一种TMEM106B合成多肽、Tmem106b shRNA的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种TMEM106B合成多肽、Tmem106bshRNA的应用。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。动脉粥样硬化的并发症包括心脏性猝死、心律失常、心力衰竭、心源性休克和缺血性心肌病等致死性疾病。然而动脉粥样硬化的治疗选择有限，手术治疗可能会有破裂或继发性感染的不良反应，探明动脉粥样硬化的发病机制及寻找有效的干预方法，具有重要的研究及临床意义。

2007年，全基因组关联研究将染色体9p21.3确定为第一个也是最可靠的冠心病风险位点。目前共发现163个位点在全基因组水平上与冠心病风险相关，其中9p21.3位点解释了13％的冠心病发病率。9p21.3位点包含多个基因，包括MTAP、CDKN2A、CDKN2B和ANRIL。9p21.3包含了59-100个snp位点，其中大多数位于ANRIL基因内，这使得ANRIL成为冠心病最重要的候选基因。然而，目前针对9p21.3以及该位点下游相关通路的治疗靶点尚无报道。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA的应用，其目的在于通过抑制ANRIL下游靶点TMEM106B-NHE1的相互作用或TMEM106B蛋白表达，制备抗动脉粥样硬化的药物，有效控制动脉粥样硬化的加重和临床干预。

根据本发明第一方面，提供了TMEM106B合成多肽和/或Tmem106bshRNA用于制备治疗动脉粥样硬化药物的应用，所述TMEM106B合成多肽用于阻断ANRIL基因下游TMEM106B-NHE1相互作用；所述Tmem106bshRNA用于降低ANRIL基因下游TMEM106B蛋白表达；

所述TMEM106B合成多肽的的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

或者与序列SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％，且具有相同功能的氨基酸序列；

或者为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，且具有所述TMEM106B合成多肽活性的氨基酸序列。

优选地，所述Tmem106b shRNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述TMEM106B合成多肽N端连接有细胞穿膜肽。

优选地，所述细胞穿膜肽的序列如SEQ ID NO：3所示。

根据本发明另一方面，提供了一种治疗动脉粥样硬化的药物，所述药物含有TMEM106B合成多肽和/或Tmem106b shRNA。

所述TMEM106B合成多肽用于阻断ANRIL基因下游TMEM106B-NHE1相互作用；所述Tmem106b shRNA用于降低ANRIL基因下游TMEM106B蛋白表达；

所述TMEM106B合成多肽的的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

或者与序列SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％，且具有相同功能的氨基酸序列；

或者为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，且具有所述TMEM106B合成多肽活性的氨基酸序列。

优选地，所述Tmem106b shRNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述TMEM106B合成多肽N端连接有细胞穿膜肽。

优选地，所述细胞穿膜肽的序列如SEQ ID NO：3所示。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

本发明提供一种TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA应用，该TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA能通过阻断ANRIL下游TMEM106B-NHE1的相互作用或抑制ANRIL下游TMEM106B蛋白表达，改善动脉粥样硬化斑块病变，减少斑块中巨噬细胞的积累，降低溶酶体pH，最终抑制动脉粥样硬化的发生发展过程。因此，本发明提供的TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA能制备用于预防或治疗ANRIL高表达引起的动脉粥样硬化的药物。此外，由于本发明提供的Tmem106b shRNA能够显著降低TMEM106B蛋白表达，因此Tmem106b shRNA也可以用于制备由TMEM106B升高导致的其他疾病。

附图说明

图1为本发明实施对照组及TMEM106B合成多肽Peptide-I处理HEK293T细胞抑制TMEM106B-NHE1相互作用免疫共沉淀结果图。

图2为本发明实施TMEM106B合成多肽Peptide-I注射小鼠后在体内的富集结果图。

图3为本发明实施Tmem106b shRNA抑制MOVAS细胞、小鼠动脉粥样硬化斑块以及小鼠巨噬细胞中TMEM06B表达的结果图。

图4为本发明实施TMEM106B合成多肽和Tmem106b shRNA治疗ANRIL过表达动脉粥样硬化小鼠的全主动脉油红O染色结果图。

图5为本发明实施TMEM106B合成多肽和Tmem106b shRNA治疗ANRIL过表达动脉粥样硬化小鼠的主动脉瓣膜切片油红O染色结果图。

图6为本发明实施TMEM106B合成多肽和Tmem106b shRNA治疗ANRIL过表达动脉粥样硬化小鼠的主动脉瓣膜切片F4-80免疫荧光染色结果图。

图7为本发明实施TMEM106B合成多肽和Tmem106b shRNA治疗ANRIL过表达动脉粥样硬化小鼠的巨噬细胞溶酶体pH荧光染色结果图。

图8为本发明实施TMEM106B合成多肽和Tmem106b shRNA抑制ANRIL过表达引起的动脉粥样硬化机制图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

为了去有效控制动脉粥样硬化的发生及临床干预。探明动脉粥样硬化发病机理及寻找有效的干预方法。本发明提供一种靶向溶酶体蛋白质TMEM106B合成多肽或Tmem106bshRNA，用于制备抗动脉粥样硬化药物，具有治疗ANRIL高表达引起的动脉粥样硬化的效果。

所述TMEM106B合成多肽的的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述Tmem106bshRNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。优选地，所述TMEM106B合成多肽N端连接有细胞穿膜肽，所述细胞穿膜肽的序列如SEQ ID NO：3所示。

编码TMEM106B合成多肽基因具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，

按照所述TMEM106B合成多肽C端到N端的氨基酸顺序进行逐一的固相合成；一种Tmem106b shRNA的制备方法，其特征在于，所述Tmem106bshRNA的制备方法包括：

S100：将Tmem106b shRNA插入到pLVX-shRNA2-Puro载体中，构建融合质粒；

S200：将S100所述的重组质粒转染进入HEK293T细胞中，收取细胞培养上清，得到Tmem106b shRNA病毒上清液；

S300：将S200中得到的病毒上清液与病毒纯化液混合，离心弃去上清，PBS重悬沉淀得到纯化的Tmem106b shRNA病毒液。

以下为具体实施例

实施例1：编码TMEM106B合成多肽的核苷酸序列

本发明实施例提供的一种编码TMEM106B合成多肽的核苷酸序列，其核酸序列为：

(1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

(2)与序列SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO.1所示的核酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸密码子具有同等活性的由(1)衍生的序列。

实施例2：体外固相TMEM106B合成多肽的氨基酸序列

本发明实施例提供一种TMEM106B合成多肽，具有抑制ANRIL高表达引起的动脉粥样硬化的效果。

TMEM106B合成多肽的氨基酸序列为：

(1)由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或

(2)与序列SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同生物学功能蛋白质或多肽的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID NO：1表达的蛋白或多肽具有同等生物学活性的氨基酸序列。

实施例3：编码Tmem106b shRNA的核苷酸序列

本发明实施例提供的一种编码Tmem106b shRNA的核苷酸序列，其核酸序列为：

(1)由SEQ ID NO.2所示的核酸序列；或

(2)与序列SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有同等活性或相同生物学功能的核苷酸序列。

实施例4：Tmem106b shRNA的制备方法

本发明实施例还提供一种Tmem106b shRNA的制备方法，包括以下步

(1)将Tmem106b shRNA插入到pLVX-shRNA2-Puro载体中，构建融合质粒；

(2)将步骤(1)所述的重组质粒与辅助质粒pMD2G以及psPAX2按照2:1:1的比例转染进入HEK293T细胞中，72h后收取细胞培养上清，得到Tmem106b shRNA病毒上清液；

(3)将步骤(2)中得到的病毒上清液与病毒纯化液按照4：1的比例混合，4℃静置过夜，次日取出混合液离心弃去上清，PBS重悬沉淀得到纯化的Tmem106b shRNA病毒液。将病毒液分装保存在-80℃，即为本发明提供的Tmem106b shRNA。

实施例5：TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA在制备预防或治疗ANRIL高表达引起、TMEM106B升高导致的动脉粥样硬化药物中的应用。

一、实验过程

本发明采用敲除ApoE同时高表达ANRIL的C57BL/6N小鼠给予高胆固醇西方饮食饲料(western diet)建立动脉粥样硬化动物模型，通过小鼠尾静脉注射TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA的方式验证其有效性：

将实验小鼠随机分为4组，进行高胆固醇西方饮食饲料(western diet)喂食。喂食2周后，其中两组通过小鼠尾静脉注射TMEM106B合成多肽或相同剂量的对照多肽，每只小鼠按照5mg/kg每周三次共注射10周；另外两组小鼠尾静脉注射Tmem106b shRNA或相同剂量的shNC，每只小鼠按照8x10

小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(i.p,50mg/kg)麻醉，待小鼠无法自主翻身时，切开小鼠胸腔，暴露心脏，左心室注射生理盐水，去除心脏外膜脂肪，分离全主动脉。心脏在4℃下用30％蔗糖脱水过夜，包埋在OCT化合物中，切片获得主动脉根部连续冷冻切片(8μm)，切片采用油红O染色3小时，测量病变面积。全主动脉纵向切开，固定在黑色硅床上，室温油红O染色3小时，测量病变面积。

二、实验结果

2.1TMEM106B合成多肽的体外效果和体内富集情况

如图1所示：在HEK293T细胞中免疫共沉淀结果显示，与溶剂对照组Control相比，合成多肽Peptide-I明显抑制了TMEM106B和NHE1的相互作用，而对照多肽Peptide-C和Control相比没有差异。如图2所示，免疫荧光结果显示，合成多肽Peptide-I在小鼠体内的动脉粥样硬化斑块和巨噬细胞中均具有显著富集。

2.2Tmem106b shRNA对TMEM106B的表达影响

免疫印迹结果显示，我们最先使用的两个Tmem106b shRNA均可以降低TMEM106B的表达，但shTmem106b-2的降低效率会更高(图3)。选取效率更高的shTmem106b-2能够显著降低小鼠动脉粥样硬化斑块以及巨噬细胞中的TMEM106B的表达(图3)。

2.3TMEM106B合成多肽对小鼠动脉粥样硬化的影响

油红O能特异性地与组织和细胞内的中性甘油三脂、脂质以及脂蛋白产生吸附作用从而使脂质染色。小鼠全主动脉分离后，固定于黑色硅床上，与对照多肽Peptide-C相比，油红O染色显示合成多肽Peptide-I显著减少了全主动脉的红色斑块病变面积(图4)。小鼠心脏固定后冷冻切片，每只小鼠均收取主动脉瓣膜处的切片，保证取样位置相同。与对照多肽Peptide-C相比，油红O染色显示合成多肽Peptide-I显著减少了主动脉瓣膜切片的红色斑块病变面积(图5)。巨噬细胞的积累是动脉粥样硬化的重要指标，F4-80的免疫荧光可以观察到Peptide-I显著减少了主动脉瓣膜切片的绿色荧光信号，说明巨噬细胞积累减少(图6)。Lysotracker探针是一种检测溶酶体酸碱度的荧光探针，溶酶体pH越酸，红色荧光越强。与对照多肽Peptide-C相比，Lysotracker染色显示合成多肽Peptide-I红色荧光更强，说明溶酶体pH更低(图7)。这些结果表明，TMEM106B合成多肽显著降低了小鼠的动脉粥样硬化斑块病变，可用于治疗动脉粥样硬化。

2.4Tmem106b shRNA对小鼠动脉粥样硬化的影响

与对照shNC相比，油红O染色显示Tmem106b shRNA显著减少了全主动脉的红色斑块病变面积(图4)。与对照shNC相比，油红O染色显示Tmem106b shRNA显著减少了主动脉瓣膜切片的红色斑块病变面积(图5)。F4-80的免疫荧光结果显示，Tmem106b shRNA显著减少了主动脉瓣膜切片的绿色荧光信号，说明巨噬细胞积累减少(图6)。与对照shNC相比，Lysotracker染色显示Tmem106b shRNA组红色荧光更强，说明溶酶体pH更低(图7)。这些结果表明，Tmem106b shRNA显著降低了小鼠的动脉粥样硬化斑块病变，可用于治疗动脉粥样硬化。

基于以上实施例，作为一种可选的实施例，如图8所示，本发明提供的TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA能通过阻断TMEM106B-NHE1相互作用或抑制TMEM106B基因表达，减少动脉粥样硬化斑块病变，最终来抑制动脉粥样硬化的发生发展过程。

基于以上实施例，作为一种可选的实施例，本发明所述的TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA可用于制作治疗或预防ANRIL高表达引起的、TMEM106B升高导致的动脉粥样硬化药物。

基于以上实施例，作为一种可选的实施例，本发明所述的TMEM106B合成多肽或Tmem106b shRNA可与任一种或几种医学上可接受的药物赋形剂结合制作治疗或预防ANRIL高表达引起的动脉粥样硬化或由TMEM106B升高导致的其他疾病的药物组合物。

优选的，所述药物组合物均为注射剂。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。