一种低致敏性雄蜂蛹冻干粉及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于蜂产品加工技术领域，具体涉及一种低致敏性雄蜂蛹冻干粉及其制备方法和应用。

背景技术

雄蜂蛹是蜂王在雄蜂房产的未受精卵孵化成蜜蜂雄性幼虫，封盖后到羽化出房前这一变态时期的营养体，以吸食蜂王浆、蜂蜜和花粉等发育而成。分析表明雄蜂蛹中含蛋白质20.3％，碳水化合物20.0％，水分9.0％，灰分9.0％，脂肪7.5％，微量元素0.5％及其他矿物营养成分。为此，雄蜂蛹是整个蜂产品中营养最丰富的，而且含有大量的维生素、活性酶及人体所必须的微量元素，是一种附加值比较高，且具有食用价值和医疗效果的天然营养保健食品，必将成为后疫情时代国内外营养保健食品市场追捧的焦点，目前市场上先后出现了雄蜂蛹罐头、雄蜂蛹饼干、雄蜂蛹胶囊、雄蜂蛹酒等营养保健食品。

近年来，国内蜂业逐渐兴起培育和养殖雄蜂蛹，雄蜂蛹的产量逐年在增加，已经成为国家优先扶持发展的农业产业之一。虽然学术界对雄蜂蛹的生产方式、新鲜雄蜂蛹的保存和运输以及雄蜂蛹干粉的生产工艺研究得比较多，但是国内市场上深加工的雄蜂蛹产品还比较单一，人们对雄蜂蛹产品的消费也比较少，目前主要是将鲜蛹或加工成的雄蜂蛹冻干粉以廉价的形式直接出口，导致雄蜂蛹的附加值非常低。这主要与雄蜂蛹致敏性有关。因此开发低致敏水解雄蜂蛹冻干粉对于提高雄蜂蛹产品的质量，提升在国际市场上的竞争和出口创汇能力具有重要的现实意义。然而，这在国内尚属空白。

一般地，引起食物过敏的过敏原多数来源于食物中的蛋白质，实际上与过敏反应相关的仅为蛋白质表面的抗原决定簇。研究表明，雄蜂蛹致敏的主要原因是与雄蜂蛹富含高蛋白质(蛋白质含量高达20wt.％)有关，因为其中部分蛋白质的部分成分属于异种蛋白质，具有致敏性，一般人食用后不会发生不良影响，但过敏体质者食用易导致过敏反应，严重时还危及生命。然而，到目前为止还没有确定雄蜂蛹致敏蛋白质的种类。

综上所述，由于雄蜂蛹富含蛋白质、维生素、矿物元素，且含低脂肪等特点，具有食用价值和保健作用，必将成为后疫情时代人们理想的营养保健食品。然而，富含高蛋白质的雄蜂蛹中部分蛋白质属异种蛋白质，过敏体质者食用存在过敏的风险，既存在食品安全问题又降低了雄蜂蛹产品在市场上的竞争力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种低致敏性雄蜂蛹冻干粉及其制备方法和应用。本发明提供的低致敏性雄蜂蛹冻干粉的制备方法，工艺操作简单、绿色环保，制备得到的雄蜂蛹冻干粉水解度高，满足低致敏性要求，能够提升雄蜂蛹食品安全。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种低致敏性雄蜂蛹冻干粉的制备方法，包括以下步骤：将雄蜂蛹酶解后真空冷冻干燥，得所述雄蜂蛹冻干粉；

所述酶解所用的酶包括木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的复合酶。

优选的，所述复合酶的总重量占雄蜂蛹总重量的5～15wt.％。

优选的，所述木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为(1～4):(1～1.5)。

优选的，所述酶解的温度为20～35℃，酶解的时间为1～4h。

优选的，所述雄蜂蛹冻干粉的水分含量＜2.5％。

优选的，所述真空冷冻干燥的温度为-50～-30℃，真空度压力为15～100Pa，干燥时间为20～24h。

优选的，所述真空冷冻干燥前还包括研磨，所述研磨时冷却水的温度≤25℃。

优选的，所述雄蜂蛹为日龄20～22d的成熟蛹。

本发明提供了利用上述的方法制得的低致敏性雄蜂蛹冻干粉。

本发明还提供了上述的低致敏性雄蜂蛹冻干粉在制备含雄蜂蛹食品中的应用。

有益效果：本发明提供了一种低致敏性雄蜂蛹冻干粉的制备方法，提供一组高效的复合酶有效催化水解雄蜂蛹蛋白质，利用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶协同作用，直接催化雄蜂蛹蛋白质的水解，导致雄蜂蛹中蛋白质的三维结构破坏，降低致敏性，同时产生具有生理功能的活性肽。本发明利用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶协同作用，直接催化雄蜂蛹蛋白质的水解，得到的雄蜂蛹冻干粉蛋白质的水解度可达到48.3％，不仅仅具有低致敏性，而且易消化、易吸收和生物效价高。本发明提供的方法操作简单、绿色环保，不引入任何外来的化学制剂，不仅能降低雄蜂蛹作为食品的安全风险，而且还能提高雄蜂蛹的附加值，具有重要的现实意义和社会价值。同时，本发明利用酶催化雄蜂蛹蛋白质的水解，这样制得的水解雄蜂蛹冻干粉富含生理功能的小分子活性肽，甚至是氨基酸。本发明不需要额外的麦芽糊精促使雄蜂蛹冻干粉的粉化，避免结块的问题，进一步提升了雄蜂蛹冻干粉的品质。

本发明提供了利用上述的方法制得的低致敏性雄蜂蛹冻干粉，营养丰富，含有大量的维生素、活性酶及人体所必须的微量元素，而且雄蜂蛹蛋白质水解度高达48.3％，相对于国外市场销售的水解雄蜂蛹冻干粉的水解度(一般为41～43％)高得多，这填补了国内水解雄蜂蛹冻干粉的空白，对于提高国内雄蜂蛹的经济价值具有重要的意义，本发明提供的方法制备得到的低致敏性雄蜂蛹冻干粉是一种附加值比较高，且具有食用价值和医疗效果的天然营养保健食品。

本发明还提供了上述的低致敏性雄蜂蛹冻干粉在制备含雄蜂蛹食品中的应用。本发明的方法制备得到的低致敏性雄蜂蛹冻干粉对于提高雄蜂蛹产品的质量，提升在国际市场上的竞争和出口创汇能力具有重要的现实意义。

附图说明

图1为不同质量比的木瓜蛋白酶与胃蛋白酶对雄蜂蛹蛋白质水解的水解度影响图；

图2为不同酶对雄蜂蛹蛋白质水解后产物的电泳图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种低致敏性雄蜂蛹冻干粉的制备方法，包括以下步骤：将雄蜂蛹酶解后真空冷冻干燥，得所述雄蜂蛹冻干粉；

所述酶解所用的酶包括木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的复合酶。

如无特殊说明，本发明对所述制备原料没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。

本发明优选先采收雄蜂蛹。本发明所述雄蜂蛹优选为日龄20～22d的成熟蛹，更优选为日龄21d的成熟蛹，成熟蛹体型饱满，容易从封盖的雄蜂蛹脾(蜜蜂巢脾)中取出雄蜂蛹，同时成熟雄蜂蛹的营养成分比较饱满。

本发明优选将采收的雄蜂蛹捣碎，捣碎前优选加入抗坏血酸，所述抗坏血酸的添加量优选占雄蜂蛹重量的0.5～2wt.％，更优选为0.8～1.5wt.％，最优选为1wt.％，添加抗坏血酸能够避免雄蜂蛹中络氨酸酶的氧化而导致雄蜂蛹变黑。本发明所述雄蜂蛹为蜂王在雄蜂房产的未受精卵，经孵化成的幼虫，富含蛋白质等营养成分和水分，捣碎后形成雄蜂蛹浆，将雄蜂蛹组织捣碎后利于酶解反应。本发明所述捣碎后的雄蜂蛹浆的pH优选为6～7，更优选为6.5，即后续使用酶催化蛋白质水解时pH维持在6.5左右，无需使用蛋白质水解的缓冲溶液，能够保证在制备雄蜂蛹冻干粉过程中不引入其它杂质。

本发明优选将捣碎后的雄蜂蛹进行酶解。本发明所述酶解所用的酶包括由木瓜蛋白酶和胃蛋白酶组成的复合酶。本发明对所述木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的来源没有特殊限定，实施例中均购自北京奥博星生物技术有限责任公司，所述木瓜蛋白酶的酶活力为800U，所述胃蛋白酶的酶活力≥10000U。本发明所述复合酶的总重量优选占雄蜂蛹总重量的5～15wt.％，进一步优选为8～10wt.％，更优选为8wt.％。本发明所述木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的质量比优选为(1～4):(1～1.5)，进一优选为(2～3):(1～1.2)，更优选为2:1。本发明所述酶解的温度优选为20～35℃，进一步优选为25～30℃，更优选为28℃；酶解的时间优选为1～4h，进一步优选为2～3h，更优选为2.5h。本发明所述复合酶不仅可以使蛋白质抗原决定簇部位的片断水解，可以通过改变抗原决定簇的三级结构使之失去原有的活性而降低其致敏性，也可通过断裂酰胺键降低过敏原的分子量来减弱其致敏性，显著降低其抗原性，而且可产生具有调节免疫功能，降血压等其他生理功能的活性肽。

本发明优选将酶解后的雄蜂蛹进行研磨，所述研磨时冷却水的温度优选≤25℃，进一步优选为10～23℃，更优选为20℃，控制温度能够避免研磨的过程中温度过于提高导致雄蜂蛹变质。本发明优选将冷却水的压力控制在0.1～0.2Mpa，进一步优选为0.15Mpa。本发明所述研磨时优选使用胶体磨，用胶体磨一方面均质研磨雄蜂蛹，一方面促进木瓜蛋白酶和胃蛋白酶进一步充分催化水解雄蜂蛹中的蛋白质，从而得到含有部分小分子肽的雄蜂蛹膏状物。

本发明优选将研磨后的雄蜂蛹进行与冷冻处理，所述预冷冻的温度优选为-40～20℃，进一步优选为-35～-25℃，更优选为-30℃；所述预冷冻的时间优选为8～16h，进一步优选为10～14h，更优选为12h。

本发明优选将预冷冻后的雄蜂蛹进行真空冷冻干燥。本发明所述真空冷冻干燥的温度优选为-50～-30℃，进一步优选为-45～-35℃，更优选为-40℃；所述真空冷冻的真空度压力优选为15～100Pa，进一步优选为30～80Pa，更优选为50Pa；干燥时间优选为20～24h，进一步优选为21～23h，更优选为22h；真空条件有利于样品中的水蒸气从样品中除去，同时避免雄蜂蛹氧化变质。本发明优选将冻干后的雄蜂蛹粉碎，粉碎时温度控制在25℃以下，优选使用研磨粉碎机粉碎，所述粉碎后的冻干粉粒径优选不大于100目。本发明所述雄蜂蛹冻干粉的水分含量优选＜2.5％。

本发明提供了利用上述的方法制得的低致敏性雄蜂蛹冻干粉，营养丰富，含有大量的维生素、活性酶及人体所必须的微量元素，而且具有低致敏性，是一种附加值比较高，且具有食用价值和医疗效果的天然营养保健食品。

本发明还提供了上述的低致敏性雄蜂蛹冻干粉在制备含雄蜂蛹食品中的应用。本发明所述含雄蜂蛹食品包括：雄蜂蛹罐头、雄蜂蛹饼干、雄蜂蛹胶囊和雄蜂蛹酒。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种低致敏性雄蜂蛹冻干粉及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)采收日龄在21d的雄蜂蛹，在新鲜的雄蜂蛹中加入1wt.％抗坏血酸，室温下在超净工作台里的反应器中用木棒捣碎，捣碎后的雄蜂蛹pH≈6.5；

(2)在捣碎后的雄蜂蛹浆中加入木瓜蛋白酶和胃蛋白酶复配的复合酶，其中，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶按照1:1(w/w)的质量比例混合，复合酶的总重量占雄蜂蛹总重量的8wt.％，室温下均匀搅拌2h；

(3)将处理后的雄蜂蛹浆转入到胶体磨的漏斗中，调整胶体磨参数，冷却水的压力控制在0.15Mpa左右，水温控制在≤25℃，用胶体磨进行均质处理，得到膏状物；

(4)将得到的膏状物放入PET透明的塑料器皿中，在零下30℃时进行预冷冻12h后，再放入到冷冻干燥机中，快速冷冻到零下40℃，启动真空泵，减压至真空度范围为50Pa，干燥时间为22h，将样品中的水蒸气从样品中除去，得到雄蜂蛹干燥样品中水含量在2.5％以下；

(5)将雄蜂蛹干燥品在超净工作台经过研磨粉碎机粉碎、混均，粉碎温度控制在25℃以下，得到雄蜂蛹冻干粉，粉碎的冻干粉粒径不大于100目。

实施例2

按照实施例1的方式进行，区别在于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶质量比替换为2:1。

实施例3

按照实施例1的方式进行，区别在于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶质量比替换为3:1。

实施例4

按照实施例1的方式进行，区别在于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶质量比替换为4:1。

对比例1

按照实施例1的方式进行，区别在于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶质量比替换为1:2。

对比例2

按照实施例1的方式进行，区别在于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶质量比替换为1:4。

对比例3

按照实施例1的方式进行，区别在于只添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的总重量占雄蜂蛹总重量的8％。

对比例4

按照实施例1的方式进行，区别在于只添加木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的总重量占雄蜂蛹总重量的8％。

试验例1

把实施例1～4和对比例1～4制备得到的雄蜂蛹冻干粉按照蛋白质抽提法提取蛋白质。分别对抽提法提出的蛋白质进行凯氏定氮，确定蛋白质的总氮含量，用氢氧化钠滴定的方法确定蛋白质的水解度：

式中c是氢氧化钠溶液浓度，V是蛋白质水解后的溶液消耗氢氧化钠溶液的体积，V

不同组成的酶蛋白水解雄蜂蛹蛋白质的水解度结果显示在图1和表1中。

表1不同质量比的木瓜蛋白酶与胃蛋白酶对雄蜂蛹蛋白质水解的水解度影响

从图1和表1可以明显地看出，实施例制得的的雄蜂蛹蛋白质水解度达到约30％，可以认为是低致敏性的雄蜂蛹，且当木瓜蛋白酶与胃蛋白酶质量比为2:1时，雄蜂蛹蛋白质水解度最高的，可以达到48.3％。而对比例制得的的雄蜂蛹蛋白质水解度仅为实施例的一半，对比例的制备方法水解能力较差。

试验例2

为了进一步定性地确定雄蜂蛹蛋白质水解情况，对不同酶条件下催化雄蜂蛹蛋白质水解后提取的蛋白质溶液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验，如图2所示为不同条件下雄蜂蛹蛋白质水解后的SDS-PAGE电泳图谱。

从图2可以看出雄蜂蛹蛋白质分子量范围在116kda～14.4kda，单独使用木瓜蛋白酶(对比例4)或胃蛋白酶(对比例3)催化水解雄蜂蛹蛋白质，蛋白质水解量比较少，其图谱表现出非常明显的条形谱。但是当使用质量比为2:1(实施例2)的木瓜蛋白酶/胃蛋白酶时，雄蜂蛹蛋白质水解量比较完全，大部分条形图谱变得非常模糊，这与图1和表1中水解度测试结果一致。

由此可见，本发明利用木瓜蛋白酶与胃蛋白酶复配后，在协同催化作用下将雄蜂蛹蛋白质水解，且雄蜂蛹蛋白质水解度高达48.3％，方法操作简单、绿色环保，不引入任何外来的化学制剂，保证了雄蜂蛹冻干粉的食品安全性和制备经济性，值得大规模推广应用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。