含透明质酸微球的注射复合液及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医用生物材料技术领域，更具体涉及一种含透明质酸微球的注射复合液，还涉及该注射复合液的制备方法，及其在医疗美容领域的应用。

背景技术

随着人年龄的增长，皮肤受内源性和外源性因素影响出现老化，体内细胞合成透明质酸(HA)的能力下降，人体合成胶原蛋白和弹性蛋白含量减少，皮肤弹性降低且粗糙程度增加，从而导致皮肤老化，出现皱纹，且皮肤脆性增加，修复功能减退。因此，可以通过向人真皮层内补充透明质酸、胶原蛋白和弹性蛋白等营养物质，来补充皮肤水分含量、恢复皮肤弹性、改善皮肤状态，从而达到抚平皱纹、平滑皮肤的目的。

透明质酸，又名玻尿酸，是一种高分子粘多糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰基葡萄糖胺为双糖单位组成。它是人体真皮组织的主要组成成分，是肌肤水嫩的重要基础物质，透明质酸因其特殊的分子结构，可以将结合的水分子牢牢锁定在其特殊的双螺旋柱状结构中，使水分不易流失，其有特殊的补水保水作用，被称为理想的天然保湿因子。但未经交联的透明质酸在人体内维持时间较短，在人体内仅有1～2天的时间就会被体内的透明质酸酶完全降解，仅能够在短时期内发挥补水保湿功能。因此，为延长透明质酸在体内的维持时间，多采用交联剂对其进行交联，但是经修饰的透明质酸凝胶会发生溶胀，且交联的透明质酸通常存在交联程度不均一，颗粒形态不规范及粒径不均一等问题，用于面部注射容易因表面不规则引起红肿等副反应。另外，通过化学交联剂交联后的透明质酸凝胶，有一定的支撑性，不易在注射部位扩散，可能形成凸起。因此只能用在面部较深层次的注射，不适合用于皮肤真皮浅层的补水保湿。

专利CN 115177561 A《一种注射用抗衰老祛皱美白复合溶液制剂及其制备方法和应用》提供了一种复合溶液制剂的制备，所述复合溶液制剂由透明质酸、胶原蛋白粉、胶原蛋白肽、谷胱甘肽、维生素C、中药提取物组合物、磷酸盐缓冲液构成。但是，未经修饰的透明质酸在体内易于降解，仅短时期内发挥补水保湿功能。专利CN 115990286 A《一种注射用聚左旋乳酸复合剂及其制备方法》一文中以聚左旋乳酸颗粒、非交联透明质酸、甘露醇等制备一种注射用复合剂。但是，该技术由于透明质酸复合的是其他种类微球填充材料，不仅存在微球生物相容性差，在体内难以降解的问题，而且因为透明质酸和微球是两种不同材料，分散较难，且分散均匀性不可控，体系稳定系也较差。

综上，还需开发一种体系更加稳定的、维持时间较长的、并且可用于皮肤真皮浅层或中层注射的注射复合液。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种含透明质酸微球的注射复合液及其制备方法和用途。本发明的注射复合液使用透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白共同构成复合网络，使含透明质酸微球的复合溶液体系稳定性增强，微球在溶液体系中均匀分散且能够稳定维持。

本发明第一方面提供了一种注射复合液，其特征在于，按重量份数计，所述注射复合液包含透明质酸微球1-20份、非交联透明质酸钠1-12份、胶原蛋白0.1-3份和弹性蛋白0.1-3份。

本发明所用的透明质酸微球为经过交联乳化的透明质酸微球，粒径为2-8μm，如图1所示，其呈圆润的球状，表面光滑无棱角且粒径相对均一，能够减少面部注射时红肿等副反应的发生。另外，这种透明质酸微球是由透明质酸交联形成，其生物相容性良好，在体内可被透明质酸酶完全降解被人体吸收。这种透明质酸微球可用于皮下注射，经过交联的微球可以延长其在人体内的留存时间，而且因其交联相对于交联透明质酸凝胶来说更加致密、粒径适中，相比于交联的透明质酸凝胶，基本不发生溶胀。并且当用于注射填充时不会产生丁达尔效应，能够实现持久补水保湿的功能。

胶原蛋白，是细胞外基质的另一种主要成分，成人皮肤中的胶原蛋白主要是Ⅰ型和Ⅲ型，其中Ⅲ型胶原蛋白是维持皮肤年轻化的关键。Ⅰ型胶原蛋白较粗大、相对坚硬、决定皮肤的组织框架，Ⅲ型胶原蛋白较细小、具有弹性、决定皮肤的柔嫩度，此外，成人皮肤中的Ⅲ型胶原蛋白随着年龄增加流失而减少，同时成人真皮已经不具有合成Ⅲ型胶原蛋白的能力，只能合成Ⅰ型胶原蛋白。因此采用皮内注射的方式对皮肤直接补充Ⅲ型胶原蛋白，可用于补充机体流失的Ⅲ型胶原蛋白，供给真皮层所必需的养分，提高皮肤弹性，改善皮肤状态。本发明产品中所用胶原蛋白为注射级重组Ⅲ型人源化胶原蛋白(RHCⅢ)，是基于天然胶原原始基因序列，通过重组基因技术转入工程细胞，发酵、纯化获得，比动物源胶原蛋白成本更低，安全性更高、致敏性更低、与人体亲和性更高，且无传播动物源性疾病的风险。

弹性蛋白是弹性纤维(elastic fibers)的主要成分，也是细胞外基质的另一种主要成分，弹性纤维与胶原纤维共同存在，维持皮肤组织的弹性和抗张能力。弹性蛋白分子间的交联比胶原更复杂，通过赖氨酸残基参与的交联形成富于弹性的网状结构，它们通过共价键形成的交联网络可通过构型的变化产生弹性，让皮肤有伸展和褶合的能力，负责维持与支撑皮肤弹性。弹性蛋白是皮肤老化产生松弛、下垂和细皱纹的主要原因，随着皮肤自然老化，弹性纤维分解越来越显著，弹性蛋白目前主要通过动物组织提取,它存在病毒传播隐患和容易降解等缺陷。重组人源弹性蛋白是以弹性蛋白中活性位点氨基酸序列为基础，通过基因构建，利用酵母菌表达系统进行表达、纯化后的得到的。重组人源弹性蛋白由人弹性蛋白片段组成,具有与天然弹性蛋白类似的二级结构和可逆相变特性。比动物源性弹性胶原蛋白安全性更高、致敏性更低。因此采用皮内注射的方式对皮肤直接补充重组弹性蛋白能够维持皮肤年轻、细腻、弹性，改善皮肤状态。

此外，由于透明质酸、胶原蛋白和弹性蛋白分子上都存在羟基等亲水基团，当三者共同作为载体负载透明质酸微球时，可以通过氢键和范德华力等作用结合，形成稳定的载体网络。且由于体系中的透明质酸和透明质酸微球颗粒均采用相同的透明质酸组分，因此透明质酸微球可以在体系中均匀存在，具有较高体系的稳定性。发明人出乎预料地发现注射复合液中非交联透明质酸钠、胶原蛋白与弹性蛋白的配比对于注射复合液的性能(例如稳定性、抗酶解性)具有影响，并通过大量实验找到了应用于本发明注射复合液的各组分的最佳质量份数范围，使本发明的注射复合液达到最佳的性能。

可选地，所述注射复合液包含透明质酸微球5-20份、非交联透明质酸钠5-12份、胶原蛋白0.1-3份和弹性蛋白0.1-3份。

可选地，所述注射复合液还包含透明质酸酶抑制剂；优选地，按重量份数计，所述透明质酸酶抑制剂为0.5-1.5份。

可选地，所述注射复合液还包含其他功能性成分，所述功能性成分包括抗氧化剂，优选地，按重量份数计，所述抗氧化剂为0.1-3份。

可选地，所述抗氧化剂选自谷胱甘肽、甘露醇、维生素C、白藜芦醇、柠檬酸、山梨醇中的一种或多种。

透明质酸降解与透明质酸酶、温度、或氧自由基有关。因此，向体系中加入酶抑制剂和抗氧化剂来延缓透明质酸微球在体内的降解时间，达到更长的维持时间。其中，本发明的透明质酸酶抑制剂采用的是氨基酸成分，是精氨酸、甘氨酸、丙氨酸等其中一种或多种，其不仅具有良好的抑制透明质酸酶活性的性能，安全可靠，而且在抑制透明质酸酶的活性的同时，亦可以有效补充皮肤所需的营养成分，具有良好医疗美容价值；甘露醇、烟酰胺、谷胱甘肽等抗氧化剂均有良好的抗氧化性，可用于限制自由基对皮肤的破坏，降低并减少透明质酸和胶原蛋白的损失，减缓注射后产品的降解。

本发明第二方面提供了上述注射复合液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将胶原蛋白、弹性蛋白溶于缓冲液，得到溶液A；

(2)将透明质酸微球和非交联透明质酸钠溶于缓冲液，得到溶液B；

(3)将溶液A和溶液B混合，得到溶液C；

(4)将溶液C经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

上述步骤中的步骤(1)(2)可以以任意顺序先后或同时进行，不受序号顺序所束缚。

可选地，所述步骤(1)还包括将透明质酸酶抑制剂和/或其他功能性成分溶于缓冲液；所述功能性成分包括抗氧化剂。

可选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

本发明的发明人经过大量前期实验，最终采用分别将胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸微球、非交联透明质酸分别溶解再加以混合的方式来制备本发明的注射复合液。这种制备方法相较于将上述物质同时溶解于同一溶液的方法，能够使透明质酸微球在溶液中的分布更加均一，制得的注射复合液的稳定性更好，避免后期溶液的分层现象。

本发明第三方面提供了上述注射复合液用于制备注射至皮肤真皮层的产品的应用。优选地，提供了上述注射复合液用于制备注射至皮肤真皮层浅层或中层的产品的应用。例如，本发明的产品的应用形式可以为用于面部的水光针注射液。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明将透明质酸微球的非交联透明质酸溶液混合，通过将透明质酸微球和非交联透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白、以及可选的透明质酸酶抑制剂、抗氧化剂混合，制得用于面部注射的复合溶液。透明质酸微球是经过微交联乳化形成的，相较于非交联透明质酸抗降解性能提升。且透明质酸酶抑制剂和抗氧化剂能够延缓透明质酸的降解，降低酶和自由基对复合溶液中透明质酸成分的降解，显著提高复合溶液在体内的维持时间，可以注射到面部浅层发挥良好的补水保湿性能。

2、重组胶原蛋白和重组弹性蛋白能够通过氢键和范德华力等作用和非交联透明质酸结合，形成较为稳定的空间网络体系，透明质酸微球能够均匀分散在这种体系中，使得复合溶液体系更加均匀稳定。且复合溶液中透明质酸的补水保湿效果和重组胶原蛋白、弹性蛋白的修复效果协同作用，共同改善皮肤状态。此外本发明提供的复合溶液中的透明质酸酶抑制剂采用的是氨基酸成分，不存在药理作用，安全有效，且氨基酸的加入能够补充皮肤所需的营养成分。

3、透明质酸微球由于自身的不透明性能，复合溶液整体呈不透明状，用于面部注射时可以避免眼周等部位注射后产生丁达尔效应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明所用的透明质酸微球的粒径分布照片。

图2为本发明实施例2制得的最终产品的照片。

图3为本发明实施例2制得的产品放置24周的图片和对比例1制得的产品放置24周的图片。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术术语和科学术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中的定义为准。另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

透明质酸微球：购自陕西未来生物基质有限公司。粒径为2-8μm，通过乳化交联形成，交联度0.5％-1.5％。

非交联透明质酸钠：购自山东众山生物科技有限公司，货号/批号：SH06221225-19。

重组胶原蛋白：购自英特菲尔生物制品产品研究院有限公司，批号20221214-2。

重组弹性蛋白：购自英特菲尔生物制品产品研究院有限公司。

实施例1

本实施例提供一种注射复合液，该注射液组分含有非交联透明质酸钠8mg/mL、透明质酸微球12mg/mL、重组胶原蛋白1mg/mL、重组弹性蛋白1mg/mL。

制备方法由以下步骤形成：

步骤一：配制0.9％磷酸盐缓冲液，得到溶液A。

步骤二：将溶液A分为两部分，将重组胶原蛋白、重组弹性蛋白溶解于一部分溶液A中得到溶液B。

步骤三：将非交联透明质酸钠和透明质酸微球溶解于另一部分溶液A得到溶液C。

步骤四：将溶液B和溶液C混合，搅拌均匀，得到溶液D。

步骤五：将溶液D经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

实施例2

本实施例提供一种注射复合液，该注射液组分含有非交联透明质酸钠8mg/mL、透明质酸微球12mg/mL、重组胶原蛋白1mg/mL、重组弹性蛋白1mg/mL、精氨酸0.5mg/mL、甘氨酸0.5mg/mL、甘露醇1mg/mL。

制备方法由以下步骤形成：

步骤一：配制0.9％磷酸盐缓冲液，得到溶液A。

步骤二：将溶液A分为两部分，将精氨酸、甘氨酸、甘露醇、重组胶原蛋白、重组弹性蛋白溶解于一部分溶液A中得到溶液B。

步骤三：将非交联透明质酸钠和透明质酸微球溶解于另一部分溶液A得到溶液C。

步骤四：将溶液B和溶液C混合，搅拌均匀，得到溶液D。

步骤五：将溶液D经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

实施例3

本实施例提供一种注射复合液，该注射液组分含有非交联透明质酸钠10mg/mL、透明质酸微球10mg/mL、重组胶原蛋白1mg/mL、重组弹性蛋白1mg/mL、丙氨酸0.5mg/mL、甘氨酸0.5mg/mL、谷胱甘肽1mg/mL。

制备方法由以下步骤形成：

步骤一：配制0.9％磷酸盐缓冲液，得到溶液A。

步骤二：将溶液A分为两部分，将精氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽、重组胶原蛋白、重组弹性蛋白溶解于一部分溶液A中得到溶液B。

步骤三：将非交联透明质酸钠和透明质酸微球溶解于另一部分溶液A得到溶液C。

步骤四：将溶液B和溶液C混合，搅拌均匀，得到溶液D。

步骤五：将溶液D经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

实施例4

本实施例提供一种注射复合液，该注射液组分含有非交联透明质酸钠12mg/mL、透明质酸微球20mg/mL、重组胶原蛋白1mg/mL、重组弹性蛋白1mg/mL、精氨酸0.5mg/mL、甘氨酸0.5mg/mL、甘露醇1mg/mL。

制备方法与实施例2相同。

对比例1

本对比例提供一种注射复合液，该注射液组分含有透明质酸微球20mg/mL、精氨酸0.5mg/mL、甘氨酸0.5mg/mL、甘露醇1mg/mL。

制备方法由以下步骤形成：

步骤一：配制0.9％磷酸盐缓冲液，得到溶液A。

步骤二：将溶液A分为两部分，将精氨酸、甘氨酸、甘露醇溶解于一部分溶液A中得到溶液B。

步骤三：将透明质酸微球溶解于另一部分溶液A得到溶液C。

步骤四：将溶液B和溶液C混合，搅拌均匀，得到溶液D。

步骤五：将溶液D经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

对比例2

本对比例提供一种注射复合液，该注射液组分含有非交联透明质酸钠12mg/mL、精氨酸0.5mg/mL、甘氨酸0.5mg/mL、甘露醇1mg/mL。

制备方法由以下步骤形成：

步骤一：配制0.9％磷酸盐缓冲液，得到溶液A。

步骤二：将溶液A分为两部分，将精氨酸、甘氨酸、甘露醇溶解于一部分溶液A中得到溶液B。

步骤三：将非交联透明质酸钠溶解于另一部分溶液A得到溶液C。

步骤四：将溶液B和溶液C混合，搅拌均匀，得到溶液D。

步骤五：将溶液D经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

对比例3

本对比例提供一种注射复合液，该注射液组分含有透明质酸微球12mg/mL、非交联透明质酸钠8mg/mL、精氨酸0.5mg/mL、甘氨酸0.5mg/mL、甘露醇1mg/mL。

制备方法由以下步骤形成：

步骤一：配制0.9％磷酸盐缓冲液，得到溶液A。

步骤二：将溶液A分为两部分，将精氨酸、甘氨酸、甘露醇溶解于一部分溶液A中得到溶液B。

步骤三：将非交联透明质酸钠和透明质酸微球溶解于另一部分溶液A得到溶液C。

步骤四：将溶液B和溶液C混合，搅拌均匀，得到溶液D。

步骤五：将溶液D经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

对比例4

本对比例提供一种注射复合液，该注射液组分含有透明质酸微球12mg/mL、非交联透明质酸钠2mg/mL、重组胶原蛋白4mg/mL、重组弹性蛋白4mg/mL、精氨酸0.5mg/mL、甘氨酸0.5mg/mL、甘露醇1mg/mL。

制备方法由以下步骤形成：

步骤一：配制0.9％磷酸盐缓冲液，得到溶液A。

步骤二：将溶液A分为两部分，将精氨酸、甘氨酸、甘露醇、重组胶原蛋白、重组弹性蛋白溶解于一部分溶液A中得到溶液B。

步骤三：将非交联透明质酸钠和透明质酸微球溶解于另一部分溶液A得到溶液C。

步骤四：将溶液B和溶液C混合，搅拌均匀，得到溶液D。

步骤五：将溶液D经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

对比例5

本对比例提供一种注射复合液，该注射液组分含有非交联透明质酸钠8mg/mL、透明质酸微球12mg/mL、重组胶原蛋白1mg/mL、重组弹性蛋白1mg/mL、精氨酸0.5mg/mL、甘氨酸0.5mg/mL、甘露醇1mg/mL。

制备方法由以下步骤形成：

步骤一：配制0.9％磷酸盐缓冲液，得到溶液A。

步骤二：将精氨酸、甘氨酸、甘露醇、重组胶原蛋白、重组弹性蛋白、非交联透明质酸钠和透明质酸微球溶解于溶液A中得到溶液B。

步骤三：将溶液B经除菌后灌装，得到所述注射复合液。

实验例1透光率验证

将上述实施例及对比例制得的样品在530nm处测定其透光率，并且以0.45％的PBS溶液在530nm处的透光率为100％透光。

实验方法：用移液枪准确量取各待测样品0.20mL于96孔板中，用酶标仪测定530nm处的吸光度。

透光率结果计算：

T＝10

式中：T—透光率

A—测得的吸光度值

表1样品透光率测试结果

从以上数据可以看出：产品的透光率主要受透明质酸微球影响，微球浓度越高透光率越低，且本发明实施例所提供的微球比例范围基本可以保证复合溶液的不透光性，以达到在用于面部注射时避免产生丁达尔效应的效果。

实验例2透明质酸降解率验证

取实验样品于西林瓶中，加入0.5mol/l的硫酸溶液并加热使其完全溶解，加1mol/l氢氧化钠中和后加水稀释，混合均匀后从中吸取1ml置于试管中，备用。

取实验样品于西林瓶中，加入1U/ml的BTH(牛睾丸透明质酸酶)溶液，置于37℃120rpm恒温水浴摇床中反应，定时取出，随后煮沸使酶失活，然后转移至20mL容量瓶中定容，在10000rpm，4℃条件下离心20min，离心结束后取上清液1mL于具塞试管中，备用。

使用硫酸-咔唑法对酸解样品和酶解样品中透明质酸钠含量进行吸光度测试。然后以酸解样品作为测定总含量，用不同时间段酶解含量比其总含量测定降解率。

表2样品透明质酸降解率测试结果

从以上数据可以看出：未经交联的透明质酸溶液降解迅速，而透明质酸微球降解性能明显优于透明质酸溶液。且在加入弹性蛋白和胶原蛋白以及透明质酸酶抑制剂的情况下，产品的抗酶解性能会进一步提升。

实验例3复合溶液均一和稳定性结果验证

参考YY/T 0681.1-2018《无菌医疗器械包装试验方法第一部分：加速老化试验指南》、《无源植入性医疗器械货架有效期注册申报资料指导原则(2017年修订版)》等方法将上述对比例及实施例制得的产品置于稳定性试验箱中，调节温度为40℃±2℃，相对湿度75％±5％，在此条件下分别放置1周、2周、4周、8周、16周、24周后取样，然后对其外观及透光性等对性能进行综合评价，并且根据评价结果将溶液均匀程度进行分级，分别为0-3级，0级代表溶液均匀程度基本无变化，1级代表溶液开始变得不均匀，但无肉眼可见分层，2级代表溶液开始出现分层现象，3级代表溶液完全分层。如图3所示，左侧为实施例2的产品放置24周的图片，右侧为对比例1的产品放置24周的图片。实验结果如下：

表3样品均一稳定性测试结果

从以上数据可以看出：本发明实施例所提供的各组分配比能够保证透明质酸微球在透明质酸溶液中的均匀分散，其中弹性蛋白和胶原蛋白的适量加入能够与透明质酸链之间发生缠绕，加强透明质酸溶液网络的作用力，提高体系的稳定性，使得复合溶液整体均匀稳定性得到保证。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。