提高烟草抗旱性的基因NtBRL3、蛋白质及在烟草中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及提高烟草抗旱性的基因NtBRL3、蛋白质及在烟草中的应用。

背景技术

烟草(Nicotiana tabacum L.)是一种嗜好性经济作物，在国民经济中具有十分重要的作用。烟草质量的好坏在一定程度上决定了销量的多少，所以提高烟草的质量势在必行。

干旱成为了全球最主要的自然灾害之一，干旱胁迫会对烟草的产量和品质造成不良的影响。尤其近几年由于全球变暖，其后急剧变化，各地水资源都较往年缺乏而出现旱情。干旱对烟草的生长发育带来了严重影响，导致产质量不同程度的降低，成为烟草生产上的一个重要影响因素。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种烟草抗旱性的基因及在烟草中的应用，以减少干旱对烟草的生长发育的影响的技术问题。

为实现上述目的，本申请提供了一种提高烟草抗旱性的基因NtBRL3，所述提高烟草抗旱性的基因NtBRL3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本申请提供了一种提高烟草抗旱性的蛋白质，所述蛋白质由权利要求1所述的基因NtBRL3编码形成，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本申请还提供了上述提高烟草抗旱性的基因NtBRL3在烟草中的应用。

根据本申请的实施方式，包括以下步骤：

通过XbaI和KpnI双酶切载体pSH737和所述基因NtBRL3，连接得到重组载体。

将所述重组载体导入至根癌农杆菌的感受态细胞，得到重组根癌农杆菌。

将烟草的无菌苗叶片通过所述重组根癌农杆菌介导叶盘转化，得到抗性烟草。

根据本申请的实施方式，所述载体pSH737包括启动子、抗性筛选基因、报告基因，所述启动子为35S，所述抗性筛选基因为NPTII，所述报告基因为GUS。

根据本申请的实施方式，所述将烟草的无菌苗叶片通过所述重组根癌农杆菌介导叶盘转化的步骤包括：

将所述重组根癌农杆菌培养至菌液OD600达到0.5，将所述菌液离心，重悬，得到重悬液。

将烟草无菌苗叶片切割成叶块，浸没于所述重悬液中8min，将浸没后的叶块培养成所述抗性烟草。

根据本申请的实施方式，所述将浸没后的叶块培养成所述抗性烟草的步骤包括：

将所述叶块吸干菌液后，接种于共生培养基中，暗培养2天后，接于筛选培养基中培养，2周继代一次，待抗性芽长到2cm左右时，将其切下转于生根培养基中，得到所述抗性烟草。

根据本申请的实施方式，所述共生培养基包括：4.432g/L的MS、1.00mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、30g/L的蔗糖以及7.5g/L的琼脂粉。

根据本申请的实施方式，所述筛选培养基包括：4.432g/L的MS、1.00mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、30g/L的蔗糖、7.5g/L的琼脂粉、100mg/L的特美汀以及100mg/L卡那霉素。

根据本申请的实施方式，所述生根培养基包括：2.216g/L的MS、20g/L的蔗糖、7.5g/L的琼脂粉、100mg/L的替门汀以及100mg/L的卡那霉素。

本发明的有益效果至少包括：

上述提高烟草抗旱性的基因NtBRL3能够结合油菜素内酯并启动油菜素内酯信号的传导，激活油菜素内酯信号下游基因的表达，进而提高烟草干旱抗性，该理论的依据是油菜素内酯具有稳定生物膜的作用，并能活化超氧化物歧化酶和过氧化物酶，消除活性氧对膜脂得破坏作用，维持植物正常代谢活动，从而提高抗逆性。经过验证，烟草的NtBRL3基因过表达与烟草干旱抗性具有正相关关系。采用遗传转化技术过表达NtBRL3基因，在干旱胁迫条件下，显著提高了烟草的抗旱性。所述NtBRL3可促进烟草的抗旱性以及通过转录组分析得到的与干旱相关的候选基因的应用，作为烟草开展基因工程与改良育种的重要候选基因，为未来研究BRL3基因的作用机理及提升烟草抗旱品质的应用提供一个技术储备。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为烟草的遗传转化；其中，(A)为被根癌农杆菌感染的烟草的共生培养；(B)为转移到筛选培养基中生长愈伤组织；(C)为切断约2厘米长的抗性芽以诱导生根；(D)为对干旱实验中使用的烟草进行PCR；(E)为移栽前转基因烟草的照片(上部为转基因，下部为野生)；(F)为烟草移植和存活；

图2为转基因烟草和野生型烟草在干旱处理下的表型鉴定；(A)干旱胁迫前表型情况；(B)干旱处理后表型情况；NtBRL3ox：转基因烟草；WT：野生型；

图3为干旱处理后转基因烟草和野生型烟草GST、POD、CAT、SOD、MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量测定结果；

图4为候选基因在野生型和转基因型的相对表达量图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

本申请提供了一种提高烟草抗旱性的基因NtBRL3，所述提高烟草抗旱性的基因NtBRL3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

目的基因的获得：拟南芥BRL3基因在TAIR(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)上的序列号：AT3G13380.1，通过BRL3基因的序列号找到拟南芥的CDS序列，得到的拟南芥BRL3基因的CDS序列通过TBtools软件转化成拟南芥BRL3基因的蛋白序列，利用最大似然法(ML)筛选鉴定出似然率接近的属于烟草的NtBRL3基因。将得到的烟草NtBRL3基因的CDS序列通过NCBI进行Blast分析确定对应的基因是寻找的目的基因(XM_016615644.1)。

该目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体为：

CCCCACCACACCCAAAAACCTATTATCACTCGCAAAACACCTGCAGCAGCAGCTTCTATATGTATGTACTGTATCTGTCAATTGTCATTCCAAATAGCAGCAAAATCTCCCCTTTCTTAACAAACTCAAAGACTGTGACTTGAATGAACAACAAGAATCAGGTTTTACAAGATTGTAAGATGGAGGGGCCGTATTTCCTTAAGTAGGGAAGGAAAGAATTTTTTTTTTTTCAGCAAAGATGAGCTACAAACTATTATCACCAAGTGGGGTGATGAAAGATGTTGTCTTTCTCATA

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GTTCTTACTTGTGAGATTCATAGGAGTTTATACTTCAGATTTTGCCTACTG

TAAATATTAGAACATGATGAAGATGTGAAATTGGTTTAGATTAATGCGC

GAATGAATTTTCCTATTTCTTGTCCCA

上述提高烟草抗旱性的基因NtBRL3能够结合油菜素内酯并启动油菜素内酯信号的传导，激活油菜素内酯信号下游基因的表达，进而提高烟草干旱抗性。经过验证，烟草的NtBRL3基因过表达与烟草干旱抗性具有正相关关系。采用遗传转化技术过表达NtBRL3基因，在干旱胁迫条件下，显著提高了烟草的抗旱性。所述NtBRL3可促进烟草的抗旱性以及通过转录组分析得到的与干旱相关的候选基因的应用，作为烟草开展基因工程与改良育种的重要候选基因，为未来研究BRL3基因的作用机理及提升烟草抗旱品质的应用提供一个技术储备。

本申请提供了一种提高烟草抗旱性的蛋白质，所述蛋白质由权利要求1所述的基因NtBRL3编码形成，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

具体如下所示：

MSYKLLSPSGVMKDVVFLIMFLSCCFVVVSNARKLAANDQVGSLIAFKKSSVEFDPNGFLNDWSFSSSSTPCTWNGISCSNGQVVELNLSTADLSGPLHLSHLMALPTLLRLHFTGNNFYGNLSSTADSCSFEFLDLSANNFSETLVLEPLLQS CDRIKYLNVSGNSIHGVVGLKFGPSLLQLDLSSNTISDVGILSYALSNCQNLNVLNISSNKLSGKLKSSLSSCKSLSVLDLSHNNFTGELNGLDFGTCQNLTVLNLSFNNLTSTEFPPTLANCLSLHTLDVGHNSIQTKIPGELLVKLKSLKRLVLAHNHFFEEIPSELGQTCSTLEELDLSGNQLTGELPSTFKLCSSLFSLNLGNNELSGDFLNTVISSLTSVRYLYLPFNNITGHVPRSLANCTKLEVLDLSSNVLTGNVPFEFCLAASASGFPLEKMLLAGNYLTGTVPAQLGLCRNLRKIDLSFNKLTGSIPLEIWTLPNLSELIMWANNLTGEIPQGICISGGNLQTLILNNNFLTGELPQSITNCTNLVWVSLSSNRLSGEIPHGIGNLANLAILQLGNNSLTGPIPQGLGTCRNLIWLDLNSNALTGSIPPELADQAGLVNPGIVSGKQFAFVRNEGGTECRGAGGLVEFEGIREKRLAIFPMVHSCPSTRIYSGTTVYTFTSNGSMIYLDLSYNALSGTIPENLGSMSFLQVLNLGHNNFTGTIPFNFGGLKIVGVLDLSHNSLQGFIPPSLGGLSFLSDLDVSNNNLSGAIPSGGQLTTFPASRYENNSGLCGVPLPPCGSGKGHRSSGIYNHKNKKPTTIGMVVGIMVSLVCIVLLIVALYRIKKTQKEEEKRDKYIESLPTSGSSSWKLSSVPEPLSINVATFEKPLRKLTFGHLLEATNGFSSESLIGSGGFGEVYKAQLRDGSTVAIKKLVHATSQGDREFMAEMETIGKIKHRNLVPLLGYCKIGEERLLVYEYMKWGSLESVLHEGEKGGMILDWAVRKKIAIGSARGLAFLHHSCIPHIIHRDMKSSNVLLDENFEARVSDFGMARLVNALDTHLSVSTLAGTPGYVPPEYYQSFRCTAKGDVYSYGVILLELLSGKRPIDPREFGEDNNLVGWAKQLHNAKRSHEILDSELITNLSGDAELYHYLKVAFECLDEKPYKRPTMIQVMTKFKELQADSESDILDGISLKGSILEESQEREP

本申请还提供了上述提高烟草抗旱性的基因NtBRL3在烟草中的应用。

根据本申请的实施方式，包括以下步骤：

通过XbaI和KpnI双酶切载体pSH737和所述基因NtBRL3，连接得到重组载体。

将所述重组载体导入至根癌农杆菌的感受态细胞，得到重组根癌农杆菌。

将烟草的无菌苗叶片通过所述重组根癌农杆菌介导叶盘转化，得到抗性烟草。

本发明中利用农杆菌介导法将NtBRL3关键基因通过根癌农杆菌转化至烟草中，经过组织培养获得转基因植株，获取得到T1代。其是在烟草中产生更强的抗旱性，可以进一步推进干旱在烟草遗传育种中应用。相比于传统育种技术育种周期长的问题，极大缩短育种时间。

根据本申请的实施方式，所述载体pSH737包括启动子、抗性筛选基因、报告基因，所述启动子为35S，所述抗性筛选基因为NPTII，所述报告基因为GUS。

根据本申请的实施方式，所述将烟草的无菌苗叶片通过所述重组根癌农杆菌介导叶盘转化的步骤包括：

将所述重组根癌农杆菌培养至菌液OD600达到0.5，将所述菌液离心，重悬，得到重悬液。

将烟草无菌苗叶片切割成叶块，浸没于所述重悬液中8min，将浸没后的叶块培养成所述抗性烟草。

根据本申请的实施方式，所述将浸没后的叶块培养成所述抗性烟草的步骤包括：

将所述叶块吸干菌液后，接种于共生培养基中，暗培养2天后，接于筛选培养基中培养，2周继代一次，待抗性芽长到2cm左右时，将其切下转于生根培养基中，得到所述抗性烟草。

根据本申请的实施方式，所述共生培养基包括：4.432g/L的MS(ms培养基)、1.00mg/L的6-BA(6-苄氨基嘌呤)、0.1mg/L的NAA(萘乙酸)、30g/L的蔗糖以及7.5g/L的琼脂粉。

根据本申请的实施方式，所述筛选培养基包括：4.432g/L的MS、1.00mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、30g/L的蔗糖、7.5g/L的琼脂粉、100mg/L的特美汀以及100mg/L卡那霉素。

根据本申请的实施方式，所述生根培养基包括：2.216g/L的MS、20g/L的蔗糖、7.5g/L的琼脂粉、100mg/L的替门汀以及100mg/L的卡那霉素。

以下结合具体实施例，对本申请的技术方案进行说明。

首先对相关培养基、试剂和材料进行说明。

(1)YEP固体培养基：10g/L蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/L氯化钠+7.5g/L琼脂粉

(2)YEP液体培养基：10g/L酵母提取物+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠

(3)共生培养基：4.432g/L MS+1.00mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂粉

(4)筛选培养基：4.432g/L MS+1.00mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂粉+100mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素

(5)生根培养基：2.216g/L MS+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂粉+100mg/L替门汀+100mg/L卡那霉素

所述使用的烟草品种为烟草(Nicotiana tabacum L.),烟草K326无菌苗。

整体而言，提高烟草抗旱性的基因NtBRL3在烟草中的应用，包括以下步骤；

(1)目的基因的获得

(2)NtBRL3目的基因载体的构建

(3)根癌农杆菌感受态细胞制备

(4)载体质粒导入根癌农杆菌

(5)烟草遗传转化，

(6)抗性烟草植株鉴定

(7)转基因烟草T1代干旱处理

(8)通过荧光定量qRT-PCR检测候选基因表达量

其中，所述NtBRL3基因表达元件由上海旭冠生物技术有限公司合成，BRL3表达载体是通过XbaI和KpnI双酶切载体pSH737和BRL3片段，然后连接转化得pSH737-BRL3载体，该载体含有35S启动子和NtBRL3基因表达元件及筛选标记基因和报告基因。使用phs737作为载体，35S作为启动子，NPTII作为抗性筛选基因，GUS作为报告基因。

所述步骤5中，暗培养和光照培养，暗培养2d,光照培养在25℃下以16小时光照/8小时黑暗周期在组培间中进行。

所述步骤6中PCR鉴定的引物：

Forward primer(SEQ ID NO.3)：ATCACTCGCAAAACACCTGC；

Reverse primer(SEQ ID NO.4)：AGTGAAGTGAAGGCGAAGCA；

所述步骤7中用于进行干旱实验为生长至五叶一心时期的烟苗。转基因烟草和野生型烟草分别设置3个生物重复。使用20％PEG6000溶液连续7天反复浇灌，每株每盆浇灌50mL；

所述步骤7中，根据p值<为0.005和log2FoldChange>1的标准筛选得到候选基因。

具体的，提高烟草抗旱性的基因NtBRL3在烟草中的应用包括以下步骤：

1、目的基因的获得：拟南芥BRL3基因在TAIR(https://www.arabidopsis.or g/index.jsp)上的序列号：AT3G13380.1,通过BRL3基因的序列号找到拟南芥的CDS序列，得到的拟南芥BRL3基因的CDS序列通过TBtools软件转化成拟南芥BRL3基因的蛋白序列，利用最大似然法(ML)筛选鉴定出似然率接近的属于烟草的NtBRL3基因。将得到的烟草NtBRL3基因的CDS序列通过NCBI进行Bleast分析确定对应的基因是要找的目的基因(XM_016615644.1)。

2.NtBRL3目的基因载体的构建：

NtBRL3基因表达元件由上海旭冠生物技术有限公司合成，BRL3表达载体是通过XbaI和KpnI双酶切载体pSH737和BRL3片段，然后连接转化得到pSH737-BRL3载体(即重组载体)，该载体含有35S启动子和NtBRL3基因表达元件及筛选标记基因和报告基因。

将含有表达载体pSH737-35S-BRL3的质粒通过冻融法转化根癌农杆菌株LBA4404，以Kan(卡那霉素)100mg/L、Rif(利福平)20mg/L筛选根癌农杆菌阳性菌株，使用引物对(SEQID NO.3和SEQ ID NO.4)阳性菌株进行菌落PCR检测，PCR结果呈阳性的根癌农杆菌菌株扩大培养后-80℃保种。具体步骤为取-80℃保存的LBA4404感受态细胞置于冰中解冻10min；向每支感受态细胞中加入5μL质粒DNA，轻轻弹动混匀后冰浴30min；液氮速冻5min后，立即37℃水浴2min；加入900μL 37℃预热YEP液体培养基，28℃，200rpm振荡培养3h；室温，4000×g离心1min后，弃上清；向菌体中加入100μL YEP液体培养基，用枪头吸打使之混匀；取适量菌液涂布于含有100mg/L Kan和20mg/L Rif的YEP平板培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养2d，-80℃保存菌液。

3.根癌农杆菌感受态细胞制备：

根癌农杆菌感受态细胞制备：取出保存在-80℃超低温冰箱的根癌农杆菌菌种，用接种针蘸取菌液，在含Rif(20mg·L

质粒提取使用天根试剂盒。

操作步骤：

1.柱平衡步骤:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400Xg)离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(～13,400Xg)离心1min，尽量吸除上清。

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4.向离心管中加入250μL溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5.向离心管中加入350μL溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400Xg)离心10min。

6.将上一步收集地上清液用移液器转移到吸附柱CP3中。12,000rpm(～13,400Xg)离心30-60sec,倒掉收集管中地废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.向吸入中CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm(～13,400Xg)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm(～13,400Xg)离心2min，目的使将吸附柱中残余的漂洗液去除。

10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400Xg)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

4.载体质粒导入根癌农杆菌

取出保存在-80℃超低温冰箱的根癌农杆菌感受态细胞放于冰上10min，让其解冻；量取5μL含NtBRL3 DNA质粒加入根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻弹动混匀，放于冰上30min，然后液氮速冻5min；将离心管放于37℃水浴锅中2min，使其溶解，得到重组根癌农杆菌；向离心管中加入900μL含Rif(20mg·L

5.烟草遗传转化

将上述步骤挑选的含有NtBRL3表达载体的单菌落根农杆菌(即重组根癌农杆菌)在摇床上振荡培养，当菌液OD600达到0.5时停止培养，将菌液离心后，用重悬液重悬后待用。以烟草无菌苗叶片作为外植体，通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法遗传转化烟草。将烟草无菌苗叶片切割成1cm×1cm小叶块，浸没于上述重悬过的菌液中，秒表计时8min，期间不断摇动菌液使其与叶片充分接触。将叶片用镊子夹到无菌纸上吸干菌液，参见图1(A)，接于共生培养基中。暗培养2d后，参见图1(B)，接于筛选培养基中培养，2周继代一次。参见图1(C)，待抗性芽长到2cm左右时，将其切下转于生根培养基中，待烟草根较粗壮时进行炼苗并移栽。该烟草即为抗性烟草。

6.抗性烟草植株鉴定

参见图1(E),待烟草植株移栽成活，并生长到一定大小，取烟草叶片提取DNA，转化超量表达载体的植株以烟草NtBRL3的引物(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物)进行扩增。使用的烟草进行PCR，在200bp获得目标条带。参见图1(D)，20μL体系中包括2μL烟草基因组DNA，0.5μL烟草BRL3-Forward,0.5μL BRL3-Reverse,10μL Taq DNA聚合酶和7μL ddH

7.转基因烟草T1代干旱处理

参见图1(F),选取长势一致的野生型烟草及过表达NtBRL3烟草幼苗进行干旱胁迫处理。首先，用蒸馏水冲洗3次后将烟苗，转移烟苗至盆栽，待烟苗稳定存活后至5叶一心时，使用质量体积分数为20％PEG-6000处理7天模拟干旱胁迫。对T1代进行生理生化分析。参见图2(A)和2(B)，(A)为干旱胁迫前表型情况；(B)为干旱处理后表型情况，野生型植株的生长发育受到严重抑制，叶片出现一定程度的枯萎，枯萎的叶片变黄，而NtBRL3ox植株的影响较小，结果表明，过表达NtBRL3基因提高了转基因植株的抗旱性。其中，NtBRL3ox：转基因烟草；WT：野生型。

在干旱胁迫下，两组的谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性均增加。然而，转基因烟草中的GST活性显著增加，转基因烟草的GST活性比野生型高1.51倍。转基因烟草的过氧化物酶(POD)活性是野生型的1.26倍。参见图3，图3为干旱处理后转基因烟草和野生型烟草GST、POD、CAT、SOD、MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量测定结果。结果表明，在干旱胁迫下，转基因烟草和野生型中的过氧化氢酶(CAT)均显著增加，但转基因烟草的增加量高于野生型，是野生型的1.55倍。通常，转基因烟草中的超氧化物歧化酶(SOD)活性略高于野生型。在干旱胁迫下，N转基因烟草的SOD活性是野生型的1.09倍。

在干旱胁迫下，两种基因型的丙二醛(MDA)含量均增加。转基因烟草和野生型的MDA含量均较对照显著增加，转基因烟草含量增加量是野生型的1.50倍。同样，转基因烟草的脯氨酸(Pro)含量和可溶性糖含量也显著高于野生型，分别是野生型的2.07倍和1.97倍。上述结果表明过表达NtBRL3可以通过提高GST、POD、SOD、和CAT的酶活性来提高转基因植株ROS的清除能力，从而降低ROS积累，提高转基因植株的抗旱性。

8.通过荧光定量qRT-PCR检测候选基因表达量

通过转录组分析获得与耐旱性相关的基因，这些基因参与了植物对干旱胁迫的反应或干旱诱导的基因参与植物对干旱胁迫的响应或由干旱诱导，GST，PLA，KCS，LOX，RD22，MAH1，HCT，WSD1，WAK。

采用TRNzol–A+(天根生化科技有限公司，北京)试剂盒提取样品总RNA利用PrimeScriptTMⅡ1ststrandcDNASynthesisKit(索莱宝技术有限公司，北京)进行反转录合成cDNA，将cDNA稀释10倍用于荧光定量PCR检测，以确定POR1基因的表达情况，利用PrimerPremier5.0软件设计上述基因的特异性引物，以L25基因作为内参。qRT-PCR试验在BioRadCFXConnectTM实时定量PCR仪(Bio-Rad公司)上进行操作。qRT-PCR所用为南京诺唯赞通用型高灵敏度染料法定量PCR检测试剂盒，根据试剂盒上的使用说明，进行qRT-PCR反应体系配置。qRT-PCR的条件和体系如下:一个变性循环(94℃，5min)，然后40个扩增循环(94℃，30秒，50℃，45秒)，以及信号采集(72℃，113秒)，qRT_PCR选择50μL体系：Nuclease-free Water 20μL、Biorun Pfu PCR Mix 25μL、Template 1μL、Primer(+)(100μM)2μL、Primer(-)(100μM)2μL。参见图4，图4为候选基因在野生型和转基因型的相对表达量图。结基因的相对表达水平用2–△Ct来分析。使用SPSS软件对数据进行方差分析，误差棒代表三个独立实验数据的±标准差。不同字母表示P<0.05差异显著、P<0.01差异极显著。转基因植株的干旱基因表达量增加，这表明过表达NtBRL3能够提高相关抗旱基因的表达。

本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。