一种负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，特别涉及一种靶向出血微环境的血小板衍生囊泡修饰凝血因子VIIIROS响应裂解脂质体及制备方法和应用。

背景技术

FVIII是凝血过程中重要的组成部分，如FVIII功能缺失则会导致血友病。将单纯的FVIII凝血因子作为药物对血友病患者进行治疗存在以下问题：无靶向出血功能；药物使用剂量大且效果差，要将严重血友病患者的血清凝血因子水平提高到80％，对于一个70公斤的患者来说，要注射2800个单位的因子，而且FVIII因子的生物半衰期为12小时，为了确保FVIII在血清因子水平的稳定，必须每隔8至12小时输注一次；存在耐药性，治疗并发症会形成抑制性抗FVIII抗体，大约30％的血友病A患者会产生此种抗体，该抗体会中和输注的FVIII蛋白，导致血友病A的发病率和死亡率增加；具有强烈的促进炎症作用；反复冻融影响其生物活性。所以，单纯的输注FVIII凝血因子并不能很好的治疗血友病，需要研发一种新的治疗血友病药物。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡及制备方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡的制备方法，是采用以下技术方案得以实现的。

一种负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡的制备方法，包括以下步骤：

S1.血小板囊泡的制备

取全血离心后得到的富血小板血浆，100-120g减速离心5-10min，取上清，再在750-800g减速离心15-20min，弃上清，重悬后用200um滤器滤过三至五遍，100um滤器滤三至五遍，得到血小板囊泡；

S2.薄膜分散法制备脂质体包裹凝血因子VIII

I.脂质体原料配制

每毫升氯仿中加入8-10mg卵磷脂、1.5-2mg胆固醇、2-3mgDSPE-2000、0.8-1mg荧光素和7-7.5mg氢氧化钠，混匀后得到脂质体原料溶液；

Ⅱ.薄膜制备

将步骤I配制的脂质体原料溶液在真空状态下旋转蒸发三至五分钟，直至出现层状分布的脂质体膜；

Ⅲ.脂质体包裹

将含凝血因子VIII的溶液与氯仿按照相同的体积混合，将含凝血因子VIII的溶液与步骤Ⅱ制备的脂质体膜混合；

IV.超声破碎

将步骤Ⅲ得到的混合物进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率比：35-40％，开2-3秒，关3-4秒，运行时间8-10分钟；

V.透析

将超声后的混合物装入含0.9％氯化钠水溶液的透析袋中，透析24-48h，得到凝血因子VIII脂质体；

S3.负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡的制备

将步骤S1和S2提取得到的血小板囊泡和凝血因子VIII脂质体溶液混合，100um滤器滤过5-10次，得到负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡。

进一步的，步骤S2Ⅲ中，含凝血因子VIII的溶液中，凝血因子VIII的浓度为200IU/10ml。

进一步的，步骤S2V中，透析袋的分子量为8000-14000。

第二方面，本发明提供了一种负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡，是采用以下技术方案得以实现的。

一种上述制备方法制备得到的负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡。

第三方面，本发明提供了一种负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡的用途，是采用以下技术方案得以实现的。

一种上述负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡在制备治疗血友病药物中的应用。

本申请具有以下有益效果。

1.本申请的负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡减低了药物毒性和单一性，减少耐药可能性；

2.本申请的负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡可以离开血液循环进入淋巴、骨髓和滑液等靶向出血区域，使负载药物聚集在特定的组织器官；

3.本申请的负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡促进血管内皮细胞的迁移和修复，增强止血作用；

4.本申请的负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡抑制致炎因子的释放，具备良好的抑制炎症作用，能促进巨噬细胞M2型极化转变；

5.本申请的负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡经反复冻融后仍能保持其功能，在储存、运输和使用方面具有优势。

附图说明

图1是本发明负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡的构建过程图；

图2是本发明PEV、FVIII、LS@FVIII、PEV-LS@FVIII的透射电镜、粒径和Zeta图；

图3是本发明PEV-LS@FVIII对血管内皮细胞修复作用的结果图；

图4是本发明PEV-LS@FVIII促进巨噬细胞M2表型极化修复血管损伤处炎症微环境的结果图；

图5是本发明PEV-LS@FVIII能有效减少凝血因子VIII敲除老鼠出血情况的结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本专利申请进行进一步的说明。

实施例1

一种负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡(PEV-LS@FVIII)的制备方法，步骤如下：

(1)血小板囊泡的制备

取全血离心后得到的富血小板血浆，离心机100g减速离心5min，取上清，再调至800g减速离心20min，弃上清，PBS重悬，用200um滤器滤过三遍，100um滤器滤五遍，即得到血小板囊泡。

(2)薄膜分散法制备脂质体包裹凝血因子VIII：

I.脂质体原料配制

溶剂：氯仿

溶质：卵磷脂/胆固醇/DSPE-2000

配比：以5ml氯仿为例，卵磷脂50mg，胆固醇8mg，DSPE-200010mg，荧光素4mg，35.5mg的氢氧化钠。

Ⅱ.薄膜制备

将上述配制的溶液倒入圆底烧瓶，真空状态下旋转蒸发三分钟，直至烧瓶内出现层状分布的脂质体膜。

II.脂质体包裹

将含凝血因子VIII的溶液按1：1的体积比加入圆底烧瓶，即原5ml氯仿的原料体系加5ml含凝血因子VIII的溶液(200IU/10ml)，在超声水浴的状态下将膜洗下。

IV.超声破碎

超声破碎仪参数：功率比：35-40％，开2秒，关3秒，运行时间10分钟(目的是将聚集成团的脂质体离散开，不是将脂质体膜打碎)。

V.透析

将混合物装入含有2L0.9％氯化钠水溶液的透析袋中，透析48h(透析去掉未被脂质体包裹上的药物)。

(3)负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡的制备

将步骤(1)、(2)提取出的血小板囊泡和凝血因子VIII脂质体溶液混合，100um滤器滤过五至十次，得到负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡。

如图1所示，在图1中，上方的双层结构表示血小板囊泡，囊泡上的凸起物为膜蛋白；下方的圆形颗粒表示凝血因子VIII，带有螺旋结构的颗粒表示脂质体，螺旋结构为ROS响应键，图1中两层带螺旋结构的颗粒包裹圆形颗粒表示凝血因子VIII脂质体；血小板囊泡和凝血因子VIII脂质体经过中间的滤器挤压滤过后，得到了一个球型物质即为负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡。

负载凝血因子VIII脂质体的血小板衍生囊泡通过囊泡的靶向作用向血管损伤处聚集，通过胞吞或膜融合的方式被血管内皮细胞摄取，被摄取后通过脂质体材料上的ROS(活性氧)响应键，与ROS发生反应，释放出凝血因子VIII发挥作用。

对比例1

一种负载凝血因子VIII的脂质体(LS@FVIII)的制备方法，该制备方法同实施例1的步骤(2)。

对比例2

一种血小板囊泡(PEV)的制备方法，该制备方法同实施例1的步骤(1)。

对比例3

一种负载脂质体的血小板衍生囊泡(PEV-LS)的制备方法，该制备方法同实施例1的步骤(3)。

性能检测

1.透射电镜、粒径和Zeta电位检测

对实施例1制备的PEV-LS@FVIII、对比例1制备的LS@FVIII、对比例2制备的PEV以及FVIII进行透射电镜、粒径和Zeta电位检测。实验结果参见图2，从图2可以看出，本发明制备的PEV-LS@FVIII形貌为规整的球形囊泡，粒径大小均匀。

2.PEV-LS@FVIII对血管内皮细胞的修复作用

出血会导致血管内皮细胞会破裂。CD31血小板-内皮细胞粘附因子、VEGF血管内皮生长因子和PDGF血小板衍生生长因子都具有促进细胞迁移和增殖，血管生成的作用。选用HUVECs(人脐静脉内皮细胞)来判断LS@FVIII、PEV-LS、PEV-LS@FVIII对内皮细胞的修复作用。使用TRIzol试剂从HUVECs中细胞中提取总RNA，TaqMan逆转录试剂盒用于将mRNA逆转录为cDNA。在此之后，使用SYBR PremixExTaqII(Takara)进行实时定量PCR(RT-qPCR)。

使用的引物及引物序列：

CD31

F:AACAGTGTTGACATGAAGAGCC(SEQ ID NO.1)

R:TGTAAAACAGCACGTCATCCTT(SEQ ID NO.2)

VEGF

F:ATCGAGTACATCTTCAAGCCAT(SEQ ID NO.3)

R:GTGAGGTTTGATCCGCATAATC(SEQ ID NO.4)

PDGF

F:TCTCTGCTGCTACCTGCGTCTG(SEQ ID NO.5)

R:AAGGAGCGGATGGAGTGGTCAC(SEQ ID NO.6)

实验结果参见图3，从图3的PCR结果可以看出，PEV-LS、PEV-LS@FVIII组CD31、VEGF、PDGF基因表达高于单纯的LS@FVIII组，表明PEV-LS@FVIII具有促进血管损伤修复的作用。

3.PEV-LS@FVIII能促进巨噬细胞M2表型极化修复血管损伤处炎症微环境

巨噬细胞极化的极化分为M1和M2两种。M1主要起到促进炎症发生发展的。M2主要分泌抗炎细胞因子抑制M1巨噬细胞，在伤口愈合及组织修复等进程中起作用。本申请采用BMM(骨髓来源的巨噬细胞)除了BLANK组不加干预，其他组滴加LPS(脂多糖)，然后用不同药物去干预。INOS、TNF-α、IL-β是巨噬细胞M1的标志物，ARG1、CD206、IL-10是巨噬细胞M2的标记物。使用TRIzol试剂从BMMs中细胞中提取总RNA，TaqMan逆转录试剂盒用于将mRNA逆转录为cDNA。在此之后，使用SYBRPremixExTaqII进行实时定量PCR。

使用的引物及引物序列：

iNOS

F:GCAGCACTTGGATCAGGAAC(SEQ ID NO.7)

R:ACCATCTCCTGCATTTCTTCC(SEQ ID NO.8)

TNF-α

F:ACCGTCAGCCGATTTGCTAT(SEQ ID NO.9)

R:CTCCAAAGTAGACCTGCCCG(SEQ ID NO.10)

IL-1β

F:ATCAACCAACAAGTGATATTCTCCAT(SEQ ID NO.11)

R:GGGTGTGCCGTCTTTCATTAC(SEQ ID NO.12)

CD206

F:CTCTGTTCAGCTATTGGACGC(SEQ ID NO.13)

R:CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC(SEQ ID NO.14)

ARG1

F:CAGCAAAGCAGACAGAACTAAG(SEQ ID NO.15)

R:AGAAAGGAACTGCTGGGATAC(SEQ ID NO.16)

IL-10

F:ATGGGAGGGGTTCTTCCTTG(SEQ ID NO.17)

R:GGGGGATGACAGTAGGGGA(SEQ ID NO.18)

实验结果参见图4，从图4的PCR结果可以看出，M1的标志物中，PBS和LS@FVIII组的INOS、TNF-α、IL-β基因表达高于其他组；M2的标志物中，PBS和LS@FVIII组的INOS、TNF-α、IL-β基因表达高于其他组；M1的标志物中，PEV-LS、PEV-LS@FVIII组的ARG1、CD206、IL-10的基因表达高于其他组。以上结果表明，单纯的LS@FVIII没有抗炎的作用，甚至是促炎；而PEV-LS@FVIII可以促进巨噬细胞向M2极化，从而达到抑制炎症和促进修复的作用。

4.PEV-LS@FVIII能有效减少凝血因子VIII敲除老鼠的出血情况

使用凝血因子VIII敲除小鼠分别通过鼠尾静脉注射100μlPBS(Vehicle组)，100μlrFVIII(200IU/10ml,LS@FVIII组)，100μlPEVs(5mg/ml，PEV-LS)，100μlrFVIII和PEVs(5mg/ml)制备成的PEV-LS@FVIII(PEV-LS@FVIII组)。针刺膝关节造出血模型。每隔一天测量膝关节直径和VBS(可视出血评分0-3分；0、膝关节正常，无血；1、膝关节正常，并有血存在；2、膝盖膨胀但不紧张，且有血存在；3、膝盖紧张而膨胀，且有血存在)查看膝关节出血肿胀情况。

从图5的折线图可以看出，PEV-LS@FVIII组的膝关节直径变化和VBS评分在出血后的14天都降低并接近于0，说明PEV-LS@FVIII能有效改善出血。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。