍柱体积的甲醇和去离子水处理HC-C18 SPE小柱，HC-C18 SPE小柱干燥后备用；

将步骤一得到的提取物溶解于体积分数为50％～100％的甲醇水溶液，得到提取物溶液，取提取物溶液过HC-C18 SPE柱，提取物溶液中香豆素类化合物总量不超过纯化柱填料量5％，过柱10～15min后用体积分数80％的甲醇水溶液洗脱HC-C18 SPE柱，并收集洗脱液，将洗脱液真空离心浓缩，再用体积分数50％～100％甲醇溶液溶解，得到兴安独活香豆素类化合物提取物溶液；

三、兴安独活中香豆素类化合物的检测：

利用配备光电二级阵列管作为液相检测器的高效液相系统进行高效液相色谱和紫外光谱检测，色谱柱为以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱，样品进样量为10～20μL，流动相A为甲醇，流动相B为水；

流动相梯度洗脱程序:

0min，40％～60％A；5min，50～70％A；25min，70～90％A；30min，80～100％A；流速为0.8～1mL/min，色谱柱温度为20～25℃，压力为100～180bar，定量检测波长为250～320nm；紫外光谱检测波长为210～400nm；洗脱过程中的任意时刻流动相A与流动相B的体积百分数之和为100％；流动相流速为：0.8～1.2mL/min；

对不同浓度的7-羟基香豆素、东莨菪内脂、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内脂、欧前胡素、异补骨脂素、异茴芹内脂、香豆素标准品溶液和兴安独活香豆素类化合物提取物溶液进行检测分析；

四、检测数据分析与计算：

(1)兴安独活中香豆素类化合物的定性分析

通过标准品高效液相色谱保留时间和紫外光谱图确定兴安独活样品中香豆素类化合物的种类；

(2)兴安独活样品中香豆素类化合物的定量计算

测定各种标准品的保留时间及标准品不同浓度对应的峰面积，并分别绘制各标准品浓度与峰面积之间的标准曲线、测定样品中不同保留时间香豆素类化合物的峰面积，根据标准曲线计算样品浓度，根据样品浓度计算兴安独活样品中香豆素类化合物的含量，完成定量分析；

所述香豆素类化合物为7-羟基香豆素、东莨菪内脂、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内脂、欧前胡素、异补骨脂素、异茴芹内脂或香豆素。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述超声提取的超声频率为30KHz～50KHz。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤三中所述甲醇为光谱纯。其他与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤三中所述的定量检测波长为254nm。其他与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤三中所述的定量检测波长为280nm。其他与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中所述的定量检测波长为320nm。其他与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤三中所述以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱填料为Hypersil BDS C18，尺寸为4.6mm×250mm。其他与具体实施方式一至六之一相同。

采用下述实施例验证本发明效果：

实施例1

兴安独活中香豆素类化合物的快速定性定量检测方法如下：

一、兴安独活中香豆素类化合物的提取：

将1g干燥的兴安独活样品粉置于50ml离心管中，用15mL用体积分数为50％的甲醇水溶液提取，在28℃震荡提取20min，以11000rpm的离心速度离心，收集上清液，离心后沉淀与甲醇水溶液按照1g:15mL的比例，在28℃震荡提取20min，以11000rpm的离心速度离心，并收集上清液，采用震荡提取离心后沉淀3次，合并4次上清液，离心抽真空浓缩成固体，得到提取物；

二、兴安独活中香豆素类化合物的纯化：

分别用1～3倍柱体积的甲醇和去离子水处理HC-C18 SPE小柱，HC-C18 SPE小柱干燥后备用；

将步骤一得到的提取物溶解于体积分数为50％的甲醇水溶液，得到提取物溶液，取提取物溶液过HC-C18 SPE柱，提取物溶液中香豆素类化合物总量不超过纯化柱填料量5％，过柱10min后用体积分数80％的甲醇水溶液洗脱HC-C18 SPE柱，并收集洗脱液，将洗脱液真空离心浓缩，再用体积分数50％甲醇溶液溶解，得到兴安独活香豆素类化合物提取物溶液；

三、兴安独活中香豆素类化合物的检测：

利用配备光电二级阵列管作为液相检测器(DAD)的高效液相系统进行高效液相色谱和紫外光谱检测，色谱柱为以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱，样品进样量为20μL，流动相A为甲醇，流动相B为水；

流动相梯度洗脱程序:

0min，40％～60％A；5min，50～70％A；25min，70～90％A；30min，80～100％A；流速为1/min，色谱柱温度为23℃，压力为100～180bar，定量检测波长为320nm；紫外光谱检测波长为210～400nm；洗脱过程中的任意时刻流动相A与流动相B的体积百分数之和为100％；流动相流速为：1mL/min；

对不同浓度的7-羟基香豆素、东莨菪内脂、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内脂、欧前胡素、异补骨脂素、异茴芹内脂、香豆素标准品溶液和兴安独活香豆素类化合物提取物溶液进行检测分析；

步骤三中所述甲醇为光谱纯。

步骤三中所述以十八烷基键合硅胶为填充剂的C18色谱柱填料为Hypersil BDSC18，尺寸为4.6mm×250mm。

四、检测数据分析与计算：

(1)检测方法性能分析

基于上述优选检测方法和条件，对检测方法的线性范围、重现性和准确性等性能进行评价，检测分析结果如表1所示。

表1香豆素类化合物检测的线性范围检出限、定量限、相对标准偏差和加标回收率

结果表明该方法对上述9种香豆素类化合物检测分析的的线性范围最低为0.122mg/L、最高为500mg/L；线性良好R

(2)兴安独活中香豆素类化合物的定性分析

通过标准品高效液相色谱保留时间和紫外光谱图确定兴安独活样品中香豆素类化合物的种类；

将兴安独活中香豆素类化合物提取物的高效液相色谱保留时间和紫外光谱图分别与标准品的效液相色谱保留时间和紫外光谱图对比分析，确定兴安独活检测样品中香豆素类化合物的种类。香豆素类化合物标准品和兴安独活香豆素类化合物提取物样品的高效液相色谱如图10所示。将标准品和样品的高效液相色谱保留时间对比，如样品中1、2、3和4号峰物质的保留时间分别为6.19、7.11、7.57和11.23，分别与标准品花椒毒素、异茴芹内脂、佛手柑内脂和欧前胡素的保留时间6.21、7.13、7.59和11.26接近。

进一步将1、2、3和4号峰物质的紫外光谱图与标准品的紫外光谱进行对比，结果如图11、图12、图13和图14所示。紫外光谱图对比发现2号峰物质与标准品异茴芹内脂紫外光谱图不相符合，因此虽然该2号峰物质与异茴芹内脂高效液相色谱保留时间接近，但经紫外光谱对比分析2号峰物质不是异茴芹内脂，其余1、3、4号峰物质紫外光谱图与花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素相符，紫外光谱图的变化趋势和最大、最小吸收波长相同，因此通过定性分析表明该兴安独活样品中含有花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素。

(3)兴安独活样品中香豆素类化合物的定量计算

测定各种标准品的保留时间及标准品不同浓度对应的峰面积，并分别绘制各标准品浓度与峰面积之间的标准曲线、测定样品中不同保留时间香豆素类化合物的峰面积，根据标准曲线计算样品浓度，根据样品浓度计算兴安独活样品中香豆素类化合物的含量，完成定量分析；

所述香豆素类化合物为7-羟基香豆素、东莨菪内脂、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内脂、欧前胡素、异补骨脂素、异茴芹内脂或香豆素。

标曲拟合：基于上述兴安独活中香豆素类化合物的鉴定结果，进一步定量计算兴安独活香豆素类化合物提取物中花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素的含量。测定不同浓度花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素标准品的液相色谱峰面积如表2所示，分别拟合花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素线性回归方程分别如图15、图16、图17所示。

表2不同浓度花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素标准品的液相色谱峰面积

样品计算：液相色谱检测兴安独活香豆素类化合物提取物样品中花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素的峰面积如表3所示。根据线性回归方程，计算的检测样品溶液中花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素的浓度平均值分别为0.003325mg/mL、0.03707mg/mL和0.1188mg/mL，计算公式和结果如表3所示。

表3兴安独活香豆素类化合物提取物样品中花椒毒素、佛手柑内脂和欧前胡素的峰面积与浓度计算

根据样品溶液中香豆素类化合物的浓度，按下列各公式计算兴安独活提取物中香豆素类化合物的含量。

再按下列各式计算兴安独活样品中香豆素类化合物的含量：

计算结果如表4所示。