用于靶向递送至细胞的组合物和方法

文献发布时间：2024-04-18 20:02:18

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年3月22日提交的美国临时申请号63/164,523、2021年8月4日提交的美国临时申请63/229,497和2022年2月1日提交的美国临时申请号63/305,426的权益，出于所有目的将所述申请各自通过引用整体特此并入本文。

背景技术

诸如CRISPR/Cas(规律间隔成簇短回文重复序列/CRISPR相关蛋白(Cas))技术的治疗方法通常需要将一种或多种治疗剂精确并且有效力地递送至一种或多种靶器官或靶细胞(有时以序列依赖性方式)。迄今为止，仍然明显需要实现治疗上安全且有效的基于脂质的载体，以在遗传疾病和许多其他应用的背景下、特别是在呼吸系统疾病的背景下实现临床结局。

发明内容

本申请总体上涉及安全、有效且有效力地将在脂质纳米颗粒中的治疗剂或预防剂(诸如多核苷酸、多肽或小分子化合物)递送至一种或多种靶细胞。

在某些方面，本申请提供了一种用于有效力地递送至受试者的(例如，肺)细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用(例如，气雾剂)组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向所述受试者的所述细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物(例如，没有所述量的所述SORT脂质)实现的情况相比(例如，约1.1倍或10倍)更大的治疗性作用。在一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。

在另一方面，本申请提供了一种用于有效力地递送至受试者的(例如，肺)细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用(例如，气雾剂)组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向所述受试者的细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物(例如，没有所述量的所述SORT脂质)实现的情况相比在(例如，约1.1倍或10倍)更多多个(例如，肺)细胞中的治疗性作用。在一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。

在另一方面，本申请提供了一种用于靶向递送至受试者的(例如，肺)细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用(例如，气雾剂)组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中与用参考脂质组合物实现的情况相比，(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向更大比例的细胞类型的递送。在一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。

在另一方面，本申请提供了一种用于靶向递送至受试者的(例如，肺)细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用(例如，气雾剂)组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向所述受试者的细胞的递送，其特征在于在第一多个第一细胞类型的(例如，肺)细胞中以及在(例如，约1.1倍或10倍)更多第二多个第二细胞类型的(例如，肺)细胞中的治疗性作用。在一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。

在另一方面，本申请提供了一种用于靶向递送至受试者的(例如，肺)细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用(例如，气雾剂)组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向所述受试者的细胞的递送，其特征在于与在所述受试者的第二细胞类型的第二(例如，肺)细胞中的治疗性作用相比在所述受试者的第一细胞类型的第一(例如，肺)细胞中(例如，约1.1倍或10倍)的更大治疗性作用，其中所述第一细胞类型不同于所述第二细胞类型。在一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。

在另一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中所述SORT脂质被配置为实现所述治疗剂的递送，其特征在于以下中的一个或多个：(a)与用参考脂质组合物实现的情况相比，在所述受试者的(例如，肺)细胞中(例如，1.1倍或10倍)的更大治疗性作用；(b)与用参考脂质组合物实现的情况相比，在所述受试者的(例如，1.1倍或10倍)更多多个(例如，肺)细胞(例如，一种细胞类型的肺细胞)中的治疗性作用；(c)在第一多个第一细胞类型的(例如，肺)细胞中以及在(例如，1.1倍或10倍)更多第二多个第二细胞类型的(例如，肺)细胞中的治疗性作用；以及(d)与在所述受试者的第二细胞类型的第二(例如，肺)细胞中的治疗性作用相比，在所述受试者的第一细胞类型的第一(例如，肺)细胞中(例如，1.1倍或10倍)的更大治疗性作用。在一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。

在另一方面，本公开文本提供了用选择性器官靶向(SORT)脂质配制的治疗剂的高效力剂型，所述剂型包含：与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的所述SORT脂质，其中所述SORT脂质在所述剂型中的存在量足以在与参考脂质组合物所需的情况相比(例如，至少约1.1分之一或10分之一)更低的所述治疗剂剂量下实现治疗性作用。在一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。

在另一方面，本公开文本提供了用选择性器官靶向(SORT)脂质配制的治疗剂的高效力剂型，所述剂型包含：与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的所述SORT脂质，其中所述治疗剂(例如，异源多核苷酸)以不超过约2毫克/公斤(mg/kg或mpk)体重的剂量存在于所述剂型中。在一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。

在另一方面，本申请提供了一种用于递送至受试者的(例如，肺)基底细胞的方法，所述方法包括：向受试者(例如，全身性)施用与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而将所述治疗剂递送至受试者的器官或组织(例如，肺)以导致在受试者的器官或组织中至少约5％、10％或15％的基底细胞中可检测到治疗性作用。

在一些实施方案中，本文提供的内容包括一种用于通过雾化递送至受试者的一种或多种肺细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用(例如，药物)组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而将所述治疗剂递送至所述受试者的肺的所述一种或多种肺细胞。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺上皮细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约2％、5％或10％的肺纤毛细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺分泌细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺棒状细胞(club cell)中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺杯状细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺基底细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含磷脂。在一些实施方案中，与所述脂质组合物组装的所述治疗剂的(例如，药物)组合物是气雾剂组合物。

根据以下详细描述，本申请的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得清楚，其中仅示出和描述了本申请的说明性实施方案。如将会实现的，本申请能够有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，这些都不背离本公开文本。相应地，附图和说明书应看做是说明性质的，而不是限制性的。

通过引用并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地指出以通过引用并入一样。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包括的公开内容相矛盾而言，说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开案的副本。通过参考以下具体实施方式，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述具体实施方式阐述了使用本发明原理的说明性实施方案和附图(本文中也称为“图”)，并且附图中：

图1示出了脂质的化学结构。

图2示出了树枝状聚合物或树枝基元脂质的化学结构。

图3示出了细胞类型和使用不同LNP组合物递送的mRNA的表达水平的图表。

图4示出了在使用多种LNP组合物进行Luc mRNA/LNP的吸入气雾剂递送之后，使用小鼠的生物发光的体内成像得到的图像。

图5示出了关于各种LNP组合物在人支气管上皮(hBE)细胞中的细胞毒性的图表。

图6示出了多种LNP组合物的稳定性和一般特征。

图7示出了LNP组合物(“肺-SORT”；5A2-SC8 DOTAP)在小鼠中的组织特异性辐射随时间变化的图表。

图8示出了LNP组合物(“肺-SORT”；5A2-SC8 DOTAP)在小鼠中的组织特异性辐射随时间变化的图像。

图9A示出了使用本文所述组合物进行人体安全性和耐受性研究的工作流程。

图9B说明了在气液界面(ALI)培养的纤毛上皮细胞(小鼠气管上皮细胞或MTEC)的离体模型，用于测试本文所述DNAI1 mRNA处理的拯救功效。

图9C说明了通过DNAI1 mRNA处理拯救了KO小鼠细胞中的纤毛活动，并且在停止给药后，治疗效果保持稳定达数周。

图10A示出了为测量本文所述脂质组合物的特性而进行的实验的总结。

图10B示出了为测量本文所述脂质组合物的特性而进行的实验的结局。

图10C说明了使用如本文所述脂质组合物(例如，包含SORT脂质)在非人灵长类动物中对DNAI1 mRNA(左)和DNAI1蛋白(右)的阳性肺标记(红色)。

图10D说明了通过用经修饰的核苷酸m1Ψ替代mRNA中100％的U，使细胞因子反应最小化。

图10E说明了从实验中收集的数据，证明了本文所述脂质组合物的纤毛功能恢复、耐受性和选择性。

图11A示出了用含有DNAI-HA mRNA的LNP处理的人DNAI1敲低细胞的免疫荧光图像。将分化良好的人DNAI1敲低细胞用单剂量的本文所述DNAI1-HA mRNA的配制品处理，并且用抗乙酰化微管蛋白和抗HA免疫染色。新表达的DNAI1-HA到纤毛的轴丝中的整合在处理后48至72小时之间达到峰值。在单次施用后超过24天内，在纤毛轴丝中检测到DNAI1-HA。重复施用导致纤毛活动的拯救，其在停止给药后保持数周。

图11B说明了新制造的带HA标签的DNAI1迅速掺入人支气管上皮细胞(hBE)的纤毛中。将分化良好的人DNAI1敲低细胞用单剂量的LNP配制的DNAI1-HA(10μg在2ml培养基中)处理(基础施用)。在给药后72小时，用抗乙酰化微管蛋白和抗HA对细胞进行免疫染色。超过90％的纤毛细胞呈DNAI1-HA阳性。

图12示出了NHP的呼吸系统上皮的多重免疫荧光组套，其可以用于区分细胞类型，显示出新翻译的DNAI1蛋白。

图13A示出了本文所述LNP配制品的细胞趋向性特征。

图13B说明了在敲低的原代hBE ALI培养物中，配制的DNAI1 mRNA的气雾剂施用拯救了纤毛活动。从ALI后第25天(培养时期)开始，将分化良好的人DNAI1-敲低细胞(hBE)每周用LNP配制的DNAi1(每次Vitrocell雾化300μg)处理2次。在ALI后第50天施用最后一个剂量。在开始给药后7天，首次检测到经处理的DNAI1敲低培养物中纤毛活动增加。获救的纤毛活动具有正常的摆动频率(9-17Hz)并且看起来是同步的。

图14A-图14B说明了在某些浓度和条件下包含20％可电离阳离子脂质(例如，DODAP)的脂质组合物的细胞趋向性特征。

图14C说明了在某些浓度和条件下包含20％可电离阳离子脂质(例如，DODAP)的脂质组合物的细胞趋向性特征。

图14D说明了在某些浓度和条件下包含20％永久阳离子脂质(例如，14:0EPC)的脂质组合物的细胞趋向性特征。

图14E说明了在某些浓度和条件下包含20％永久阳离子脂质(例如，14:0TAP)的脂质组合物的细胞趋向性特征。

图15说明了NHP的呼吸系统上皮靶细胞中的细胞类型相关DNAI1蛋白的表达。

图16A说明了NHP的呼吸系统上皮靶细胞中的细胞类型相关DNAI1蛋白的表达。

图16B示出了NHP的呼吸系统上皮靶细胞中细胞类型相关DNAI1-HA蛋白的表达(左图，肺；右图，支气管)。

图17说明了本文所述LNP配制品的生物分布、效力和耐受性研究。

图18A说明了施用于NHP的气雾剂浓度。

图18B说明了递送至NHP的剂量的示例性测量。

图18C说明了气雾剂组合物液滴的表征(MMAD：质量中值空气动力学直径；GSDL：几何标准偏差)。液滴表征结果在用于吸入毒性研究的经济合作与发展组织(Organizationfor Economic Co-operation and Development，OECD)指南433的推荐范围内，其中MMAD≤4μm并且GSD在1.0与3.0之间的。

图19A-图19C说明了在低剂量和高剂量的两个NHP组的肺中LNP脂质(来源于气雾剂液滴)的测量(图19A：在肺中的可电离脂质；图19B：在肺中的DMG-PEG；以及图19C：SORT脂质)。

图20A说明了通过蛋白质印迹获得的在肺中的DNAI1-HA蛋白表达。

图20B说明了通过ELISA获得的在肺中的DNAI1-HA蛋白表达。

图21A说明了AST、ALT和ALP的临床化学测量。用本文所述脂质组合物处理后，未观察到AST、ALT或ALP的显著变化。

图21B说明了白血细胞和嗜中性粒细胞的血液学计数。在媒介物组和RTX0052组两者的处理后测量中观察到嗜中性粒细胞的一些增加。

图21C说明了BAL细胞差异。对于细胞因子和补体分析，在NHP血清和BAL中测量细胞因子水平。测量的分析物包括IFN-α2a、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IP-10、MCP-1和TNFα。所有细胞因子水平均在与正常报告水平相同的范围内。

图21D说明了血清中细胞因子的示例性测量。

图21E说明了BAL中细胞因子的示例性测量。

图21F说明了分别在血浆和血清中C3a和sC5b-9测量的示例性补体测量。

图21G说明了在BAL中C3a和sC5b-9测量的示例性补体测量。

图22A说明了施用于大鼠的气雾剂浓度。

图22B说明了在三个阶级中气雾剂均匀性的示例性测量。

图22C说明了递送至大鼠的剂量的量。

图22D说明了气雾剂组合物液滴的表征(MMAD：质量中值空气动力学直径；GSDL：几何标准偏差)。

图23A-图23C说明了在低剂量、中剂量和高剂量大鼠组的肺中LNP脂质(来源于气雾剂液滴)的测量(图23A：在肺中的可电离脂质；图23B：在肺中的DMG-PEG；以及图23C：SORT脂质)。

图24A说明了通过蛋白质印迹获得的在大鼠肺中的DNAI1-HA蛋白表达。在1.2mg/kg 6小时组中，10个肺样品中有6个呈DNAI1-HA阳性。

图24B说明了通过ELISA获得的在大鼠肺中的DNAI1-HA蛋白表达。

图25A说明了在经处理的大鼠中AST、ALT和ALP的临床化学测量。

图25B说明了在经处理的大鼠中白血细胞和嗜中性粒细胞的血液学计数。

图25C说明了在经处理的大鼠中的BAL细胞差异。

图25D说明了在经处理的大鼠中α-2-巨球蛋白的示例性测量。

图26A说明了与有待用雾化LNP/DNAI1-HA mRNA重复处理的四组小鼠相关的信息。

图26B说明了重复给药小鼠的给药、成像和尸检方案。

图27C说明了重复给药小鼠的组织病理学结果。

图27D说明了qPCR结果，其显示出DNAI1-HA mRNA的相对丰度。在最后一个剂量(剂量8)的最后一次成像后，灌注2只小鼠/组。

图27E说明了蛋白质印迹，其显示出DNAI1-HA的蛋白质表达。

图28A说明了通过吸入递送0.4mg/kg LNP配制的DNAI1 mRNA。将NHP插管，通气并且给药少于30分钟。

图28B说明了LNP配制品的气雾剂特征。所有三种配制品的气雾剂粒度范围都适合在传导气道中沉积。

图28C说明了DNAI1-HA mRNA在靶细胞中的生物分布。

图28D通过H-得分说明了DNAI1-HA mRNA ISH结果。ISH结果证明了，高水平的DNAI1-HA mRNA被递送到肺细胞，并且在支气管和气管中水平较低。

图29A-图29D说明了在不暴露于肝、脾或血液的情况下高水平的DNAI1-HA mRNA被递送至肺。使用数字PCR测量在单次0.4mg/kg施用后全血、肺、肝和脾组织中的DNAI1-HAmRNA水平。在RTX0051和RTX0052暴露后6小时取样的所有三个肺区域中检测到高水平的DNAI1-HA mRNA。在脾(6小时，图29B)、肝(6小时，图29C)或全血(30分钟或60分钟，图29D)中，未检测到高于背景的DNAI1-HA mRNA。

图30A说明了上皮细胞类型的多重免疫荧光(IF)图像。

图30B说明了多重IF分析，其证明了在肺中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。

图30C说明了多重IF分析，其证明了在用RTX0051的情况下，在肺中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。

图30D说明了多重IF分析，其证明了在支气管中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。

图30E说明了多重IF分析，其证明了在用RTX0051的情况下，在支气管中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。

图30F说明了多重IF分析，其证明了在气管中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。

图31A-图31E说明了BAL细胞因子和补体的结果。

图32A-图32E说明了血浆细胞因子的结果。

图33说明了在暴露后6小时在BAL和血液中观察到嗜中性粒细胞的短暂增加。

图34说明了所选择的临床化学结果。处理后，在单独动物中观察到AST、LDH和肌酸激酶的少量增加。

图35说明了对于单剂量吸入研究，如通过临床观察和器官重量确定的耐受性的总结。

图36A说明了气雾剂递送系统的图。使用左侧所示的测试装置估计通过气管内导管递送的气雾化药物的量。将预先称重的玻璃纤维和MCE过滤器直接附接在气管内导管的出口处。在动物处理之前、期间和之后进行多次收集。将玻璃过滤器干燥并且使用两种重量分析进行定量。使用RiboGreen测定分析MCE过滤器以得到mRNA的量。

图36B说明了气雾剂粒度测量的结果。针对在传导气道中的沉积，测量供试品暴露的粒度(在人类中，分支0-15代)。

图38A说明了肺组织的DNAI1-HA mRNA ISH结果。来自测定鉴定的数据：分析的每只动物4个样品中的1个。在所有动物中检测DNAI1-HA mRNA。

图38B说明了在用RTX0001处理后，显著部分的肺细胞含有DNAI1-HA mRNA，如通过ISH和箱评分(bin scoring)所测量的。

图38C说明了用于ISH分析的肺组织的成像。

图39A说明了将高水平的DNAI1-HA递送到肺并没有导致类似的向肝或脾的递送。使用数字PCR测量在单次0.1mg/kg施用后全血、肺、肝和脾组织中的DNAI1-HA mRNA水平。在RTX0001暴露后6小时取样的所有三个肺区域中检测到高水平的DNAI1-HA mRNA。在脾和肝中，仅测量到DNAI1-HA mRNA在测定的LLOQ处或低于LLOQ。

图39B说明了NHP中DNAI1-HA标签蛋白的正染色。对于RTX0001，在施用后6小时或24小时检测DNAI1-HA。mRNA水平较高的区域与显示出DNAI1-HA蛋白水平最高的区域相关。DNAI1-HA mRNA存在于所有8只经处理的动物中。在媒介物处理的动物中未检测到信号。mRNA水平在6小时最高并且在24小时较低。

图39C说明了关键上皮细胞类型的多重IF组套。使用10个NHP FFPE肺组织块(每只动物1个)用于mIF测定鉴定。将来自每个块的两个载玻片一式两份地染色。报告单标记物阳性细胞、具有DNAI1表达的双阳性细胞的细胞计数、和双阳性细胞中的DNAI1MFI。

图40B说明了在肺中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达的多重IF分析。通过吸入施用单剂量0.1mg/kg的RTX0001/DNAI1-HA mRNA。在给药后6小时和24小时从两只NHP收集肺切片。通过将单独动物的所有4个检查肺切片的细胞计数合并来计算DNAI1-HA阳性细胞的百分比。每只动物计数的细胞总数为约690,000至1,100,000。示出了每只受处理的动物的单独数据点和每组的平均值±标准偏差(N＝2)。

具体实施方式

在描述本公开文本的实施方案之前，应当理解，此类实施方案仅通过举例的方式来提供，并且在实践本发明时，可以采用本文描述的本公开文本的实施方案的各种替代方案。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变动、变化和取代。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但以下描述了合适的方法和材料。在发生冲突的情况下，将以包括定义在内的专利说明书为准。此外，所述材料、方法和例子仅是说明性的，而并非旨在是限制性的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变动、变化和取代。

在本申请的上下文中，除另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义：

如在整个说明书和权利要求中所用，术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”通常在它们意指“至少一个/至少一种”、“至少第一”、“一个或多个/一种或多种”或“多个/多种”所引用的组分或步骤的意义上使用，除非在之后具体说明上限的情况。例如，如本文所用，“切割序列”意指“至少第一切割序列”，但是包括多个切割序列。根据本申请，组合的可操作限制和参数以及任何单一药剂的量将是本领域普通技术人员已知的。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，通常是指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖经修饰的氨基酸聚合物，所述修饰例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化或任何其他操作(诸如与标记组分缀合)。

如本文在多肽结构的上下文中所用，“N末端”(或“氨基末端”)和“C末端”(或“羧基末端”)通常分别指多肽的极端氨基和羧基端。

如本文所用，关于目的多肽或目的多核苷酸序列的术语“N末端序列”通常意指在目的多肽或目的多核苷酸序列的N末端序列之前，在N末端处没有其他氨基酸或核苷酸残基。如本文所用，关于目的多肽或目的多核苷酸序列的术语“C末端序列”通常意指在目的多肽或目的多核苷酸序列的C末端序列之后，在C末端处没有其他氨基酸或核苷酸残基。

术语“非天然存在的”和“非天然的”在本文中可互换使用。如本文所用，关于治疗剂或预防剂的术语“非天然存在的”或“非天然的”通常意指所述药剂不是在哺乳动物(包括但不限于人)中生物衍生的。如应用于序列并且如本文所用，术语“非天然存在的”或“非天然的”意指与在哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不具有对应体、不互补或不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，当适当比对时，与天然序列相比，非天然存在的多肽或片段可以共享不超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更少的氨基酸序列同一性。

“生理条件”是指活宿主中的一组条件以及模拟活受试者的那些条件的体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经建立了许多用于体外测定的生理相关的条件。通常，生理缓冲液含有生理浓度的盐，并且调节至范围约6.5至约7.8并且优选约7.0至约7.5的中性pH。Sambrook等人(2001)中列出了多种生理缓冲液。生理相关温度范围为约25℃至约38℃并且优选约35℃至约37℃。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“缓和”或“改善”在本文中可互换使用。这些术语通常是指用于获得有益或所希望的结果的方法，所述结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处意指根除或改善所治疗的潜在障碍。另外，通过根除或改善一种或多种生理症状或改善与潜在障碍相关的一种或多种临床参数来实现治疗性益处，使得在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍患有潜在障碍。为了预防性益处，可以将组合物施用至具有发展特定疾病风险的受试者，或者施用至报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者，即使可能尚未对此疾病作出诊断。

如本文所用，“治疗性作用”或“治疗性益处”通常是指生理作用，包括但不限于减轻、改善或预防疾病或改善与人或其他动物中的潜在障碍相关的一种或多种临床参数，或以其他方式增强人或动物的身体或精神健康，这是由施用本公开文本的多肽引起的，而不是由诱导产生针对生物活性蛋白所具有的抗原表位的抗体的能力引起的。为了预防性益处，可以将组合物施用至具有发展特定疾病、先前疾病的复发、疾病的病症或症状风险的受试者，或者施用至报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者，即使可能尚未对此疾病作出诊断。

如本文所用，术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”通常是指单独的或作为多肽组合物的一部分的药物或生物活性蛋白的量，当以一个剂量或重复剂量施用至受试者时，所述量能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测的有益效果。这种效果不需要是绝对有益的。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

术语“当量摩尔剂量”通常意指基于剂量中使用的材料的分子量，施用至受试者的材料的量具有当量摩尔量。

如本文所用，术语“治疗有效且无毒的剂量”通常是指如本文所定义的组合物的可耐受剂量，所述可耐受剂量足够高以导致肿瘤或癌症细胞的消耗、肿瘤消除、肿瘤收缩或疾病稳定，而在受试者中没有或基本上没有主要毒性作用。此类治疗有效且无毒的剂量可以通过本领域所描述的剂量递增研究来确定，并且应当低于诱导重度不良副作用的剂量。

术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理条件。

当在化学基团的上下文中使用时：“氢”意指-H；“羟基”意指-OH；“氧代基”意指＝O；“羰基”意指-C(＝O)-；“羧基”意指-C(＝O)OH(也写为-COOH或-CO

在化学式的上下文中，符号“-”意指单键、“＝”意指双键，并且“≡”意指三键。符号

当基团“R”被描绘为环体系上的“浮动基团”时，例如，在下式中：

则只要形成稳定的结构，R可以替代附接至任何环原子的任何氢原子，包括所描绘的、隐含的或明确定义的氢。当基团“R”被描绘为稠环体系上的“浮动基团”时，例如在下式中：

则除非另有说明，否则R可以替代附接至稠环的任何环原子的任何氢。可替代的氢包括所描绘的氢(例如，在上式中附接至氮的氢)、隐含的氢(例如，未示出但应理解为存在的上式的氢)、明确定义的氢和其存在取决于环原子的身份的任选氢(例如，当X等于-CH-时，附接至基团X的氢)，只要形成稳定的结构即可。在描绘的例子中，R可以驻留在稠环体系的5元或6元环上。在上式中，紧接着封闭在括号中的基团“R”之后的下标字母“y”表示数值变量。除非另有说明，否则此变量可以是0、1、2或任何大于2的整数，仅受环或环体系的可替代氢原子的最大数量限制。

对于化学基团和化合物类别，基团或类别中碳原子的数量如下所指示：“Cn”定义了基团/类别中碳原子的确切数量(n)。“C≤n”定义了可以在基团/类别中的碳原子的最大数量(n)，对于所讨论的基团/类别，最小数量尽可能小，例如，应当理解，在基团“烯基

当用于修饰化合物或化学基团时，术语“饱和”意指没有碳-碳双键并且没有碳-碳三键，除了如下所指出。当所述术语用于修饰原子时，它意指所述原子不是任何双键或三键的一部分。在饱和基团的取代形式的情况下，可以存在一个或多个羰基氧双键或碳氮双键。并且当存在这样的键时，则不排除可以作为酮-烯醇互变异构或亚胺/烯胺互变异构的一部分出现的碳-碳双键。当术语“饱和”用于修饰物质的溶液时，它意指不再有这种物质可以溶解在这种溶液中。

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“脂肪族”表示如此修饰的化合物或化学基团是无环或环状的，而非芳族烃化合物或基团。在脂肪族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳族环(脂环)连接在一起。脂肪族化合物/基团可以是饱和的，即，通过单一碳-碳键连接(烷烃/烷基)，或是不饱和的，具有一个或多个碳-碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或多个碳-碳三键(炔烃/炔基)。

当用于修饰化合物或化学基团原子时，术语“芳族”意指化合物化学基团含有通过形成环的键的相互作用而稳定的平面不饱和原子环。

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烷基”是指具有碳原子作为附接点、直链或支链无环结构，并且没有除碳和氢以外的原子的单价饱和脂肪族基团。基团-CH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“环烷基”是指具有碳原子作为附接点(所述碳原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分)、没有碳-碳双键或三键并且没有除碳和氢之外的原子的单价饱和脂肪族基团。非限制性例子包括：-CH(CH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烯基”是指具有碳原子作为附接点、直链或支链无环结构、至少一个非芳族碳-碳双键、没有碳-碳三键并且没有除碳和氢之外的原子的单价不饱和脂肪族基团。非限制性例子包括：-CH＝CH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“炔基”是指具有碳原子作为附接点、直链或支链无环结构、至少一个碳-碳三键并且没有除碳和氢之外的原子的单价不饱和脂肪族基团。如本文所用，术语炔基不排除一个或多个非芳族碳-碳双键的存在。基团-C≡CH、-C≡CCH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“芳基”是指具有芳族碳原子作为附接点的单价不饱和芳族基团，所述碳原子形成一个或多个六元芳族环结构的一部分，其中环原子都是碳，并且其中组成所述基团的原子没有除碳和氢以外的原子。如果存在多于一个环，则环可以是稠合的或未稠合的。如本文所用，所述术语不排除附接至第一芳族环或存在的任何另外的芳族环的一个或多个烷基或芳烷基(碳数限制允许)的存在。芳基的非限制性例子包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C

“芳烃”是指具有式H-R的一类化合物，其中R是如上文所定义的术语芳基。苯和甲苯是芳烃的非限制性例子。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“芳烷基”是指单价基团-烷二基-芳基，其中术语烷二基和芳基各自以与上文提供的定义一致的方式使用。非限制性例子包括：苯甲基(苄基，Bn)和2-苯基-乙基。当术语芳烷基与“取代的”修饰语一起使用时，来自烷二基和/或芳基的一个或多个氢原子独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“杂芳基”是指具有芳族碳原子或氮原子作为附接点的单价芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中组成杂芳基的原子没有除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子。杂芳基环可以含有1、2、3或4个选自氮、氧和硫的环原子。如果存在多于一个环，则环可以是稠合的或未稠合的。如本文所用，所述术语不排除附接至芳族环或芳族环体系的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许)的存在。杂芳基的非限制性例子包括：呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(Im)、异噁唑基、甲基吡啶基、噁唑基、苯基吡啶基、吡啶基(pyridinyl/pyridyl)、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。术语“N-杂芳基”是指具有氮原子作为附接点的杂芳基。当在没有“取代的”修饰语的情况下，术语“杂芳烃二基”是指具有两个芳族碳原子、两个芳族氮原子或一个芳族碳原子和一个芳族氮原子作为两个附接点的二价芳族基团，所述原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中组成所述二价基团的原子没有除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子。如果存在多于一个环，则环可以是稠合的或未稠合的。未稠和的环可以经由以下中的一种或多种连接：共价键、烷二基、或烯二基(碳数限制允许)。如本文所用，所述术语不排除附接至芳族环或芳族环体系的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许)的存在。杂芳烃二基的非限制性例子包括：

“杂芳烃”是指具有式H-R的一类化合物，其中R是杂芳基。吡啶和喹啉是杂芳烃的非限制性例子。当这些术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“杂环烷基”是指具有碳原子或氮原子作为附接点的单价非芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中组成所述杂环烷基的原子没有除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子。杂环烷基环可以含有1、2、3或4个选自氮、氧或硫的环原子。如果存在多于一个环，则环可以是稠合的或未稠合的。如本文所用，所述术语不排除附接至环或环体系的一个或多个烷基(碳数限制允许)的存在。另外，所述术语不排除在环或环体系中存在一个或多个双键，条件是所得基团保持非芳族。杂环烷基的非限制性例子包括氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、四氢吡喃基、吡喃基、环氧乙烷基和氧杂环丁烷基。术语“N-杂环烷基”是指具有氮原子作为附接点的杂环烷基。N-吡咯烷基是这种基团的例子。当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“杂环烷二基”是指具有两个碳原子、两个氮原子或一个碳原子和一个氮原子作为两个附接点的二价环状基团，所述原子形成一个或多个环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中组成所述二价基团的原子没有除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子。如果存在多于一个环，则环可以是稠合的或未稠合的。未稠和的环可以经由以下中的一种或多种连接：共价键、烷二基、或烯二基(碳数限制允许)。如本文所用，所述术语不排除附接至环或环体系的一个或多个烷基(碳数限制允许)的存在。另外，所述术语不排除在环或环体系中存在一个或多个双键，条件是所得基团保持非芳族。杂环烷二基的非限制性例子包括：

当这些术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“酰基”是指基团-C(O)R，其中R是如上文所定义的那些术语氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳烷基或杂芳基。基团-CHO、-C(O)CH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烷氧基”是指基团-OR，其中R是如上文所定义的术语烷基。非限制性例子包括：-OCH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“烷基氨基”是指基团-NHR，其中R是如上文所定义的术语烷基。非限制性例子包括：-NHCH

当在没有“取代的”修饰语的情况下使用时，术语“二烷基氨基”是指基团-NRR'，其中R和R'可以是相同或不同的烷基，或R和R'可以一起表示烷二基。二烷基氨基的非限制性例子包括：-N(CH

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表达成分的量、反应条件等的所有数字应当理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据本申请试图获得的所希望的特性而变化。通常，如本文所用的术语“约”在指可测量的值(诸如重量、时间、剂量等的数量)时，意指涵盖在一个例子中指定量的±20％或±10％的变动、在另一个例子中指定量的±5％的变动、在另一个例子中指定量的±1％的变动并且在又另一个例子中指定量的±0.1％的变动，因此这样的变动适合于执行所公开的方法。

如在本申请中所用，术语“平均分子量”是指每种聚合物种类的摩尔数与此种类的摩尔质量之间的关系。特别地，每个聚合物分子可以具有不同的聚合水平，并且因此具有不同的摩尔质量。平均分子量可以用于表示多个聚合物分子的分子量。平均分子量与平均摩尔质量典型地是同义的。特别地，存在三种主要类型的平均分子量：数均摩尔质量、重(质)均摩尔质量和Z均摩尔质量。在本申请的上下文中，除非另有说明，否则平均分子量表示式的数均摩尔质量或重均摩尔质量。在一些实施方案中，平均分子量是数均摩尔质量。在一些实施方案中，平均分子量可以用于描述存在于脂质中的PEG组分。

术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态(诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”)也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有那些一个或多个步骤，并且还覆盖其他未列出的步骤。

如在说明书和/或权利要求中所用的术语，术语“有效”意指足以实现希望的、预期的或意图的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的上下文中使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意指当施用于受试者或患者以治疗疾病时，足以实现对疾病的这种治疗的化合物的量。

如本文所用，术语“IC

第一化合物的“异构体”是单独的化合物，其中每个分子含有与第一化合物相同的组成原子，但是这些原子在三维构型中不同。

如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活哺乳动物生物体，诸如人、猴、奶牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，所述患者或受试者是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)。在某些实施方案中，所述患者或受试者是人。人受试者的非限制性例子是成人、青少年、婴儿和胎儿。

如本文所用，术语“组装”或“组装的”在将有效载荷递送至一个或多个靶细胞的上下文中通常是指一种或多种共价或非共价相互作用或缔合，例如，使得治疗剂或预防剂与脂质组合物复合或包封在脂质组合物中。

如本文所用，术语“脂质组合物”通常是指包含一种或多种脂质化合物的组合物，所述脂质化合物包括但不限于阳离子脂质体/核酸复合物(lipoplex)、脂质体、脂质颗粒。脂质组合物的例子包括悬浮液、乳液和囊泡组合物。

例如，如本文所用，“RTX0001”是指本文测试的示例脂质组合物。RTX0001是包含约19.05％4A3-SC7(可电离阳离子脂质)、约20％ DODAP(SORT脂质)、约19.05％DOPE、约38.9％胆固醇和约3.81％ DMG-PEG(PEG缀合的脂质)的5组分脂质纳米颗粒组合物，其中每种脂质组分被定义为占总脂质组合物的mol％。

又例如，如本文所用，“RTX0004”是指本文测试的示例脂质组合物。RTX0004是包含约23.81％5A2-SC8(可电离阳离子脂质)、约23.81％ DOPE、约47.62％胆固醇和约4.76％DMG-PEG(PEG缀合的脂质)的4组分脂质纳米颗粒组合物，其中每种脂质组分被定义为占总脂质组合物的mol％。

又例如，如本文所用，“RTX0051”是指本文测试的示例脂质组合物。RTX0051是包含约19.05％4A3-SC7(可电离阳离子脂质)、约20％14:0EPC(SORT脂质)、约19.05％DOPE、约38.9％胆固醇和约3.81％ DMG-PEG(PEG缀合的脂质)的5组分脂质纳米颗粒组合物，其中每种脂质组分被定义为占总脂质组合物的mol％。

再又例如，如本文所用，“RTX0052”是指本文测试的示例脂质组合物。RTX0052是包含约19.05％4A3-SC7(可电离阳离子脂质)、约20％14:0TAP(SORT脂质)、约19.05％ DOPE、约38.9％胆固醇和约3.81％ DMG-PEG(PEG缀合的脂质)的5组分脂质纳米颗粒组合物，其中每种脂质组分被定义为占总脂质组合物的mol％。

如本文所用，术语“可检测的”是指可通过观察或通过仪器直接或间接检测的信号的发生或变化。典型地，可检测的响应是信号的发生，其中荧光团是固有荧光，并且在结合至金属离子或生物化合物时不产生信号变化。可替代地，可检测的响应是光学响应，所述光学响应导致波长分布图或者吸光度或荧光的强度的变化或光散射、荧光寿命、荧光偏振或上述参数的组合的变化。其他可检测的响应包括，例如，化学发光、磷光、放射性同位素辐射、磁吸引力和电子密度。

如本文所用，与一种或多种治疗剂的递送相关的术语“有效力的”或“效力”通常是指递送系统(例如，脂质组合物)在细胞(例如，靶细胞)中在任何可测量程度(例如，相对于参考递送系统)上实现或带来治疗剂或预防剂的希望的量、活性或效果(诸如蛋白质或基因的翻译、转录、产生、表达或活性的希望水平)的更大能力。例如，具有较高效力的脂质组合物可以在更大的相关细胞群体中、在较短的响应时间内或持续较长的时间段内实现希望的治疗性作用。

如本文通常使用，“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

“药学上可接受的盐”意指如上文所定义的药学上可接受的本申请化合物的盐，并且具有所希望的药理活性。此类盐包括与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸诸如1,2-乙基二磺酸、2-羟基乙基磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、乙酸、脂肪族单羧酸和二羧酸、脂肪族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙基磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲基磺酸、己二烯二酸、o-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括当存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。应当认识到，形成本公开文本的任何盐的一部分的特定阴离子或阳离子不是关键的，只要盐作为整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐以及它们的制备和使用方法的另外的例子呈现于Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use(P.H.Stahl&C.G.Wermuth编辑,Verlag Helvetica Chimica Acta,2002)中。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指参与携带或运输化学药剂的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。

“预防(prevention)”或“预防(preventing)”包括：(1)抑制受试者或患者的疾病的发作，所述受试者或患者可能处于疾病的风险中和/或易患所述疾病，但是尚未经历或显示出所述疾病的任何或所有病理或症状，和/或(2)减缓受试者或患者的疾病的病理或症状的发作，所述受试者或患者可能处于风险中和/或易患所述疾病，但是尚未经历或显示出所述疾病的任何或所有病理或症状。

“重复单元”是某些材料(例如，框架和/或聚合物)的最简单结构实体，无论是有机的、无机的还是金属有机的。在聚合物链的情况下，重复单元沿着链连续地连接在一起，像项链的珠子一样。例如，在聚乙烯-[-CH

“立体异构体”或“旋光异构体”是给定化合物的异构体，其中相同的原子键合至相同的其他原子，但是其中这些原子在三维构型中不同。“对映异构体”是给定化合物的立体异构体，其彼此为镜像，像左手和右手一样。“非对映异构体”是给定化合物的非对映异构体的立体异构体。手性分子含有手性中心，也称为立构中心或立体异构源中心，其是携带基团的分子中的任何点，但不一定是原子，使得任何两个基团的互换导致立体异构体。在有机化合物中，手性中心典型地是碳、磷或硫原子，但其他原子也可能是有机和无机化合物中的立构中心。分子可以具有多个立构中心，从而得到许多立体异构体。在立体异构现象是由于四面体立体异构源中心(例如，四面体碳)的化合物中，假设可能的立体异构体的总数将不超过2

“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括(1)抑制经历或显示出疾病的病理或症状的受试者或患者的疾病(例如，阻止病理和/或症状的进一步发展)，(2)改善正在经历或显示出疾病的病理或症状的受试者或患者的疾病(例如，逆转病理和/或症状)，和/或(3)经历或显示出疾病的病理或症状的受试者或患者发生疾病的任何可测量减少。

上述定义取代通过引用并入本文的任何参考文献中的任何冲突定义。然而，某些术语被定义的事实不应被认为表明任何未定义的术语是不确定的。相反，所使用的所有术语被认为以术语描述本公开文本，使得普通技术人员可以理解本申请的范围和实践。

组合物

脂质组合物

在一方面，本文提供了脂质组合物，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；和(iii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。

可电离阳离子脂质

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述阳离子可电离脂质含有一个或多个在生理pH下质子化但是可以在高于8、9、10、11或12的pH下去质子化并且不具有电荷的基团。可电离阳离子基团可以含有一种或多种能够在生理pH下形成阳离子基团的可质子化胺。阳离子可电离脂质化合物还可以进一步包含一种或多种脂质组分，诸如两种或更多种具有C

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，可电离阳离子脂质是指具有可获得电荷(pKa)的氮原子的脂质和脂质样分子。这些脂质在文献中可以称为阳离子脂质。这些具有氨基的分子典型地具有在2与6条之间的疏水链，经常是烷基或烯基(诸如C

虽然树枝状聚合物是聚合物，但是树枝状聚合物可能比传统聚合物更优选，因为它们具有可控的结构、单一的分子量、许多并且可控的表面官能团，并且传统上在达到特定代后采用球状构型。树枝状聚合物可以通过每个重复单元的顺序反应以产生单分散、树样和/或代结构的聚合物结构来制备。单独的树枝状聚合物由中心核心分子以及与该中心核心上的一个或多个功能位点附接的树枝状楔形物组成。根据在制备期间使用的组装单体，树枝状聚合物表面层可以具有设置在其上的各种官能团，包括阴离子、阳离子、亲水或亲脂基团。

改变核心、重复单元和表面或终止基团的官能团和/或化学特性，可以调节它们的物理特性。可以改变的一些特性包括但不限于溶解度、毒性、免疫原性和生物附着能力。树枝状聚合物通常通过它们的代或分支中重复单元的数量来描述。仅由核心分子组成的树枝状聚合物被称为第0代，而沿着所有分支的每个连续重复单元是第1代、第2代等，直到终止或表面基团。在一些实施方案中，半代可能仅由与胺的第一缩合反应而不是与硫醇的第二缩合反应产生。

树枝状聚合物的制备需要通过一系列逐步反应实现的合成控制水平，所述逐步反应包括通过每个连续基团构建树枝状聚合物。树枝状聚合物合成可以是收敛型或发散型的。在发散树枝状聚合物合成过程中，在逐步过程中从核心到外围来组装分子，所述逐步过程涉及将一代附接至前一代，并且然后改变用于下一反应阶段的官能团。官能团转化对于防止不受控制的聚合是必要的。这样的聚合将导致高度支化的分子，所述高度支化的分子不是单分散的而另外被称为超支化聚合物。由于空间效应，继续反应树枝状聚合物重复单元导致球体形或球状分子，直到空间过度拥挤阻止在特定代中的完全反应并且破坏分子的单分散性。因此，在一些实施方案中，具体考虑了G1-G10代的树枝状聚合物。在一些实施方案中，树枝状聚合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复单元或其中可衍生的任何范围。在一些实施方案中，本文所用的树枝状聚合物是G0、G1、G2或G3。然而，可以通过减少分支聚合物中的间隔单元来增加可能的代的数量(诸如11、12、13、14、15、20或25)。

此外，树枝状聚合物具有两种主要化学环境：在终止代上由特定表面基团产生的环境；和树枝状结构的内部，所述树枝状结构的内部由于更高级的结构而可以被屏蔽于本体介质和表面基团。由于这些不同的化学环境，树枝状聚合物已经发现了许多不同的潜在用途，包括在治疗性应用中。

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，使用丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基团与胺和硫醇的差别反应性组装树枝状聚合物或树枝基元。树枝状聚合物或树枝基元可以包括通过使丙烯酸酯基团与伯胺或仲胺以及甲基丙烯酸酯与巯基反应而形成的仲胺或叔胺和硫醚。另外，树枝状聚合物或树枝基元的重复单元可以含有在生理条件下可降解的基团。在一些实施方案中，这些重复单元可以含有一个或多个生发性二醚、酯、酰胺或二硫化物基团。在一些实施方案中，核心分子是允许仅在一个方向上进行树枝状聚合的单胺。在其他实施方案中，核心分子是具有多个不同树枝状分支的多胺，每个树枝状分支包含一个或多个重复单元。树枝状聚合物或树枝基元通过从此核心除去一个或多个氢原子来形成。在一些实施方案中，这些氢原子在杂原子(诸如氮原子)上。在一些实施方案中，终止基团是亲脂基团(诸如长链烷基或烯基)。在其他实施方案中，终止基团是长链卤代烷基或卤代烯基。在其他实施方案中，终止基团是含有可电离基团(诸如胺(-NH

本申请的阳离子可电离脂质可以含有一个或多个不对称取代的碳或氮原子，并且可以以光学活性或外消旋形式分离。因此，化学式的所有手性、非对应异构体、外消旋形式、差向异构体形式和所有几何异构体形式都是预期的，除非具体指示特定的立体化学或异构体形式。阳离子可电离脂质可以作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物以及单独的非对映异构体出现。在一些实施方案中，获得单一非对映异构体。本申请阳离子可电离脂质的手性中心可以具有S或R构型。此外，考虑了一种或多种阳离子可电离脂质可以作为构造异构体存在。在一些实施方案中，化合物具有相同的式，但与核心的氮原子具有不同的连接性。不希望受任何理论束缚，据信存在此类阳离子可电离脂质，因为起始单体首先与伯胺反应，并且然后在统计学上与存在的任何仲胺反应。因此，构造异构体可以存在完全反应的伯胺，并且然后是反应的仲胺的混合物。

用于表示本申请阳离子可电离脂质的化学式将典型地仅显示可能的几种不同互变异构体中的一种。例如，已知许多类型的酮基与相应的烯醇基团平衡存在。类似地，许多类型的亚胺基团与烯胺基团平衡存在。无论描绘了给定化学式的哪种互变异构体并且无论哪一种是最普遍的，给定化学式的所有互变异构体都是预期的。

本申请的阳离子可电离脂质还可以具有以下优点：它们可以比现有技术中已知的化合物更有效、毒性更小、作用更长、效力更强、产生更少的副作用、更容易吸收和/或具有更好的药代动力学特征(例如，更高的口服生物利用度和/或更低的清除率)和/或具有其他有用的药理学、物理或化学特性，无论是用于本文所述的适应证还是其他方面。

另外，构成本申请阳离子可电离脂质的原子旨在包括此类原子的所有同位素形式。如本文所用，同位素包括具有相同原子序数但是不同质量数的那些原子。作为一般例子并且没有限制，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括

应当认识到，形成本文提供的阳离子可电离脂质的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子不是关键的，只要盐作为整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐以及它们的制备和使用方法的另外的例子呈现于Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use(2002)中，将所述文献通过引用并入本文。

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是树枝状聚合物或树枝基元。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质包含在生理pH下带正电荷的并且含有至少两个疏水基团的铵基团。在一些实施方案中，所述铵基团在约6至约8的pH下带正电荷。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是树枝状聚合物或树枝基元。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质包含至少两个C

式(I)的树枝状聚合物或树枝基元

在脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质包含至少两个C

核心-重复单元-终止基团(D-I)

其中所述核心重复单元通过从核心除去一个或多个氢原子并且用重复单元替代所述原子而连接至重复单元，并且其中：

所述核心具有式：

其中：

a是1、2、3、4、5或6；或

所述核心具有式：

其中：

y是0、1或2，条件是y和z的总和是3；

b是1、2、3、4、5或6；并且

z是1、2、3；条件是z和y的总和是3；或

所述核心具有式：

其中：

e和f各自独立地是1、2或3；条件是e和f的总和是3；

c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或

核心是烷基胺

其中重复单元包含可降解二酰基和接头；

所述可降解二酰基具有式：

其中：

接头基团具有式：

其中：

其中当重复单元包含接头基团时，那么如果n大于1，则接头基团包含附接至接头基团的氮原子和硫原子两者的独立的可降解二酰基，其中重复单元中的第一基团是可降解二酰基，其中对于每个接头基团，下一个重复单元包含两个附接至接头基团的氮原子的可降解二酰基；并且其中n是存在于重复单元中的接头基团的数量；并且

所述终止基团具有式：

其中：

芳基

其中链中的最终可降解二酰基附接至终止基团；

n是0、1、2、3、4、5或6；

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，终止基团进一步由下式定义：

其中：

在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝基元的一些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：

其中：

y是0、1或2，条件是y和z的总和是3；

b是1、2、3、4、5或6；并且

z是1、2、3；条件是z和y的和是3。

在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝基元的一些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：

其中：

e和f各自独立地是1、2或3；条件是e和f的总和是3；

c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6。

在式(I)的树枝状聚合物或树枝基元的一些实施方案中，所述终止基团由下式表示：

其中：

在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝基元的一些实施方案中，所述核心进一步定义为：

在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝基元的一些实施方案中，所述可降解二酰基进一步定义为：

在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝基元的一些实施方案中，所述接头进一步定义为

其中Y

在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝基元的一些实施方案中，所述树枝状聚合物或树枝基元选自：

及其药学上可接受的盐。

式(X)的树枝状聚合物或树枝基元

在脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是式核心-(分支)

在脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是具有以下结构式的(g)代的树枝状聚合物或树枝基元：

或其药学上可接受的盐，其中：

(a)所述核心包含结构式(X

其中：

Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR

可替代地，L

(b)所述多个(N)分支中的每个分支独立地包含结构式(X

其中：

*指示所述分支与所述核心的附接点；

g是1、2、3或4；

Z＝2

当g＝1时，G＝0；或当g≠1时，

(c)每个二酰基独立地包含结构式

*指示所述二酰基在其近端的附接点；

**指示所述二酰基在其远端的附接点；

(d)每个接头基团独立地包含结构式

其中：

**指示所述接头与近侧二酰基的附接点；

***指示所述接头与远侧二酰基的附接点；并且

(e)每个终止基团独立地选自任选经取代的(例如，C

在X

表1.示例性核心结构

在X

及其药学上可接受的盐，其中*指示核心与多个分支中的一个分支的附接点或H。在一些实施方案中，其中*指示核心与多个分支中的一个分支的附接点。

在X

在一些实施方案中，所述多个(N)分支包括至少3个分支、至少4个分支、至少5个分支。在一些实施方案中，所述多个(N)分支包括至少3个分支。在一些实施方案中，所述多个(N)分支包括至少4个分支。在一些实施方案中，所述多个(N)分支包括至少5个分支。

在X

在一些实施方案中，本文所述的具有代(g)＝1的树枝状聚合物或树枝基元具有以下结构：

本文针对1-4代所述的树枝状聚合物或树枝基元的示例性公式化表述在表2中示出。可以基于g计算二酰基、接头基团和终止基团的数量。

表2.基于(g)代的树枝状聚合物或树枝基元基团的公式化表述

在一些实施方案中，二酰基独立地包含结构式

在X

在二酰基的一些实施方案中，A

在二酰基的一些实施方案中，二酰基在每次出现时独立地包含结构式

在一些实施方案中，接头基团独立地包含结构式

在X

表3.示例性终止基团/外围结构

在一些实施方案中，式(X)的树枝状聚合物或树枝基元选自表4中阐述的那些及其药学上可接受的盐。

表4.示例性可电离阳离子脂质-树枝状聚合物或脂质-树枝基元

其他可电离阳离子脂质

在脂质组合物的一些实施方案中，所述阳离子脂质包含结构式(D-I’)：

其中：

a是1，并且b是2、3或4；或可替代地，b是1，并且a是2、3或4；

m是1，并且n是1；或可替代地，m是2，并且n是0；或可替代地，m是2，并且n是1；并且

条件是R

其中式(D-I’)中所指示的一个或多个氮原子可以被质子化，以提供阳离子脂质。

在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，a是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，b是2。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，m是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，n是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，R

在一些实施方案中，式(D-I’)的阳离子脂质是13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇：

在一些实施方案中，式(D-I’)的阳离子脂质是(11R,25R)-13,16,20-三((R)-2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇：

可用于本申请组合物和方法的另外的阳离子脂质包括如在J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217和国际专利公开案WO 2010/144740、WO 2013/149140、WO 2016/118725、WO 2016/118724、WO 2013/063468、WO 2016/205691、WO 2015/184256、WO2016/004202、WO 2015/199952、WO 2017/004143、WO 2017/075531、WO 2017/117528、WO2017/049245、WO 2017/173054和WO 2015/095340中所述的那些阳离子脂质，出于所有目的，将所述文献和专利通过引用并入本文。那些可电离阳离子脂质的例子包括但不限于如表5中所示的那些。

表5：示例性可电离阳离子脂质

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质以约20至约23的量存在。在一些实施方案中，摩尔百分比为约20、20.5、21、21.5、22、22.5至约23或其中可衍生的任何范围。在其他实施方案中，摩尔百分比为约7.5至约20。在一些实施方案中，摩尔百分比为约7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19至约20或其中可衍生的任何范围。

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的可电离阳离子脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约25％的可电离阳离子脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约20％的可电离阳离子脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约20％的可电离阳离子脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约30％的可电离阳离子脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)5％、至少(约)10％、至少(约)15％、至少(约)20％、至少(约)25％或至少(约)30％的可电离阳离子脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)5％、至多(约)10％、至多(约)15％、至多(约)20％、至多(约)25％或至多(约)30％的可电离阳离子脂质。

选择性器官靶向(SORT)脂质

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，将所述脂质(例如，纳米颗粒)组合物优先递送至靶器官。在一些实施方案中，所述靶器官是肺、肺组织或肺细胞。如本文所用，术语“优先递送”用于指组合物在递送时，将其以施用量的至少25％(例如，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％)递送至靶器官(例如，肺)、组织或细胞。

在脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含一种或多种选择性器官靶向(SORT)脂质，所述选择性器官靶向(SORT)脂质导致组合物选择性递送至特定器官。在一些实施方案中，所述SORT脂质可以具有两个或更多个C

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质包含永久带正电荷的部分。永久带正电荷的部分可以在生理pH下带正电荷，使得在将多核苷酸递送至细胞时，SORT脂质包含正电荷。在一些实施方案中，带正电荷的部分是季胺或季铵离子。在一些实施方案中，所述SORT脂质包含反离子，或以其他方式与反离子复合，或与反离子相互作用。

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是永久阳离子脂质(即，包含一种或多种疏水组分和一种永久阳离子基团)。所述永久阳离子脂质可以含有具有正电荷(无关pH如何)的基团。可以用于永久阳离子脂质的一个永久阳离子基团是季铵基团。永久阳离子脂质可以包含结构式：

条件是Y

在SORT脂质的一些实施方案中，所述永久阳离子SORT脂质具有结构式：

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是可电离阳离子脂质(即，包含一种或多种疏水组分和可电离阳离子基团)。可电离带正电荷的部分可以在生理pH下带正电荷。可以用于可电离阳离子脂质的一种可电离阳离子基团是叔胺基团。在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质包含特定结构的头基。在一些实施方案中，所述SORT脂质包含具有以下结构式的头基：

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质包含接头(L)。在一些实施方案中，L是

p和q各自独立地是1、2或3；并且

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：

X-是单价阴离子。

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是磷脂酰胆碱(例如，14:0EPC)。在一些实施方案中，所述磷脂酰胆碱化合物进一步定义为：

X-是单价阴离子。

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质。在一些实施方案中，所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。举例来说，乙基磷酸胆碱可以是但不限于1,2-二肉豆蔻烯酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱。

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：

X-是单价阴离子。

举例来说，但不限于此，前一段的结构式的SORT脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)(例如，氯化物盐)。

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：

举例来说，但不限于此，前一段的结构式的SORT脂质是二甲基双十八烷基铵(DDAB)(例如，溴化物盐)。

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：

X-是单价阴离子。

举例来说，但不限于此，前一段的结构式的SORT脂质是N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是阴离子脂质。在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：

其中：

在脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质包含一种或多种选自表6中阐述的脂质。

表6.示例性SORT脂质

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约65％的SORT脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约25％至约60％的SORT脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约30％至约55％的SORT脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约50％的SORT脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约30％至约60％的SORT脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约25％至约60％的SORT脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)25％、至少(约)30％、至少(约)35％、至少(约)40％、至少(约)45％、至少(约)50％、至少(约)55％、至少(约)60％或至少(约)65％的SORT脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)25％、至多(约)30％、至多(约)35％、至多(约)40％、至少(约)45％、至多(约)50％、至多(约)55％、至多(约)60％或至多(约)65％的SORT脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％或前述值中的任何两个之间(包括端值)的范围的SORT脂质。

另外的脂质

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含另外的脂质，包括但不限于类固醇或类固醇衍生物、PEG脂质和磷脂。

磷脂或其他两性离子脂质

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。在一些实施方案中，所述磷脂可以含有一条或两条长链(例如，C

在脂质组合物的一些实施方案中，磷脂不是乙基磷酸胆碱。

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述组合物可以进一步包含摩尔百分比为总脂质组合物的约20至约23的磷脂。在一些实施方案中，摩尔百分比为约20、20.5、21、21.5、22、22.5至约23或其中可衍生的任何范围。在其他实施方案中，摩尔百分比为约7.5至约60。在一些实施方案中，摩尔百分比为约7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19至约20或其中可衍生的任何范围。

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约8％至约23％的磷脂。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约20％的磷脂。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约20％的磷脂。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约8％至约15％的磷脂。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约15％的磷脂。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约12％至约18％的磷脂。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)8％、至少(约)10％、至少(约)12％、至少(约)15％、至少(约)18％、至少(约)20％或至少(约)23％的磷脂。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)8％、至多(约)10％、至多(约)12％、至多(约)15％、至多(约)18％、至多(约)20％或至多(约)23％的磷脂。

类固醇或类固醇衍生物

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含类固醇或类固醇衍生物。在一些实施方案中，所述类固醇或类固醇衍生物包含任何类固醇或类固醇衍生物。如本文所用，在一些实施方案中，术语“类固醇”是一类具有四环17碳环状结构的化合物，所述环状结构可以进一步包含一个或多个取代，所述取代包括烷基、烷氧基、羟基、氧代基、酰基、或在两个或更多个碳原子之间的双键。在一方面，所述类固醇的环结构包含三个稠合环己基环和稠合环戊基环，如在下式中所示：

在脂质组合物的一些实施方案中，所述组合物可以进一步包含摩尔百分比为总脂质组合物的约40至约46的类固醇。在一些实施方案中，摩尔百分比为约40、41、42、43、44、45至约46或其中可衍生的任何范围。在其他实施方案中，类固醇相对于总脂质组合物的摩尔百分比为约15至约40。在一些实施方案中，摩尔百分比为15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40，或其中可衍生的任何范围。

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约46％的类固醇或类固醇衍生物。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约40％的类固醇或类固醇衍生物。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约25％至约35％的类固醇或类固醇衍生物。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约30％至约40％的类固醇或类固醇衍生物。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约30％的类固醇或类固醇衍生物。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)15％、至少(约)20％、至少(约)25％、至少(约)30％、至少(约)35％、至少(约)40％、至少(约)45％或至少(约)46％的类固醇或类固醇衍生物。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)15％、至多(约)20％、至多(约)25％、至多(约)30％、至多(约)35％、至多(约)40％、至多(约)45％或至多(约)46％的类固醇或类固醇衍生物。

聚合物缀合的脂质

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含聚合物缀合的脂质。在一些实施方案中，所述聚合物缀合的脂质是PEG脂质。在一些实施方案中，所述PEG脂质是甘油二酯，所述甘油二酯也包含附接至甘油基团的PEG链。在其他实施方案中，所述PEG脂质是含有用PEG链附接至接头基团的一个或多个C

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述PEG脂质具有结构式：

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述组合物进一步包含摩尔百分比为总脂质组合物的约4.0至约4.6的PEG脂质。在一些实施方案中，摩尔百分比为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5至约4.6或其中可衍生的任何范围。在其他实施方案中，摩尔百分比为约1.5至约4.0。在一些实施方案中，摩尔百分比为约1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75至约4.0或其中可衍生的任何范围。

在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约0.5％至约10％的聚合物缀合的脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约1％至约10％的聚合物缀合的脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约2％至约10％的聚合物缀合的脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约1％至约8％的聚合物缀合的脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约2％至约7％的聚合物缀合的脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约3％至约5％的聚合物缀合的脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约10％的聚合物缀合的脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)0.5％、至少(约)1％、至少(约)1.5％、至少(约)2％、至少(约)2.5％、至少(约)3％、至少(约)3.5％、至少(约)4％、至少(约)4.5％、至少(约)5％、至少(约)5.5％、至少(约)6％、至少(约)6.5％、至少(约)7％、至少(约)7.5％、至少(约)8％、至少(约)8.5％、至少(约)9％、至少(约)9.5％或至少(约)10％的聚合物缀合的脂质。在本申请脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)0.5％、至多(约)1％、至多(约)1.5％、至多(约)2％、至多(约)2.5％、至多(约)3％、至多(约)3.5％、至多(约)4％、至多(约)4.5％、至多(约)5％、至多(约)5.5％、至多(约)6％、至多(约)6.5％、至多(约)7％、至多(约)7.5％、至多(约)8％、至多(约)8.5％、至多(约)9％、至多(约)9.5％或至多(约)10％的聚合物缀合的脂质。

药物组合物

治疗剂或预防剂

在另一方面，本文提供了包含用如本文所述脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)的药物组合物。

在药物组合物的一些实施方案中，所述治疗剂(或预防剂)包含化合物、多核苷酸、多肽或其组合。在一些实施方案中，所述化合物、多核苷酸、多肽或其组合对于通过本文所述药物组合物治疗的细胞或受试者而言是外源性的或异源的。在一些实施方案中，所述治疗剂(或预防剂)包含本文所述的化合物。在一些实施方案中，所述治疗剂(或预防剂)包含本文所述的多核苷酸。在一些实施方案中，所述治疗剂(或预防剂)包含本文所述的多肽。在一些实施方案中，所述治疗剂(或预防剂)包含化合物、多核苷酸、多肽或其组合。

在一些实施方案中，所述药物组合物包含用于治疗肺病(诸如哮喘、COPD或肺癌)的治疗剂(或预防剂)。在一些实施方案中，所述治疗剂(或预防剂)包含类固醇(诸如泼尼松、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙或地塞米松)。在一些实施方案中，所述治疗剂(或预防剂)包含白蛋白结合型紫杉醇、阿法替尼二马来酸盐、艾菲尼托(Afinitor)、AfinitorDisperz、艾乐替尼(Alecensa)、阿来替尼、爱宁达、奥朗格(Alunbrig)、阿特利珠单抗、安维汀(Avastin)、贝伐单抗、布格替尼、盐酸卡马替尼(Capmatinib Hydrochloride)、卡铂、塞瑞替尼、克唑替尼、雷莫卢单抗、甲磺酸达拉非尼、达克替尼、多西他赛、盐酸多柔比星、度伐鲁单抗、恩曲替尼、盐酸厄洛替尼、依维莫司、加夫雷托(Gavreto)、吉非替尼、吉泰瑞(Gilotrif)、吉西他滨、伊匹单抗、易瑞沙(Iressa)、可瑞达(Keytruda)、劳拉替尼(Lorbrena)、迈吉宁(Mekinist)、甲氨蝶呤钠、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、纳武单抗、甲磺酸奥希替尼、紫杉醇、派姆单抗、培美曲塞二钠、普拉替尼(Pralsetinib)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、赛普替尼(Retevmo)、塞尔帕替尼(Selpercatinib)、Tabrecta、泰菲乐(Tafinlar)、泰瑞沙(Tagrisso)、曲美替尼二甲基亚砜、多泽润(Vizimpro)、酒石酸长春瑞滨、赛可瑞(Xalkori)、逸沃(Yervoy)、Zirabev、赞可达(Zykadia)、卡铂、吉西他滨-顺铂、艾菲尼托、阿特利珠单抗、度伐鲁单抗、磷酸依托泊苷(Etopophos)、依托泊苷(Etoposide)、和美新(Hycamtin)、英飞凡(Imfinzi)、可瑞达、卢比克替定(Lurbinectedin)、甲氨蝶呤钠、纳武单抗、欧狄沃(Opdivo)、派姆单抗、特善奇(Tecentriq)、拓扑替康盐酸盐、特伦苏(Trexall)或Zepzelca。包含化合物的治疗剂(或预防剂)的其他非限制性例子包括选自以下的小分子：7-甲氧基蝶啶、7-甲基蝶啶、阿巴卡韦、阿巴芬净、阿巴瑞克、醋丁洛尔、苊、对乙酰氨基酚、乙酰苯胺、乙酰唑胺、乙酰苯磺酰环己脲、阿曲汀、阿伐斯汀、腺嘌呤、腺苷、阿拉曲沙星、阿苯达唑、沙丁胺醇、阿氯芬酸、阿地白介素、阿仑妥珠单抗、阿夫唑嗪、阿利维A酸、二烯丙巴比妥、别嘌呤醇、全反式维甲酸(ATRA)、阿洛普令、阿普唑仑、阿普洛尔、六甲蜜胺、氨磷汀、阿米洛利、氨鲁米特、氨基比林、胺碘酮HCl、阿米替林、氨氯地平、异戊巴比妥、氨酚喹、阿莫沙平、安非他明、两性霉素、两性霉素B、氨苄青霉素、安普那韦、安吖啶、硝酸戊酯、异戊巴比妥、阿那曲唑、氨力农、蒽、蒽环类、阿普比妥、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿司匹林、阿司咪唑、阿替洛尔、阿托伐他汀、阿托伐醌、阿特拉津、阿托品、阿托品硫唑嘌呤、金诺芬、阿扎胞苷、阿扎丙宗、硫唑嘌呤、阿嗪米特、阿奇霉素、氨曲南、氯苯氨丁酸、巴比妥、活BCG、贝克拉胺、倍氯米松、苄氟噻嗪、苯那普利(benezepril)、贝尼地平、贝诺酯、苯哌利多、苯他西泮、苯甲酰胺、苯并蒽、苄星青霉素、苯海索HCl、苄硝唑、苯二氮

多核苷酸

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)包含一种或多种多核苷酸。本申请的范围不限于任何特定的多核苷酸来源、序列或类型；然而，本领域普通技术人员可以容易地鉴定多核苷酸的各种其他来源的相关同源物，包括来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猴、长臂猿、黑猩猩、类人猿、狒狒、奶牛、猪、马、绵羊、猫和其他物种)的核酸。考虑了本申请中使用的多核苷酸可以包含基于天然存在的序列的序列。考虑到遗传密码的简并性，序列具有至少约50％、通常至少约60％、更通常约70％、最通常约80％、优选至少约90％并且最优选约95％与天然存在的序列的核苷酸序列相同的核苷酸。在另一个实施方案中，多核苷酸包含与天然存在的序列互补或与天然存在的序列的75％、80％、85％、90％、95％和100％互补的核酸序列。本文考虑了编码250、500、1000、1212、1500、2000、2500、3000或更长的更长多核苷酸。

在一些实施方案中，本文使用的多核苷酸可以衍生自基因组DNA，即，直接从特定生物体的基因组克隆。然而，在优选的实施方案中，多核苷酸将包含互补DNA(cDNA)。还考虑了cDNA加上天然内含子或衍生自另一个基因的内含子；这样的工程化分子有时被称为“小基因(mini-gene)”。至少，本申请的这些和其他核酸可以用作例如凝胶电泳中的分子量标准。术语“cDNA”旨在是指使用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。与基因组DNA或从基因组、非加工或部分加工的RNA模板聚合的DNA相反，使用cDNA的优点是cDNA主要含有对应蛋白质的编码序列。有时可能优选完整或部分基因组序列，诸如在非编码区是最佳表达所需的情况下或在反义策略中靶向非编码区(诸如内含子)的情况下。

在一些实施方案中，多核苷酸包含一个或多个区段，所述区段包含小干扰核糖核酸(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小核糖核酸(miRNA)、初级微小核糖核酸(pri-miRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关核酸、CRISPR-RNA(crRNA)、单指导核糖核酸(sgRNA)、反式激活CRISPR核糖核酸(tracrRNA)、质粒脱氧核糖核酸(pDNA)、转移核糖核酸(tRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、反义核糖核酸(RNA)、指导核糖核酸、脱氧核糖核酸(DNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、单链核糖核酸(ssRNA)或双链核糖核酸(dsRNA)。在一些实施方案中，多核苷酸编码本文所述的至少一种治疗剂(或预防剂)。在一些实施方案中，多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸(诸如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA))，用于与本文所述的指导RNA指导的核酸酶复合。在一些实施方案中，多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸指导的异源核酸酶。核酸酶可以是核酸内切酶。指导多核苷酸指导的异源核酸内切酶的非限制性例子可以选自CRISPR相关(Cas)蛋白质或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)；兆核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白(例如，原核Argonaute(pAgo)、古生菌Argonaute(aAgo)、真核Argonaute(eAgo)和格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(Natronobacterium gregoryi Argonaute)(NgAgo))；作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；CIRT、PUF、归巢核酸内切酶或其任何功能片段、其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。

在一些实施方案中，治疗(或预防)剂是转移核糖核酸(tRNA)，所述转移核糖核酸将氨基酸引入靶基因的蛋白质的生长肽链中。靶基因可以是表7中列出的靶基因。

表7.用于转移RNA疗法的示例性靶基因

本文提供的治疗剂(或预防剂)的一些实施方案包括包含致动部分的异源多肽。所述致动部分可以被配置为与对应于靶基因的靶多核苷酸复合。在一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)的施用导致靶基因的表达或活性改变。可以例如在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺上皮细胞中、在所述受试者的至少约2％、5％或10％的肺纤毛细胞中、在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺分泌细胞中、在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺棒状细胞中、在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺杯状细胞中、或在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺基底细胞、或在其组合中可检测到靶基因的表达或活性改变。用于表征细胞类型的生物标记物在本领域中可能是已知的，诸如下文在实施例部分中描述的那些。所述治疗剂(或预防剂)可以包含编码致动部分的异源多核苷酸。所述致动部分可以被配置为与对应于靶基因的靶多核苷酸复合。所述异源多核苷酸可以编码被配置为将致动部分引导至靶多核苷酸的指导多核苷酸。所述致动部分可以包含异源核酸内切酶或其片段(例如，通过指导多核苷酸引导以特异性结合靶多核苷酸)。所述异源核酸内切酶可以是(1)核糖核蛋白(RNP)的一部分和(2)与指导多核苷酸复合。所述异源核酸内切酶可以是规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)蛋白复合物的一部分。所述异源核酸内切酶可以是规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。所述异源核酸内切酶可以包含失活的核酸内切酶。所述失活的核酸内切酶可以融合至调节部分。所述调节部分可以包含转录激活因子、转录阻遏物、表观遗传修饰物或其片段。

在一些实施方案中，所述多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸(诸如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA))指导的异源核酸内切酶。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸和至少一种异源核酸内切酶，其中指导多核苷酸可以与至少一种异源核酸内切酶复合并且指导至少一种异源核酸内切酶切割本文所述任一种基因的遗传基因座。在一些实施方案中，多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸指导的异源核酸内切酶，诸如Cas9、Cas12、Cas13、Cpf1(或Cas12a)、C2C1、C2C2(或Cas13a)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、C2C3、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Csnl、Csxl2、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4或Cul966；其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。在一些实施方案中，Cas13可以包括但不限于Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas 13d(例如，CasRx)。

在一些实施方案中，所述异源核酸内切酶包含失活的核酸内切酶，其任选地融合至调节部分，诸如用于重塑介导所选择的目的基因的表达的表观基因组的表观遗传修饰物。在一些情况下，所述表观遗传修饰物可以包括甲基转移酶、去甲基化酶、歧化酶、烷基化酶、去嘌呤酶、氧化酶、光裂解酶、整合酶、转座酶、重组酶、聚合酶、连接酶、解旋酶、糖基化酶、乙酰转移酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、泛素激活酶、泛素缀合酶、泛素连接酶、去泛素化酶、腺苷酸形成酶、AMP化酶(AMPylator)、去AMP化酶、SUMO化酶、去SUMO化酶、核糖基酶、去核糖基酶、N-肉豆蔻酰基转移酶、染色质重塑酶、蛋白酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、合酶、合成酶或去肉豆蔻酰化酶。在一些情况下，所述表观遗传修饰物可以包含选自以下的一种或多种：p300、TET1、LSD1、HDAC1、HDAC8、HDAC4、HDAC11、HDT1、SIRT3、HST2、CobB、SIRT5、SIR2A、SIRT6、NUE、vSET、SUV39H1、DIM5、KYP、SUVR4、Set4、Set1、SETD8和TgSET8。

在一些实施方案中，所述多核苷酸编码与基因的基因组区域至少部分互补的指导多核苷酸(诸如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA))，其中在指导多核苷酸与基因结合后，指导多核苷酸募集指导多核苷酸指导的核酸酶以切割和遗传修饰所述区域。可被指导多核苷酸指导的核酸酶修饰的基因的例子包括CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM或FBN1。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含或编码至少一种mRNA，所述mRNA在表达后恢复通过本文所述药物组合物治疗的受试者中的缺陷型基因的功能。例如，所述多核苷酸包含或编码表达野生型CFTR蛋白的mRNA，所述野生型CFTR蛋白可以用于拯救患有CFTR蛋白先天性突变的受试者。可由多核苷酸表达的mRNA的其他例子包括编码DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM或FBN1的mRNA。

在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含一个或多个核苷酸的至少一个化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰增加指导多核苷酸(诸如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA))与互补基因组基因座(例如，本文所述任一种基因的基因组基因座)结合的特异性。在一些实施方案中，当随后向有需要的受试者施用多核苷酸时，所述至少一个化学修饰增加对核酸酶消化的抗性。在一些实施方案中，当随后向有需要的受试者施用多核苷酸时，所述至少一个化学修饰降低免疫原性。在一些实施方案中，所述至少一个化学修饰使支架(诸如tRNA支架)稳定。此类化学修饰可以具有希望的特性，诸如相对于没有所述至少一个化学修饰的多核苷酸，对核酸酶消化的抗性增强或与靶基因组基因座的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，所述至少一个化学修饰包括对糖部分的修饰。在一些实施方案中，经修饰的糖部分是包含一个或多个非桥接糖取代基的经取代的糖部分，包括但不限于在2'和/或5'位处的取代基。适合于2'-位的糖取代基的例子包括但不限于：2'-F、2'-OCH

包含2'-取代的糖部分的核苷被称为2'-取代的核苷。在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：卤基、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF

在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：F、NH

在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2'-取代基：F、OCF

在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2'-取代基：F、O--CH

某些经修饰的糖部分包含形成第二环的桥接糖取代基，从而产生二环糖部分。在一些此类实施方案中，所述二环糖部分包含在4'与2'呋喃糖环原子之间的桥。此类4'至2'糖取代基的例子包括但不限于：--[C(Ra)(Rb)]n--、--[C(Ra)(Rb)]n--O--、--C(RaRb)--N(R)--O--或--C(RaRb)--O--N(R)--；4'-CH

在一些实施方案中，此类4'至2'桥独立地包含1至4个独立地选自以下的连接基团：--[C(Ra)(Rb)]n--、--C(Ra)＝C(Rb)--、--C(Ra)＝N--、--C(＝NRa)--、--C(＝O)--、--C(＝S)--、--O--、--Si(Ra)

包含二环糖部分的核苷被称为二环核苷或BNA。二环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲基氧基(4'-CH

在一些实施方案中，二环糖部分和掺入此类二环糖部分的核苷进一步由异构体构型来定义。例如，包含4'-2'亚甲基-氧基桥的核苷可以呈α-L构型或β-D构型。以前，α-L-亚甲基氧基(4'-CH

在一些实施方案中，经取代的糖部分包含一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(例如，5'-取代的糖和4'-2'桥接的糖，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。

在一些实施方案中，经修饰的糖部分是糖替代物。在一些此类实施方案中，天然存在的糖的氧原子被例如硫、碳或氮原子取代。在一些此类实施方案中，此类经修饰的糖部分还包含如上所述的桥接和/或非桥接取代基。例如，某些糖替代物包含4'-硫原子和在2'-位和/或5'位处的取代基。作为另外的例子，已经描述了具有4'-2'桥的碳环二环核苷。

在一些实施方案中，糖替代物包含具有非5个原子的环。例如，在一些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃。此类四氢吡喃可以进一步被修饰或取代。包含此类经修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(HNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、甘露糖醇核酸(MNA)和氟HNA(F-HNA)。

在一些实施方案中，提供了经修饰的式VII的THP核苷，其中q

许多其他二环和三环糖替代环体系也是本领域已知的，其可以用于修饰核苷以掺入反义化合物中。

还提供了修饰的组合，不限于诸如2'-F-5'-甲基取代的核苷和用S替代核糖基环氧原子，以及在2'-位处的进一步取代或可替代地，二环核酸的5'-取代。在一些实施方案中，4'-CH

在一些实施方案中，本申请提供了包含经修饰的核苷的多核苷酸。那些经修饰的核苷酸可以包含经修饰的糖、经修饰的核碱基和/或经修饰的连接。选择特定的修饰使得所得多核苷酸具有希望的特征。在一些实施方案中，多核苷酸包含一个或多个RNA样核苷。在一些实施方案中，多核苷酸包含一个或多个DNA样核苷酸。

在一些实施方案中，本申请的核苷包含一个或多个未经修饰的核碱基。在某些实施方案中，本申请地核苷包含一个或多个经修饰的核碱基。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基选自：如本文所定义的通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基、和氟化碱基。5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括如本文所定义的2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基CH

在一些实施方案中，本申请提供了包含连接的核苷的多核苷酸。在此类实施方案中，核苷可以使用任何核苷间连接被连接在一起。核苷间连接基团的两个主要类别由磷原子的存在或不存在来定义。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于磷酸二酯(P＝O)、磷酸三酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(--CH

本文所述的多核苷酸含有一个或多个不对称中心，并且因此产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构体构型，其可以根据绝对立体化学定义为(R)或(S)、α或β(诸如对于糖异头物)、或(D)或(L)(诸如对于氨基酸等)。本文提供的反义化合物包括所有此类可能的异构体以及它们的外消旋和光学纯形式。

中性核苷间连接包括而不限于磷酸三酯、甲基磷酸酯、MMI(3'-CH

还可以在寡核苷酸上的其他位置(特别是3'末端核苷酸上的糖的3'位和5'末端核苷酸的5'位)进行另外的修饰。例如，本申请的配体缀合的多核苷酸的一个另外的修饰涉及将一个或多个另外的非配体部分或缀合物化学连接至寡核苷酸，所述另外的非配体部分或缀合物增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包括但不限于脂质部分(诸如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、巯基胆固醇、脂肪族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-瞵酸酯)、聚胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。

在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸包含或编码至少一种本文所述tRNA。在一些实施方案中，从多核苷酸表达的tRNA恢复正在通过本文所述药物组合物治疗的受试者中的至少一种缺陷型tRNA的功能。在一些实施方案中，由本文所述多核苷酸表达的至少一种tRNA可以包括编码丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯胺、脯氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的tRNA。在一些实施方案中，由本文所述多核苷酸表达的至少一种tRNA可以包括编码精氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸或半胱氨酸的tRNA。在一些实施方案中，由本文所述多核苷酸编码的tRNA可以恢复本文所述的任一种基因的表达。在一些实施方案中，由本文所述多核苷酸编码的tRNA可以恢复CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM或FBN1的表达。

多肽

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)包含一种或多种多肽。一些多肽可以包括酶，诸如本文所述的任一种核酸酶。例如，核酸酶可以包括CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)；兆核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白(例如，原核Argonaute(pAgo)、古生菌Argonaute(aAgo)、真核Argonaute(eAgo)和格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo))；作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；CIRT、PUF、归巢核酸内切酶或其任何功能片段、其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。在一些实施方案中，核酸酶可以包括Cas蛋白，诸如Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式。在一些实施方案中，Cas蛋白可以与本文所述的指导多核苷酸复合，以形成CRISPR核糖核蛋白(RNP)。

本文所述组合物中的核酸酶可以是Cas9(例如，来自酿脓链球菌(S.pyogenes)或肺炎链球菌(S.pneumonia))。CRISPR酶可以在靶序列的位置处(诸如在靶序列内和/或在本文所述的任一种基因的靶序列的互补序列内)指导一条或两条链的切割。例如，CRISPR酶可以指导和切割CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM或FBN1的基因组基因座。

CRISPR酶可以相对于相应的野生型酶突变，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或链条链的能力。例如，在来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸的取代(D10A)使Cas9从切割两条链的核酸酶转化为切口酶(切割单链)。在一些实施方案中，Cas9切口酶可以与一个或多个指导序列(例如，分别靶向DNA靶标的有义链和反义链的两个指导序列)组合使用。此组合允许两条链被切口并且用于NHEJ或HDR。

在一些实施方案中，本申请提供了含有一种或多种治疗性蛋白质的多肽。可以包含在组合物中的治疗性蛋白质包括广泛的分子，诸如细胞因子、趋化因子、白细胞介素、干扰素、生长因子、凝血因子、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、免疫球蛋白和酶。特定治疗性蛋白质的一些非限制性例子包括促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、促甲状腺激素α、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)、阿法链道酶、组织纤溶酶原激活物(TPA)活化酶、葡糖脑苷脂酶、干扰素(IF)β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ、干扰素α、TNF-α、IL-1至IL-36、人生长激素(rHGH)、人胰岛素(BHI)、人绒毛膜促性腺激素α、达贝泊汀α、促卵泡激素(FSH)、和因子VIII。

在一些实施方案中，所述多肽包含与包含肽序列的任何治疗剂(或预防剂)至少部分相同的肽序列。例如，所述多肽可以包含与用于治疗肺病(诸如肺癌)的抗体(例如，单克隆抗体)至少部分相同的肽序列。

在一些实施方案中，所述多肽包含在通过本文所述药物组合物治疗的受试者中恢复缺陷型蛋白质的功能的肽或蛋白质。例如，所述多核苷酸包含恢复囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的功能的肽或蛋白，所述肽或蛋白可以用于拯救患有导致突变CFTR蛋白表达的先天性缺陷的受试者。所述拯救的其他例子可以包括向有需要的受试者施用多肽，所述多肽包含野生型动力蛋白轴丝重链5、动力蛋白轴丝重链11、骨形态发生蛋白受体2型、富马酰基乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、IV型胶原蛋白α3链、IV型胶原蛋白α4链、IV型胶原蛋白α5链、多囊蛋白1、多囊蛋白2、纤维囊蛋白(或多管蛋白)、溶质载体家族3成员1、溶质载体家族7成员9、配对盒基因9、肌浆球蛋白VIIA、钙粘蛋白相关23、乌谢尔蛋白、Clarin 1、间隙连接β-2蛋白、间隙连接β-6蛋白、视紫红质、肌营养不良性肌强直症蛋白激酶、肌营养不良蛋白、钠电压门控通道α亚基1、钠电压门控通道β亚基1、凝血因子VIII、凝血因子IX、N-聚糖酶1、肿瘤蛋白p53、棕榈酰蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、Kv11.1(钾离子通道α亚基)、棕榈酰蛋白硫酯酶1、ATM丝氨酸/苏氨酸激酶、或原纤蛋白1的肽或蛋白质。

在一些实施方案中，本申请的药物组合物包含与脂质组合物组装(例如，包封在脂质组合物内)的多个有效载荷。与脂质组合物组装的多个有效载荷可以被配置用于基因编辑或基因表达修饰。与脂质组合物组装的多个有效载荷可以包含编码致动部分(例如，包含诸如Cas的异源核酸内切酶)的多核苷酸或编码致动部分的多核苷酸。与脂质组合物组装的多个有效载荷可以进一步包含一个或多个(例如，一个或两个)指导多核苷酸。与脂质组合物组装的多个有效载荷可以进一步包含一个或多个供体或模板多核苷酸。与脂质组合物组装的多个有效载荷可以包含核糖核蛋白(RNP)。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)不超过(约)20:1、不超过(约)15:1、不超过(约)10:1或不超过(约)5:1。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)不小于(约)20:1、不小于(约)15:1、不小于(约)10:1或不小于(约)5:1。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)为约5:1至约20:1。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)为约10:1至约20:1。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)为约15:1至约20:1。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)为约5:1至约10:1。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)为约5:1至约15:1。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)为约5:1至约20:1。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂(或预防剂)是多核苷酸，并且脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷的摩尔比(N/P比)为约15:1至约20:1。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比为约1:1至约1:100。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比为约1:1至约1:50。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比为约50:1至约1:100。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比为约1:1至约1:20。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比为约20:1至约1:50。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比为约50:1至约1:70。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比为约70:1至约1:100。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比不超过(约)1:1、不超过(约)1:5、不超过(约)1:10、不超过(约)1:15、不超过(约)1:20、不超过(约)1:25、不超过(约)1:30、不超过(约)1:35、不超过(约)1:40、不超过(约)1:45、不超过(约)1:50、不超过(约)1:60、不超过(约)1:70、不超过(约)1:80、不超过(约)1:90或超过(约)1:100。在本申请药物组合物的一些实施方案中，治疗剂与脂质组合物的总脂质的摩尔比不小于(约)1:1、不小于(约)1:5、不小于(约)1:10、不小于(约)1:15、不小于(约)1:20、不小于(约)1:25、不小于(约)1:30、不小于(约)1:35、不小于(约)1:40、不小于(约)1:45、不小于(约)1:50、不小于(约)1:60、不小于(约)1:70、不小于(约)1:80、不小于(约)1:90或小于(约)1:100。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，至少(约)85％、至少(约)86％、至少(约)87％、至少(约)88％、至少(约)89％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或(约)100％的治疗剂被包封在脂质组合物的颗粒中。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含多个颗粒，所述颗粒的特征在于以下中的一个或多个特征：(1)100纳米(nm)或更小的(例如，平均)尺寸；(2)不超过约0.2的多分散性指数(PDI)；以及(3)-10毫伏(mV)至10mV的ζ电位。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有约50纳米(nm)至约100纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有约70纳米(nm)至约100纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有约50纳米(nm)至约80纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有约60纳米(nm)至约80纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有至多约100纳米(nm)、至多约90纳米(nm)、至多约85纳米(nm)、至多约80纳米(nm)、至多约75纳米(nm)、至多约70纳米(nm)、至多约65纳米(nm)、至多约60纳米(nm)、至多约55纳米(nm)或至多约50纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有至少约100纳米(nm)、至少约90纳米(nm)、至少约85纳米(nm)、至少约80纳米(nm)、至少约75纳米(nm)、至少约70纳米(nm)、至少约65纳米(nm)、至少约60纳米(nm)、至少约55纳米(nm)或至少约50纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的多个颗粒。(例如，平均)尺寸可以通过尺寸排阻色谱(SEC)来确定。(例如，平均)尺寸可以通过一种或多种光谱方法或一种或多种基于图像的方法(例如，动态光散射、静态光散射、多角度光散射、激光散射、或动态图像分析、或其组合)来确定。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有约0.05至约0.5的多分散性指数(PDI)的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有约0.1至约0.5的多分散性指数(PDI)的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有约0.1至约0.3的多分散性指数(PDI)的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有约0.2至约0.5的多分散性指数(PDI)的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有不超过约0.5、不超过约0.4、不超过约0.3、不超过约0.2、不超过约0.1或不超过约0.05的多分散性指数(PDI)的多个颗粒。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-5毫伏(mV)或更低的负ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-10毫伏(mV)或更低的负ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-15毫伏(mV)或更低的负ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-20毫伏(mV)或更低的负ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-30毫伏(mV)或更低的负ζ电位的多个颗粒。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有0毫伏(mV)或更小的ζ电位的多个颗粒。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有5毫伏(mV)或更小的ζ电位的多个颗粒。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有10毫伏(mV)或更小的ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有15毫伏(mV)或更低的负ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有20毫伏(mV)或更低的负ζ电位的多个颗粒。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-5毫伏(mV)或更高的负ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-10毫伏(mV)或更高的负ζ电位的多个颗粒。在本申请的药物组合物的一些实施方案中，脂质组合物包含具有-15毫伏(mV)或更高的负ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-20毫伏(mV)或更高的负ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有-30毫伏(mV)或更高的负ζ电位的多个颗粒。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有0毫伏(mV)或更高的ζ电位的多个颗粒。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有5毫伏(mV)或更高的ζ电位的多个颗粒。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含具有10毫伏(mV)或更高的ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含15毫伏(mV)或更高的ζ电位的多个颗粒。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含20毫伏(mV)或更高的ζ电位的多个颗粒。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物具有在6至7的范围之外的表观电离常数(pKa)。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物具有约8或更高、约9或更高、约10或更高、约11或更高、约12或更高或约13或更高的表观pKa。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物具有约8至约13的表观pKa。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物具有约8至约10的表观pKa。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物具有约9至约11的表观pKa。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物具有约10至约13的表观pKa。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物具有约8至约12的表观pKa。在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物具有约10至约12的表观pKa。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物中的SORT脂质实现治疗剂的递送，其特征在于以下中的一个或多个：(a)与用参考脂质组合物实现的情况相比，在所述受试者的细胞中更大的治疗性作用；(b)与用参考脂质组合物实现的情况相比，在所述受试者的更多多个细胞中的治疗性作用；(c)在第一多个第一细胞类型的细胞中以及在更多第二多个第二细胞类型的细胞中的治疗性作用；以及(d)与在所述受试者的第二细胞类型的第二细胞中的治疗性作用相比，在所述受试者的第一细胞类型的第一细胞中更大的治疗性作用。在一些实施方案中，第一细胞类型不同于第二细胞类型。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述细胞是肺细胞。在一些实施方案中，所述肺细胞是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。所述细胞可以定位于气管、支气管、细支气管、或肺的其他部分或相关区域。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述治疗性作用的特征在于治疗有效量的治疗剂，例如，在受试者的肺、一种肺细胞、多种肺细胞、或一种肺细胞类型中。在一些实施方案中，所述治疗性作用的特征在于治疗剂的活性，例如，在受试者的肺、一种肺细胞、多种肺细胞、或一种肺细胞类型中。在一些实施方案中，所述治疗性作用的特征在于治疗剂的作用，例如，在受试者的肺、一种肺细胞、多种肺细胞、或一种肺细胞类型中。在一些实施方案中，所述更大的治疗性作用的特征在于治疗剂的更大治疗量。在一些实施方案中，所述更大的治疗性作用的特征在于治疗剂的更大活性。在一些实施方案中，所述更大的治疗性作用的特征在于治疗剂的更大作用。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物中的SORT脂质实现了治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物实现的情况相比更大的治疗性作用。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含所述量的SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质包括13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述药物组合物中的SORT脂质实现约1.1倍至约20倍的治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约10倍的治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约5倍至约10倍的治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约10倍至约20倍的治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的治疗性作用。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述药物组合物中的SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现约1.1倍至约20倍的更大治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现约1.1倍至约10倍的治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现约5倍至约10倍的更大治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现约10倍至约20倍的更大治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的治疗性作用。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述药物组合物中的SORT脂质实现治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于在更多多个细胞中的治疗性作用。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含所述量的SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质包括13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述药物组合物中的SORT脂质在约1.1倍至约20倍的细胞中实现治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍的细胞中实现治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约5倍至约10倍的细胞中实现治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍的细胞中实现治疗性作用。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的细胞中实现治疗性作用。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述药物组合物中的SORT脂质在约1.1倍至约20倍的细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍的更多细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约5倍至约10倍的更多细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍的更多细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的更多细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物中的SORT脂质实现治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于在第一多个第一细胞类型的细胞中的治疗性作用以及在第二多个第二细胞类型的细胞中更大的治疗性作用。在一些实施方案中，第一细胞类型不同于第二细胞类型。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，第一细胞类型是肺细胞。在一些实施方案中，第一细胞类型是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，第二细胞类型是肺细胞。在一些实施方案中，第二细胞类型是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。所述细胞可以定位于气管、支气管、细支气管、或肺的其他部分或相关区域。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述药物组合物中的SORT脂质在约1.1倍至约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约5倍至约10倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，所述药物组合物中的SORT脂质实现了治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于与第二细胞类型的第二细胞中的情况相比在第一细胞类型的第一细胞中更大的治疗性作用。在一些实施方案中，第一细胞类型不同于第二细胞类型。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，第一细胞类型是肺细胞。在一些实施方案中，第一细胞类型是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。所述细胞可以定位于气管、支气管、细支气管、或肺的其他部分或相关区域。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，第二细胞类型是肺细胞。在一些实施方案中，第二细胞类型是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。

在本申请药物组合物的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述药物组合物中的SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约1.1倍至约20倍的治疗性作用。在一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约1.1倍至约10倍的治疗性作用。在一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约5倍至约10倍的治疗性作用。在一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约10倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的治疗性作用。

在一些实施方案中，所述药物组合物是气雾剂组合物。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物通过雾化器以不超过70mL/分钟的雾化速率产生。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物通过雾化器以不超过50mL/分钟的雾化速率产生。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物通过雾化器以不超过30mL/分钟的雾化速率产生。

在一些实施方案中，所述气雾剂组合物的液滴尺寸为约至约0.5微米(μm)至约10μm。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物的液滴尺寸为约至约0.5微米(μm)至约10μm。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物的液滴尺寸为约至约1微米(μm)至约10μm。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物的液滴尺寸为约至约0.5微米(μm)至约5μm。在一些实施方案中，所述气雾剂液滴通过雾化器以不超过70mL/分钟的雾化速率产生。在一些实施方案中，所述气雾剂液滴的质量中值空气动力学直径(MMAD)为约0.5微米(μm)至约10μm。在一些实施方案中，所述液滴尺寸在储存条件下在约24小时的持续时间内变化小于约50％。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物的液滴的特征在于不超过约3的几何标准偏差(GSD)。

在一些实施方案中，本文提供了(例如，药物)组合物，所述组合物包含基于多核苷酸的递送而允许改善功效或结局的组分。与参考组合物或化合物相比，本文别处描述的组合物在递送至特定细胞、细胞类型、器官或身体区域时可能更有效。本文别处描述的组合物可以更有效地产生所递送多核苷酸的相应多肽的表达增加。本文别处描述的组合物可以更有效地产生更大数量的表达所递送多核苷酸的相应多肽的细胞。与参考多核苷酸相比，本文别处描述的组合物可以导致多核苷酸的摄取增加。摄取的增加可能是多核苷酸稳定性改善或组合物向特定细胞类型或器官的靶向性改善的结果。在一些实施方案中，与用包含13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的更大表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的至少1.1倍的更大表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的至少2倍的更大表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的至少5倍的更大表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的至少10倍的更大表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。

在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在更多多个细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在至少1.1倍的更多多个细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在至少2倍的更多多个细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在至少5倍的更多多个细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在至少10倍的更多多个细胞中实现多核苷酸(或多核苷酸的相应多肽)的表达或活性的量存在于所述脂质组合物中。

在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以在更多多个细胞中实现多核苷酸的摄取的量存在于所述脂质组合物中。在一些实施方案中，与用包含LF92、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质以实现多核苷酸以更大的量摄取到细胞中的量存在于所述脂质组合物中。

方法

在一些实施方案中，本文在一些实施方案中提供的内容包括一种用于通过雾化递送至受试者的一种或多种肺细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用(例如，药物)组合物(诸如本文所述的组合物)，所述组合物包含与脂质组合物(诸如本文所述的脂质组合物)组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质(诸如本文所述的可电离阳离子脂质)；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质(诸如本文所述的SORT脂质)，从而将所述治疗剂递送至所述受试者的肺的所述一种或多种肺细胞。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺上皮细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约2％、5％或10％的肺纤毛细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺分泌细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺棒状细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺杯状细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺基底细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含磷脂。在一些实施方案中，与所述脂质组合物组装的所述治疗剂的(例如，药物)组合物是气雾剂组合物(诸如本文所述的气雾剂组合物)。

在一些实施方案中，本文提供了用于有效力地递送至受试者的细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如本申请中所述的药物组合物。在所述方法的一些实施方案中，所述药物组合物包含与如本申请中所述的脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)，其中所述脂质组合物包含(i)可电离阳离子脂质；和(iii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。

在所述方法的一些实施方案中，所述细胞是肺细胞。在一些实施方案中，所述肺细胞是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。

在所述方法的一些实施方案中，所述SORT脂质实现了治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物实现的情况相比更大的治疗性作用。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含所述量的SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质包括13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。

在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约10倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约5倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约5倍至约10倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约10倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现约1.1倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现约1.1倍至约10倍的更大治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现约1.1倍至约5倍的更大治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现约10倍至约20倍的更大治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于在更多多个细胞中的治疗性作用。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含所述量的SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质包括13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。

在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约20倍的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约5倍的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、或至少约100倍的细胞中实现治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约20倍的细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍的细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约5倍至约10倍的更多细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍的更多细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的更多细胞中实现治疗性作用，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。

在所述方法的一些实施方案中，本申请的药物组合物可以通过任何合适的途径施用，包括例如口服、直肠、阴道、透粘膜、肺部(包括气管内或吸入)或肠施用；肠胃外递送，包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

在所述方法的一些实施方案中，本申请的药物组合物可以以局部而非全身性方式施用，例如，经由将药物组合物直接注射到靶组织中，优选以缓释配制品的形式。局部递送可以以多种方式进行，根据要靶向的组织而定。

在所述方法的一些实施方案中，可以吸入含有本申请组合物的气雾剂(用于鼻、气管或支气管递送)。在一些实施方案中，本申请的组合物可以注射到例如损伤、疾病表现或疼痛的部位。在一些实施方案中，本申请的组合物可以以用于口服、气管或食管应用的锭剂的形式提供。在一些实施方案中，本申请的组合物可以以用于施用于胃或肠的液体、片剂或胶囊的形式供应。在一些实施方案中，本申请的组合物可以以用于直肠或阴道应用的栓剂的形式供应。在一些实施方案中，本申请的组合物甚至可以通过使用乳膏、滴剂或甚至注射剂递送至眼睛。

在另一方面，本文提供了用于靶向递送至受试者的细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如本申请中所述的药物组合物。在所述方法的一些实施方案中，所述药物组合物包含与如本申请中所述的脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)，其中所述脂质组合物包含(i)可电离阳离子脂质；和(ii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。

在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现治疗剂向更大比例的细胞类型的递送。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含所述量的SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质包括13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。

在所述方法的一些实施方案中，所述SORT脂质实现治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于在第一多个第一细胞类型的细胞中的治疗性作用以及在第二多个第二细胞类型的细胞中的更大治疗性作用。在一些实施方案中，第一细胞类型不同于第二细胞类型。

在所述方法的一些实施方案中，第一细胞类型是肺细胞。在一些实施方案中，第一细胞类型是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。

在所述方法的一些实施方案中，第二细胞类型是肺细胞。在一些实施方案中，第二细胞类型是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。

在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约5倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，所述SORT脂质实现治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于与第二细胞类型的第二细胞中的情况相比，在第一细胞类型的第一细胞中更大的治疗性作用。在一些实施方案中，第一细胞类型不同于第二细胞类型。

在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约1.1倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约1.1倍至约10倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约5倍至约10倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约10倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的治疗性作用。

在一些实施方案中，将治疗剂递送至细胞可以改变基因组、转录组或表达水平。细胞可以被允许或能够繁殖，并且改变可以传递到由被递送治疗剂的细胞产生的细胞。以这种方式，治疗性作用可以传播到更大数量的细胞。基因组、转录组或表达水平的改变也可以在给定细胞中持续存在。

基底细胞

基底细胞衍生自发育气道中未分化的柱状上皮。其特征在于在柱状上皮中的基底位置，存在半桥粒(以α6β4整合素为特征)、细胞角蛋白5和14、以及核蛋白p63。基底细胞的分布因气道水平和动物物种而异。直径较大的气道比直径较小的气道具有更多基底细胞。随着气道直径的降低，基底细胞的数量也减少，并且终末细支气管中不存在基底细胞。

在另一方面，本文提供了一种用于递送至受试者的基底细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如本申请中所述的药物组合物。在所述方法的一些实施方案中，所述药物组合物包含与如本申请中所述的脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)，其中所述脂质组合物包含(i)可电离阳离子脂质；和(ii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。在一些实施方案中，所述基底细胞是肺基底细胞。

在所述方法的一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的器官或组织以在受试者器官或组织的基底细胞中产生可检测的治疗性作用。在一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的器官或组织，以在受试者的器官或组织的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％的基底细胞中产生可检测的治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，所述器官是肺。在一些实施方案中，所述组织是肺组织。在一些实施方案中，所述组织是肺气道组织。在一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的肺，以在受试者的肺的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％的基底细胞中产生可检测的治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，将所述药物组合物通过任何合适的递送施用于受试者。在一些实施方案中，将所述药物组合物通过吸入施用于受试者。在一些实施方案中，将所述药物组合物通过全身施用(诸如静脉内施用)施用于受试者。

纤毛细胞

纤毛细胞是细胞表面上具有纤毛结构的那些细胞。纤毛细胞的例子包括但不限于呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾丸网纤毛细胞、输出小管纤毛细胞、和/或纤毛室管膜细胞。人呼吸道纤毛细胞在其表面上带有200至300根纤毛。纤毛是从顶端细胞膜上的细长能动的圆柱形突起，直径大约0.25mm，其含有微管和与细胞的细胞质连续的细胞质。人气管纤毛长5至8mm，在更远侧的气道中变得更短。

纤毛的结构是复杂的并且由轴丝组成，由基体和小根锚定到细胞，并且它在其尖端具有一些较小的爪样形成物。基体指向的方向限定了纤毛的取向和有效摆动的方向。轴丝含有围绕着一对中心微管的九对微管以及在很大程度上维持纤毛的轮样排列的径向辐条和外周连接蛋白连结(peripheral nexin link)。内臂和外臂附接到微管。双联体的主要结构蛋白是微管蛋白。所述臂(内臂和外臂)含有动力蛋白，所述动力蛋白是一种被归类为ATP酶的蛋白质。动力蛋白产生导致微管滑动运动的力，所述滑动运动是纤毛运动的原因。普遍接受的是，外部动力蛋白臂主要负责摆动频率，而内部动力蛋白臂与径向辐条和连接蛋白连结一起在摆动的波形中起作用。轴丝结构完整性的改变可能导致异常运动，其范围为从静止到异常的过度活动模式。

在另一方面，本文提供了一种用于递送至受试者的纤毛细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如本申请中所述的药物组合物。在所述方法的一些实施方案中，所述药物组合物包含与如本申请中所述的脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)，其中所述脂质组合物包含(i)可电离阳离子脂质；和(ii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。在一些实施方案中，纤毛细胞是肺纤毛细胞。

在所述方法的一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的器官或组织以在受试者器官或组织的纤毛细胞中产生可检测的治疗性作用。在一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的器官或组织，以在受试者的器官或组织的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％的纤毛细胞中产生可检测的治疗性作用。

在一些实施方案中，所述器官是肺。在一些实施方案中，所述组织是肺组织。在一些实施方案中，所述组织是肺气道组织。在一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的肺，以在受试者的肺的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％的纤毛细胞中产生可检测的治疗性作用。

分泌细胞

“分泌细胞”是指专门用于分泌的细胞。这些细胞通常起源于上皮，并且具有特征性的、发育良好的粗面内质网，或者在分泌脂质或脂质衍生产物的细胞的情况下具有发育良好的滑面内质网。分泌细胞的例子包括：唾液腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、耵聍腺细胞、外泌汗腺细胞、顶泌汗腺细胞、皮脂腺细胞、鲍曼氏腺细胞、布伦纳腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、巴多林氏腺细胞、利特雷氏腺(gland of Littre)细胞、子宫内膜细胞、呼吸道和消化道的杯状细胞、胃的粘液细胞、胃腺的酶原细胞、胃腺的泌酸细胞、胰腺的腺泡细胞、小肠的潘氏细胞、肺的II型肺细胞、肺的棒状细胞、垂体前叶细胞、中间垂体细胞、垂体后叶细胞、肠道和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、肾小球旁器细胞、分泌胞外基质的细胞(例如，上皮细胞、非上皮细胞(诸如成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞/骨细胞、骨祖细胞))、和免疫系统的分泌细胞(例如，产生Ig的B细胞、产生细胞因子的T细胞等)。

在另一方面，本文提供了一种用于递送至受试者的分泌细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如本申请中所述的药物组合物。在所述方法的一些实施方案中，所述药物组合物包含与如本申请中所述的脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)，其中所述脂质组合物包含(i)可电离阳离子脂质；和(ii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。在一些实施方案中，所述分泌细胞是肺分泌细胞。

在所述方法的一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的器官或组织以在受试者器官或组织的分泌细胞中产生可检测的治疗性作用。在一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的器官或组织，以在受试者的器官或组织的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％的分泌细胞中产生可检测的治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，所述器官是肺。在一些实施方案中，所述组织是肺组织。在一些实施方案中，所述组织是肺气道组织。在一些实施方案中，所述方法将治疗剂递送至受试者的肺，以在受试者的肺的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％的分泌细胞中产生可检测的治疗性作用。

给药水平

在另一方面，提供了用选择性器官靶向(SORT)脂质配制的治疗剂(或预防剂)的高效力剂型，所述剂型包含与如本文所述的脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；和(ii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。

在本申请高效力剂型的一些实施方案中，所述SORT脂质在所述剂型中的存在量足以在与参考脂质组合物所需的情况相比更低的治疗剂剂量下实现治疗性作用。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含所述量的SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质包括13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。

在本申请高效力剂型的一些实施方案中，所述SORT脂质在所述剂型中的存在量足以在与参考脂质组合物所需的情况相比约1.1之一至约20之一的治疗剂剂量下实现治疗性作用。在本申请高效力剂型的一些实施方案中，所述SORT脂质在所述剂型中的存在量足以在与参考脂质组合物所需的情况相比约1.1之一至约10之一的治疗剂剂量下实现治疗性作用。在本申请高效力剂型的一些实施方案中，所述SORT脂质在所述剂型中的存在量足以在与参考脂质组合物所需的情况相比约1.1之一至约5之一的治疗剂剂量下实现治疗性作用。在本申请高效力剂型的一些实施方案中，所述SORT脂质在所述剂型中的存在量足以在与参考脂质组合物所需的情况相比约10之一至约20之一的治疗剂剂量下实现治疗性作用。在本申请高效力剂型的一些实施方案中，所述SORT脂质在所述剂型中的存在量足以在与用参考脂质组合物所需的情况相比至少约1.1分之一、至少约1.5分之一、至少约2分之一、至少约3分之一、至少约4分之一、至少约5分之一、至少约6分之一、至少约7分之一、至少约8分之一、至少约9分之一、至少约10分之一、至少约11分之一、至少约12分之一、至少约13分之一、至少约14分之一、至少约15分之一、至少约16分之一、至少约17分之一、至少约18分之一、至少约19分之一、或至少约20分之一的治疗剂剂量下实现治疗性作用。

在一些实施方案中，所述治疗剂以约2.0、1.5、1.0、0.5、0.2或0.1毫克/公斤(mg/kg或mpk)体重或前述值中的任何两个之间(包括端值)的范围的剂量存在于剂型中。

在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约2毫克/公斤(mg/kg或mpk)体重的剂量存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约1毫克/公斤(mg/kg或mpk)体重的剂量存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约0.5毫克/公斤(mg/kg或mpk)体重的剂量存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约0.2毫克/公斤(mg/kg或mpk)体重的剂量存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约0.1毫克/公斤(mg/kg或mpk)体重的剂量存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约5毫克/毫升(mg/mL)的浓度存在于剂型中。

在一些实施方案中，所述治疗剂以约5、4、3、2、1、0.5、0.2或0.1毫克/毫升(mg/mL)或前述值中任何两个之间(包括端值)的范围的浓度存在于剂型中。

在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约5毫克/毫升(mg/mL)的浓度存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约2毫克/毫升(mg/mL)的浓度存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约1毫克/毫升(mg/mL)的浓度存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约0.5毫克/毫升(mg/mL)的浓度存在于剂型中。在一些实施方案中，所述治疗剂以不超过约0.1毫克/毫升(mg/mL)的浓度存在于剂型中。

可以制备任何合适的剂型用于递送，例如，经由口服、直肠、阴道、透粘膜、肺部(包括气管内或吸入)或肠施用；肠胃外递送，包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

在一些实施方案中，所述剂型可以以局部而非全身性方式施用，例如，经由将药物组合物直接注射到靶组织中，优选以缓释配制品的形式。局部递送可以以多种方式进行，根据要靶向的组织而定。

在一些实施方案中，所述剂型是用于鼻、气管或支气管递送的含有本发明组合物的吸入气雾剂。在一些实施方案中，所述剂型可以以用于口服、气管或食管应用的锭剂的形式提供。在一些实施方案中，所述剂型可以以施用于胃或肠的液体、片剂或胶囊的形式供应。在一些实施方案中，所述剂型可以以用于直肠或阴道应用的栓剂的形式供应。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述剂型可以、甚至可以通过使用乳膏、滴剂或甚至注射剂来递送至眼睛。

在一些实施方案中，可以重复施用一定剂量的治疗剂。

受试者

可以用本申请的方法治疗任何有需要的受试者。在一些实施方案中，已经确定受试者可能对治疗剂有反应。例如，受试者可能患有、正患有或疑似患有疾病或病症。例如，所述疾病或障碍可以选自遗传性呼吸系统疾病、慢性炎性肺病、肺纤维化、中枢神经系统(CNS)障碍、免疫缺陷、自身免疫性疾病、癌症、感染性疾病、肝纤维化、肝硬化、代谢障碍、肌营养不良和病毒感染。如本文别处所述的一种或多种治疗剂或预防剂可以通过多种机制有效地为受试者提供治疗性作用，例如，经由基因疗法(例如，需要重复施用)、改变(例如，增加)蛋白质产生、(例如，体内)嵌合抗原受体(CAR)T细胞产生、免疫肿瘤学、基于疫苗的方法、肿瘤抑制因子的再活化、或其他机制。

在一些实施方案中，已经确定受试者在靶基因中具有(例如，错义或无义)突变。在一些实施方案中，靶基因中的突变与遗传疾病或障碍相关。在一些实施方案中，靶基因编码选自以下的蛋白质：CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM和FBN1。

在一些实施方案中，已经确定受试者展现出对应于靶基因的蛋白质或多核苷酸的异常表达或活性。在一些实施方案中，蛋白质或多核苷酸的异常表达或活性与遗传疾病或障碍相关。在一些实施方案中，所述蛋白质选自CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM和FBN1。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码选自以下的蛋白质：CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM和FBN1。

在一些实施方案中，所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。在一些实施方案中，所述受试者是人。

在另一方面，本文提供了一种用于将治疗剂(或预防剂)有效力地递送至细胞的方法，所述方法包括使细胞与本申请的药物组合物接触。在所述方法的一些实施方案中，所述药物组合物包含与如本申请中所述的脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)，其中所述脂质组合物包含(i)可电离阳离子脂质；和(iii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。

在所述方法的一些实施方案中，所述细胞分离自所述受试者。在所述方法的一些实施方案中，所述细胞是细胞系。在所述方法的一些实施方案中，所述细胞是肺细胞。在一些实施方案中，所述肺细胞是肺气道细胞。可通过本申请递送而靶向的肺气道细胞的例子包括但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯状细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。

在所述方法的一些实施方案中，所述SORT脂质实现了治疗剂向细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物实现的情况相比更大的治疗性作用。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含所述量的SORT脂质。在一些实施方案中，所述参考脂质包括13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。

在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约10倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约5倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现约10倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质实现治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于在更多多个细胞中的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约20倍的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约5倍至约10倍的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的情况相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的细胞中实现治疗性作用。

在另一方面，本文提供了一种用于将治疗剂(或预防剂)靶向递送至细胞类型的方法，所述方法包括使细胞本申请的药物组合物接触。在所述方法的一些实施方案中，所述药物组合物包含与如本申请中所述的脂质组合物组装的治疗剂(或预防剂)，其中所述脂质组合物包含(i)可电离阳离子脂质；和(ii)与可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。

在所述方法的一些实施方案中，所述SORT脂质实现治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于在第一多个第一细胞类型的细胞中的治疗性作用以及在第二多个第二细胞类型的细胞中的更大治疗性作用。在一些实施方案中，第一细胞类型不同于第二细胞类型。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约5倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与第一多个第一细胞类型的细胞相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的更多第二多个第二细胞类型的细胞中实现治疗性作用。

在所述方法的一些实施方案中，所述SORT脂质实现治疗剂向受试者细胞的递送，其特征在于与第二细胞类型的第二细胞中的情况相比，在第一细胞类型的第一细胞中更大的治疗性作用。在一些实施方案中，第二细胞类型不同于第一细胞类型。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约1.1倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约1.1倍至约10倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约5倍至约10倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现约10倍至约20倍的治疗性作用。在所述方法的一些实施方案中，与在第二细胞类型的第二细胞中实现的情况相比，所述SORT脂质在第一细胞类型的第一细胞中实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、或至少约20倍的治疗性作用。

在一些实施方案中，所述接触是离体的。在一些实施方案中，所述接触是体外的。在一些实施方案中，所述接触是体内的。在一些实施方案中，所述接触包括向受试者施用包含与脂质组合物组装的治疗剂的组合物。

以下是本公开文本组合物的例子和组合物的评估。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。

实施方案列表

本发明的实施方案的以下列表被认为是公开了本发明的各种特征，这些特征可以被认为是特定于讨论它们的特定实施方案的，或者可以与如其他实施方案中列出的各种其他特征组合。因此，仅仅因为在一个特定实施方案下讨论了一个特征，并不一定将此特征的使用限制于此实施方案。

实施方案1.一种用于有效力地递送至受试者的肺细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用气雾剂组合物，所述气雾剂组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向所述受试者的所述细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物(例如，没有所述量的所述SORT脂质)实现的情况相比(例如，约1.1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍)的更大治疗性作用；任选地，其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案2.一种用于有效力地递送至受试者的肺细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用气雾剂组合物，所述气雾剂组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向所述受试者的细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物(例如，没有所述量的所述SORT脂质)实现的情况相比在(例如，约1.1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍)更多多个肺细胞中的治疗性作用；任选地其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案3.一种用于靶向递送至受试者的肺细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用气雾剂组合物，所述气雾剂组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中与用参考脂质组合物实现的情况相比，(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向更大比例的细胞类型的递送；任选地，其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案4.一种用于靶向递送至受试者的肺细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用气雾剂组合物，所述气雾剂组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向所述受试者的细胞的递送，其特征在于在第一多个第一细胞类型的肺细胞中以及在(例如，约1.1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍)更多第二多个第二细胞类型的肺细胞中的治疗性作用；任选地，其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案5.一种用于靶向递送至受试者的肺细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用气雾剂组合物，所述气雾剂组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中(例如，一定量的)所述SORT脂质实现所述治疗剂向所述受试者的细胞的递送，其特征在于与在所述受试者的第二细胞类型的第二肺细胞中的情况相比在所述受试者的第一细胞类型的第一肺细胞中(例如，约1.1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍)的更大治疗性作用，其中所述第一细胞类型不同于所述第二细胞类型；任选地，其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物进一步包含(iii)磷脂。

实施方案7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述施用不是静脉内施用。

实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其中所述施用包括通过吸入施用。

实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约65％的所述SORT脂质。

实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述可电离阳离子脂质。

实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约8％至约23％的所述磷脂。

实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述磷脂不是乙基磷酸胆碱。

实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物进一步包含类固醇或类固醇衍生物。

实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约46％的所述类固醇或类固醇衍生物。

实施方案15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物进一步包含聚合物缀合的脂质(例如，聚(乙二醇)(PEG)缀合的脂质)。

实施方案16.根据实施方案15所述的方法，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约0.5％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。

实施方案17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是多核苷酸；并且其中所述脂质组合物中的氮与所述多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)不超过约20:1。

实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中所述N/P比为约5:1至约20:1。

实施方案19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述治疗剂与所述脂质组合物的总脂质的摩尔比不超过约1:1、1:10、1:50或1:100。

实施方案20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述治疗剂的至少约85％被包封在所述脂质组合物的颗粒中。

实施方案21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物包含多个颗粒，所述颗粒的特征在于以下中的一个或多个特征：(1)100纳米(nm)或更小的(例如，平均)尺寸；(2)不超过约0.2的多分散性指数(PDI)；以及(3)-10毫伏(mV)至10mV的ζ电位。

实施方案22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物具有在6至7的范围之外的表观电离常数(pKa)。

实施方案23.根据实施方案22所述的方法，其中所述脂质组合物的所述表观pKa为约8或更高。

实施方案24.根据实施方案23所述的方法，其中所述脂质组合物的所述表观pKa为约8至约13。

实施方案25.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述SORT脂质包含永久带正电荷的部分(例如，季铵离子)。

实施方案26.根据实施方案25所述的方法，其中所述SORT脂质包含反离子。

实施方案27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质(例如，饱和的或不饱和的)。

实施方案28.根据实施方案27中任一项所述的方法，其中所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。

实施方案29.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述SORT脂质包含具有以下结构式的头基：

实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案31.根据实施方案29所述的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案32.根据实施方案29所述的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案33.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案34.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案35.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述可电离阳离子脂质是具有以下结构式的(g)代的树枝状聚合物或树枝基元：

或其药学上可接受的盐，其中：

(a)所述核心包含结构式(X

其中：

Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR

可替代地，L

(b)所述多个(N)分支中的每个分支独立地包含结构式(X

其中：

*指示所述分支与所述核心的附接点；

g是1、2、3或4；

Z＝2

当g＝1时，G＝0；或当g≠1时，

(c)每个二酰基独立地包含结构式

*指示所述二酰基在其近端的附接点；

**指示所述二酰基在其远端的附接点；

(d)每个接头基团独立地包含结构式

其中：

**指示所述接头与近侧二酰基的附接点；

***指示所述接头与远侧二酰基的附接点；并且

(e)每个终止基团独立地选自任选经取代的(例如，C

实施方案37.根据实施方案36所述的方法，其中x

实施方案38.根据实施方案36或37所述的方法，其中R

实施方案39.根据实施方案38所述的方法，其中R

实施方案40.根据实施方案36-39中任一项所述的方法，其中R

实施方案41.根据实施方案36-40中任一项所述的方法，其中所述多个(N)分支包括至少3个(例如，至少4个或至少5个)分支。

实施方案42.根据实施方案36-41中任一项所述的方法，其中g＝1；G＝0；并且Z＝1。

实施方案43.根据实施方案42所述的方法，其中所述多个分支中的每个分支包含结构式

实施方案44.根据实施方案36-41中任一项所述的方法，其中g＝2；G＝1；并且Z＝2。

实施方案45.根据实施方案44所述的方法，其中所述多个分支中的每个分支包含结构式

实施方案46.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心包含结构式：

实施方案47.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心包含结构式：

实施方案48.根据实施方案47所述的方法，其中所述核心包含结构式：

实施方案49.根据实施方案47所述的方法，其中所述核心包含结构式：

实施方案50.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心包含结构式：

实施方案51.根据实施方案50所述的方法，其中所述核心包含结构式：

实施方案52.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心包含结构式

实施方案53.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心包含结构式：

实施方案54.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心包含选自以下的结构式：

实施方案55.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心包含选自以下的结构式：

实施方案56.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心包含选自以下的结构式：

实施方案57.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心具有结构

实施方案58.根据实施方案36-45中任一项所述的方法，其中所述核心具有结构

实施方案59.根据实施方案36-58中任一项所述的方法，其中A

实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中A

实施方案61.根据实施方案36-60中任一项所述的方法，其中A

实施方案62.根据实施方案61所述的方法，其中A

实施方案63.根据实施方案36-62中任一项所述的方法，其中Y

实施方案64.根据实施方案36-63中任一项所述的方法，其中所述二酰基在每次出现时独立地包含结构式

实施方案65.根据实施方案36-64中任一项所述的方法，其中L

实施方案66.根据实施方案65所述的方法，其中L

实施方案67.根据实施方案65所述的方法，其中L

实施方案68.根据实施方案65所述的方法，其中L

实施方案69.根据实施方案65所述的方法，其中L

实施方案70.根据实施方案36-69中任一项所述的方法，其中每个终止基团独立地是C

实施方案71.根据实施方案70所述的方法，其中每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C

实施方案72.根据实施方案71所述的方法，其中每个终止基团独立地是C

实施方案73.根据实施方案71所述的方法，其中每个终止基团独立地是C

实施方案74.根据实施方案70所述的方法，其中每个终止基团独立地是C

实施方案75.根据实施方案72或74所述的方法，其中每个终止基团独立地是C

实施方案76.根据实施方案36-69中任一项所述的方法，其中每个终止基团独立地选自表3中阐述的那些或其子集；或其中每个终止基团独立地选自：

实施方案77.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述可电离阳离子脂质选自表4或表5中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中所述受试者已被确定为可能对所述治疗剂有反应。

实施方案79.根据实施方案1-78中任一项所述的方法，其中所述受试者已被确定为在靶基因中具有(例如，错义或无义)突变。

实施方案80.根据实施方案79所述的方法，其中所述靶基因中的所述突变与遗传疾病或障碍相关。

实施方案81.根据实施方案1-80中任一项所述的方法，其中所述受试者已被确定为展现出对应于靶基因的蛋白质或多核苷酸的异常表达或活性。

实施方案82.根据实施方案81所述的方法，其中所述蛋白质或多核苷酸的所述异常表达或活性与遗传疾病或障碍相关。

实施方案83.根据实施方案1-82中任一项所述的方法，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。

实施方案84.根据实施方案83所述的方法，其中所述受试者是人。

实施方案85.根据实施方案1-84中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包含化合物、多核苷酸、多肽或其组合。

实施方案86.根据实施方案85所述的方法，其中所述治疗剂包含小干扰核糖核酸(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小核糖核酸(miRNA)、初级微小核糖核酸(pri-miRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关核酸、CRISPR-RNA(crRNA)、单指导核糖核酸(sgRNA)、反式激活CRISPR核糖核酸(tracrRNA)、质粒脱氧核糖核酸(pDNA)、转移核糖核酸(tRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、反义核糖核酸(RNA)、指导核糖核酸、脱氧核糖核酸(DNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、单链核糖核酸(ssRNA)、双链核糖核酸(dsRNA)、CRSIPR相关(Cas)蛋白或其组合。

实施方案87.根据实施方案86所述的方法，其中所述治疗剂包含异源信使核糖核苷酸(mRNA)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺上皮细胞中可检测到由所述异源mRNA编码的蛋白质的表达、活性或作用。

实施方案88.根据实施方案86所述的方法，其中所述治疗剂包含异源信使核糖核苷酸(mRNA)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约2％、5％或10％的肺纤毛细胞中可检测到由所述异源mRNA编码的蛋白质的表达、活性或作用。

实施方案89.根据实施方案86所述的方法，其中所述治疗剂包含异源信使核糖核苷酸(mRNA)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺分泌细胞中可检测到由所述异源mRNA编码的蛋白质的表达、活性或作用。

实施方案90.根据实施方案86所述的方法，其中所述治疗剂包含异源信使核糖核苷酸(mRNA)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺棒状细胞中可检测到由所述异源mRNA编码的蛋白质的表达、活性或作用。

实施方案91.根据实施方案86所述的方法，其中所述治疗剂包含异源信使核糖核苷酸(mRNA)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺杯状细胞中可检测到由所述异源mRNA编码的蛋白质的表达、活性或作用。

实施方案92.根据实施方案86所述的方法，其中所述治疗剂包含异源信使核糖核苷酸(mRNA)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺基底细胞中可检测到由所述异源mRNA编码的蛋白质的表达、活性或作用。

实施方案93.根据实施方案87-92中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是选自以下的任一种：CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM和FBN1。

实施方案94.根据实施方案87-92中任一项所述的方法，其中所述蛋白质对应于所述受试者的肺细胞(例如，肺上皮细胞、肺纤毛细胞、肺分泌细胞、肺棒状细胞、肺杯状细胞或肺基底细胞)中的靶基因。

实施方案95.根据实施方案87-92中任一项所述的方法，其中所述异源mRNA的表达产生所述蛋白质的功能变体。

实施方案96.根据实施方案87-92中任一项所述的方法，其中与在不存在所述施用的情况下产生的所述蛋白质的所述功能变体的量相比，所述异源mRNA的表达使所述蛋白质的功能变体的量增加。

实施方案97.根据实施方案86所述的方法，其中所述治疗剂包含异源转移核糖核苷酸(tRNA)，所述异源转移核糖核苷酸将氨基酸引入靶基因的蛋白质的生长肽链中(例如，在对应于编码所述蛋白质的所述靶基因中突变的位置处)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺上皮细胞中可检测到所述蛋白质的表达或活性。

实施方案98.根据实施方案86或97所述的方法，其中所述治疗剂包含异源转移核糖核苷酸(tRNA)，所述异源转移核糖核苷酸将氨基酸引入靶基因的蛋白质的生长肽链中(例如，在对应于编码所述蛋白质的所述靶基因中突变的位置处)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约2％、5％或10％的肺纤毛细胞中可检测到所述蛋白质的表达或活性。

实施方案99.根据实施方案86和97-98中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包含异源转移核糖核苷酸(tRNA)，所述异源转移核糖核苷酸将氨基酸引入靶基因的蛋白质的生长肽链中(例如，在对应于编码所述蛋白质的所述靶基因中突变的位置处)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺分泌细胞中可检测到所述蛋白质的表达或活性。

实施方案100.根据实施方案86和97-99中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包含异源转移核糖核苷酸(tRNA)，所述异源转移核糖核苷酸将氨基酸引入靶基因的蛋白质的生长肽链中(例如，在对应于编码所述蛋白质的所述靶基因中突变的位置处)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺棒状细胞中可检测到所述蛋白质的表达或活性。

实施方案101.根据实施方案86和97-100中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包含异源转移核糖核苷酸(tRNA)，所述异源转移核糖核苷酸将氨基酸引入靶基因的蛋白质的生长肽链中(例如，在对应于编码所述蛋白质的所述靶基因中突变的位置处)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺杯状细胞中可检测到所述蛋白质的表达或活性。

实施方案102.根据实施方案86和97-101中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包含异源转移核糖核苷酸(tRNA)，所述异源转移核糖核苷酸将氨基酸引入靶基因的蛋白质的生长肽链中(例如，在对应于编码所述蛋白质的所述靶基因中突变的位置处)；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺基底细胞中可检测到所述蛋白质的表达或活性。

实施方案103.根据实施方案97-102中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是选自以下的任一种：CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM和FBN1。

实施方案104.根据实施方案97-102中任一项所述的方法，其中所述靶基因存在于所述受试者的肺细胞(例如，肺上皮细胞、肺纤毛细胞、肺分泌细胞、肺棒状细胞、肺杯状细胞或肺基底细胞)中。

实施方案105.根据实施方案97-102中任一项所述的方法，其中与在不存在所述接触的情况下产生的所述蛋白质的所述非功能变体的量相比，所述tRNA使所述细胞中所述蛋白质的非功能变体的量减少。

实施方案106.根据实施方案85或86所述的方法，其中所述治疗剂包含异源多肽，所述异源多肽包含致动部分，所述致动部分被配置为与对应于靶基因的靶多核苷酸复合；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺上皮细胞、所述受试者的至少约2％、5％或10％的肺纤毛细胞、所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺分泌细胞、所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺棒状细胞、所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺杯状细胞、或所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺基底细胞中可检测到所述靶基因的表达或活性改变。

实施方案107.根据实施方案86或106所述的方法，其中所述治疗剂包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码致动部分，所述致动部分被配置为与对应于靶基因的靶多核苷酸复合；并且其中所述施用导致在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺上皮细胞、所述受试者的至少约2％、5％或10％的肺纤毛细胞、所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺分泌细胞、所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺棒状细胞、所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺杯状细胞、或所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺基底细胞中可检测到所述靶基因的表达或活性改变。

实施方案108.根据实施方案106或107所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码指导多核苷酸，所述指导多核苷酸被配置为将所述致动部分引导至所述靶多核苷酸。

实施方案109.根据实施方案106或107所述的方法，其中所述致动部分包含异源核酸内切酶或其片段(例如，通过指导多核苷酸引导以特异性结合所述靶多核苷酸)。

实施方案110.根据实施方案109所述的方法，其中所述异源核酸内切酶是(1)核糖核蛋白(RNP)的一部分和(2)与指导所述指导多核苷酸复合。

实施方案111.根据实施方案109所述的方法，其中所述异源核酸内切酶是规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)蛋白复合物的一部分。

实施方案112.根据实施方案109所述的方法，其中所述异源核酸内切酶是规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。

实施方案113.根据实施方案109所述的方法，其中所述异源核酸内切酶选自C2C1、C2C2、C2C3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、Cas10、Cas10d、Cas 11、Cas12、Cas13、Cas14、CasF、CasG、CasH、CasX、CaxY、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或其片段。

实施方案114.根据实施方案109所述的方法，其中所述异源核酸内切酶包含失活的核酸内切酶，所述失活的核酸内切酶任选地与调节部分(例如，包含转录激活因子、转录阻遏物、表观遗传修饰物或其片段)融合。

实施方案115.根据实施方案106或107所述的方法，其中所述靶多核苷酸对应于编码选自以下的任何蛋白质的基因：CFTR、DNAH5、DNAH11、BMPR2、FAH、PAH、IDUA、COL4A3、COL4A4、COL4A5、PKD1、PKD2、PKHD1、SLC3A1、SLC7A9、PAX9、MYO7A、CDH23、USH2A、CLRN1、GJB2、GJB6、RHO、DMPK、DMD、SCN1A、SCN1B、F8、F9、NGLY1、p53、PPT1、TPP1、hERG、PPT1、ATM和FBN1。

实施方案116.根据实施方案106或107所述的方法，其中所述靶多核苷酸对应于所述受试者的肺细胞(例如，肺上皮细胞、肺纤毛细胞、肺分泌细胞、肺棒状细胞、肺杯状细胞或肺基底细胞)中的基因。

实施方案117.根据实施方案106或107所述的方法，其中在所述施用后至少约4小时可检测到所述表达或活性或所述改变的表达或活性。

实施方案118.根据实施方案1-117中任一项所述的方法，其中所述治疗性作用的特征在于所述治疗剂的(例如，治疗有效)量、活性或作用(例如，在所述受试者的肺、一种肺细胞、多种肺细胞、或一种肺细胞类型中)。

实施方案119.根据实施方案1-118中任一项所述的方法，其中所述更大的治疗性作用的特征在于所述治疗剂的更大(例如，治疗)量、活性或作用。

实施方案120.根据实施方案1-119中任一项所述的方法，其中所述参考脂质组合物不包含所述量的所述SORT脂质。

实施方案121.根据实施方案120所述的方法，其中所述参考脂质组合物不包含所述SORT脂质。

实施方案122.根据实施方案1-121中任一项所述的方法，其中所述参考脂质组合物包含13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。

实施方案123.根据实施方案1-122中任一项所述的方法，其中所述施用不是静脉内施用。

实施方案124.根据实施方案1-122中任一项所述的方法，其中所述施用包括全身性(例如，静脉内)施用。

实施方案125.根据实施方案1-124中任一项所述的方法，其中所述施用包括气雾剂施用(例如，通过吸入)。

实施方案126.根据实施方案1-125中任一项所述的方法，其中所述细胞包括肺气道细胞(例如，肺纤毛细胞、肺分泌细胞、肺棒状细胞、肺杯状细胞、肺基底细胞或其组合)。

实施方案127.根据实施方案1-126中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是纤毛细胞、分泌细胞、棒状细胞、杯状细胞、或基底细胞。

实施方案128.根据实施方案1-127中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是肺(例如，气道)细胞。

实施方案129.根据实施方案1-128中任一项所述的方法，其中所述第二细胞类型是纤毛细胞、分泌细胞、棒状细胞、杯状细胞、或基底细胞。

实施方案130.根据实施方案1-129中任一项所述的方法，其中所述第二细胞类型是肺(例如，气道)细胞。

实施方案131.一种气雾剂组合物，所述气雾剂组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，其中所述SORT脂质被配置成实现所述治疗剂的递送，其特征在于以下中的一个或多个：(a)与用参考脂质组合物实现的情况相比，在所述受试者的肺细胞中(例如，1.1倍或10倍)的更大治疗性作用；(b)与用参考脂质组合物实现的情况相比，在所述受试者的(例如，1.1倍或10倍)更多多个肺细胞(例如，一种细胞类型的肺细胞)中的治疗性作用；(c)在第一多个第一细胞类型的肺细胞中以及在(例如，1.1倍或10倍)更多第二多个第二细胞类型的肺细胞中的治疗性作用；以及(d)与在所述受试者的第二细胞类型的第二肺细胞中的情况相比，在所述受试者的第一细胞类型的第一肺细胞中(例如，1.1倍或10倍)的更大治疗性作用，其中所述气雾剂组合物被配制为气雾剂；任选地，其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案132.根据实施方案131所述的气雾剂组合物，其中所述脂质组合物进一步包含(iii)磷脂。

实施方案133.根据实施方案131或132所述的气雾剂组合物，其中包含所述治疗剂的所述气雾剂组合物是药物组合物。

实施方案134.根据实施方案133所述的气雾剂组合物，其中所述气雾剂液滴由雾化器以不超过70mL/分钟的雾化速率产生。

实施方案135.根据实施方案133或134所述的气雾剂组合物，其中所述气雾剂液滴的质量中值空气动力学直径(MMAD)为约0.5微米(μm)至约10μm。

实施方案136.根据实施方案133-135中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述液滴尺寸在储存条件下在约24小时的持续时间内变化小于约50％。

实施方案137.根据实施方案133-136中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述气雾剂组合物的液滴的特征在于不超过约3的几何标准偏差(GSD)。

实施方案138.根据实施方案131-137中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约65％的所述SORT脂质。

实施方案139.根据实施方案131-138中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述可电离阳离子脂质。

实施方案140.根据实施方案131-139中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约8％至约23％的所述磷脂。

实施方案141.根据实施方案131-140中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述磷脂不是乙基磷酸胆碱。

实施方案142.根据实施方案131-141中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述脂质组合物进一步包含类固醇或类固醇衍生物。

实施方案143.根据实施方案142所述的气雾剂组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约46％的所述类固醇或类固醇衍生物。

实施方案144.根据实施方案131-143中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述脂质组合物进一步包含聚合物缀合的脂质(例如，聚(乙二醇)(PEG)缀合的脂质)。

实施方案145.根据实施方案144所述的气雾剂组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约0.5％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。

实施方案146.根据实施方案131-145中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质包含永久带正电荷的部分(例如，季铵离子)。

实施方案147.根据实施方案131-145中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质包含可电离的带正电荷的部分(例如，叔胺)。

实施方案148.根据实施方案146所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质包含反离子。

实施方案149.根据实施方案131-148中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质(例如，饱和的或不饱和的)。

实施方案150.根据实施方案149中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。

实施方案151.根据实施方案131-150中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质包含具有以下结构式的头基：

实施方案152.根据实施方案151所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案153.根据实施方案151所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案154.根据实施方案151所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案155.根据实施方案131-148中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案156.根据实施方案131-148中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案157.根据实施方案131-148中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案158.根据实施方案131-148中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：

实施方案159.根据实施方案131-158中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述可电离阳离子脂质是具有以下结构式的(g)代的树枝状聚合物或树枝基元：

或其药学上可接受的盐，其中：

(a)所述核心包含结构式(X

其中：

Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR

可替代地，L

(b)所述多个(N)分支中的每个分支独立地包含结构式(X

其中：

*指示所述分支与所述核心的附接点；

g是1、2、3或4；

Z＝2

当g＝1时，G＝0；或当g≠1时，

(c)每个二酰基独立地包含结构式

*指示所述二酰基在其近端的附接点；

**指示所述二酰基在其远端的附接点；

(d)每个接头基团独立地包含结构式

其中：

**指示所述接头与近侧二酰基的附接点；

***指示所述接头与远侧二酰基的附接点；并且

(e)每个终止基团独立地选自任选经取代的(例如，C

实施方案160.根据实施方案159所述的气雾剂组合物，其中x

实施方案161.根据实施方案159或160所述的气雾剂组合物，其中R

实施方案162.根据实施方案161所述的气雾剂组合物，其中R

实施方案163.根据实施方案159-162中任一项所述的气雾剂组合物，其中R

实施方案164.根据实施方案159-163中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述多个(N)分支包括至少3个(例如，至少4个或至少5个)分支。

实施方案165.根据实施方案159-164中任一项所述的气雾剂组合物，其中g＝1；G＝0；并且Z＝1。

实施方案166.根据实施方案165所述的气雾剂组合物，其中所述多个分支中的每个分支包含结构式

实施方案167.根据实施方案159-164中任一项所述的气雾剂组合物，其中g＝2；G＝1；并且Z＝2。

实施方案168.根据实施方案167所述的气雾剂组合物，其中所述多个分支中的每个分支包含结构式

实施方案169.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含结构式：

实施方案170.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含结构式：

实施方案171.根据实施方案170所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含结构式：

实施方案172.根据实施方案170所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含结构式：

实施方案173.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含结构式：

实施方案174.根据实施方案173所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含结构式：

实施方案175.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含结构式

实施方案176.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含结构式

实施方案177.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含选自以下的结构式：

实施方案178.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含选自以下的结构式：

实施方案179.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心包含选自以下的结构式：

实施方案180.根据实施方案159-168中任一项所述的药物组合物，其中所述核心具有结构

实施方案181.根据实施方案159-168中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述核心具有结构

实施方案182.根据实施方案159-181中任一项所述的气雾剂组合物，其中A

实施方案183.根据实施方案182所述的气雾剂组合物，其中A

实施方案184.根据实施方案159-183中任一项所述的气雾剂组合物，其中A

实施方案185.根据实施方案184所述的气雾剂组合物，其中A

实施方案186.根据实施方案159-185中任一项所述的气雾剂组合物，其中Y

实施方案187.根据实施方案159-186中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述二酰基在每次出现时独立地包含结构式

实施方案188.根据实施方案159-187中任一项所述的气雾剂组合物，其中L

实施方案189.根据实施方案188所述的气雾剂组合物，其中L

实施方案190.根据实施方案188所述的气雾剂组合物，其中L

实施方案191.根据实施方案188所述的气雾剂组合物，其中L

实施方案192.根据实施方案188所述的气雾剂组合物，其中L

实施方案193.根据实施方案159-192中任一项所述的气雾剂组合物，其中每个终止基团独立地是C

实施方案194.根据实施方案193所述的气雾剂组合物，其中每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C

实施方案195.根据实施方案194所述的气雾剂组合物，其中每个终止基团独立地是C

实施方案196.根据实施方案194所述的气雾剂组合物，其中每个终止基团独立地是C

实施方案197.根据实施方案193所述的气雾剂组合物，其中每个终止基团独立地是C

实施方案198.根据实施方案195或197所述的气雾剂组合物，其中每个终止基团独立地是C

实施方案199.根据实施方案159-192中任一项所述的气雾剂组合物，其中每个终止基团独立地选自表3中阐述的那些或其子集；或其中每个终止基团独立地选自：

实施方案200.根据实施方案131-158中任一项所述的气雾剂组合物，其中所述可电离阳离子脂质选自表4或表5中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案201.一种用选择性器官靶向(SORT)脂质配制的治疗剂的高效力剂型，所述剂型包含：与脂质组合物组装的所述治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的所述SORT脂质，其中所述SORT脂质在所述剂型中的存在量足以在与参考脂质组合物所需的情况相比(例如，至少约1.1分之一、2分之一、3分之一、4分之一、5分之一、6分之一、7分之一、8分之一、9分之一、或10分之一)更低的所述治疗剂剂量下实现治疗性作用；任选地，其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案202.一种用选择性器官靶向(SORT)脂质配制的治疗剂的高效力剂型，所述剂型包含：与脂质组合物组装的所述治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的所述SORT脂质，其中所述治疗剂(例如，异源多核苷酸)以不超过约2毫克/公斤(mg/kg或mpk)体重的剂量存在于所述剂型中；任选地，其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案203.根据实施方案201或202所述的剂型，其中所述脂质组合物进一步包含(iii)磷脂。

实施方案204.根据实施方案201-203中任一项所述的剂型，其中所述剂型是气雾剂剂型。

实施方案205.根据实施方案201-203中任一项所述的剂型，其中所述剂型是静脉内剂型。

实施方案206.根据实施方案201-205中任一项所述的剂型，其中所述剂型用于肺递送。

实施方案207.根据实施方案201-206中任一项所述的剂型，其中所述治疗剂(例如，异源多核苷酸)以不超过约1.0、0.5、0.1、0.05或0.01mg/kg体重的剂量存在于所述剂型中。

实施方案208.根据实施方案201-207中任一项所述的剂型，其中所述治疗剂(例如，异源多核苷酸)以不超过约5或2毫克/毫升(mg/mL)的浓度存在于所述剂型中。

实施方案209.根据实施方案201-208中任一项所述的剂型，其中所述剂型被配制为根据实施方案131-200中任一项所述的气雾剂组合物。

实施方案210.一种用于通过雾化递送至受试者的一种或多种肺细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用气雾剂组合物，所述气雾剂组合物包含与脂质组合物组装的治疗剂，所述脂质组合物包含：(i)可电离阳离子脂质；以及(ii)与所述可电离阳离子脂质分离的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而将所述治疗剂递送至所述受试者的肺的所述一种或多种肺细胞；任选地，其中所述SORT脂质选自表6中阐述的那些或其药学上可接受的盐，或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。

实施方案211.根据实施方案210所述的方法，其中所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺上皮细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。

实施方案212.根据实施方案210或211所述的方法，其中所述方法在所述受试者的至少约2％、5％或10％的肺纤毛细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。

实施方案213.根据实施方案210-212中任一项所述的方法，其中所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺分泌细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。

实施方案214.根据实施方案210-213中任一项所述的方法，其中所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺棒状细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。

实施方案215.根据实施方案210-214中任一项所述的方法，其中所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺杯状细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。

实施方案216.根据实施方案210-215中任一项所述的方法，其中所述方法在所述受试者的至少约5％、10％、15％或20％的肺基底细胞中提供(例如，治疗)有效量或活性的所述治疗剂。

实施方案217.根据实施方案210-216中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物包含磷脂。

实施方案218.根据实施方案210-217中任一项所述的方法，其中包含与所述脂质组合物组装的所述治疗剂的所述气雾剂组合物是气雾剂组合物。

实施方案219.根据实施方案210-218中任一项所述的方法，其中所述气雾剂组合物是根据实施方案131-200中任一项配制的。

实施例

实施例1.DOTAP或DODAP修饰的脂质纳米颗粒的制备

脂质纳米颗粒(LNP)是用于体内核酸递送的最有效的载体类别。历史上，有效的LNP由4种组分构成：可电离阳离子脂质、两性离子磷脂、胆固醇和脂质聚(乙二醇)(PEG)。然而，这些LNP仅导致核酸的一般递送，而不是器官或组织靶向递送。LNP典型地仅将RNA递送至肝。因此，努力寻求新配制品，以提供靶向核酸递送。

在添加或不添加永久阳离子脂质的情况下，将四种典型类型的脂质以15:15:30:3的摩尔比混合。简言之，通过混合树枝状聚合物或树枝基元脂质(可电离阳离子)、DOPE(两性离子)、胆固醇、DMG-PEG和DOTAP(永久阳离子)来制备LNP。可替代地，DOTAP可以取代DODAP，以产生包含DODAP的LNP。DODAP和DODAP的结构在图1中示出。可以使用的多种树枝状聚合物或树枝基元脂质在图2中示出。

为了制备LNP配制品，树枝状聚合物或树枝基元脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG以所希望的摩尔比溶解在乙醇中。将mRNA溶解在柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 4.0)中。然后通过将mRNA以3:1的体积比(mRNA:脂质，v/v)快速混合到脂质溶液中，将mRNA稀释到脂质溶液中，以实现40:1的重量比(总脂质:mRNA)。然后将此溶液在室温下孵育10min。为了形成DOTAP修饰的LNP配制品，将mRNA溶解在1×PBS或柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 4.0)中，并且快速混合到含有5A2-SC8、DOPE、胆固醇、DMG-PEG和DOTAP的乙醇中，固定重量比为40:1(总脂质:mRNA)且体积比为3:1(mRNA:脂质)。配制品命名为X％DOTAP Y(或X％DODAP Y)，其中X表示总脂质中的DOTAP(或DODAP)摩尔百分比，并且Y表示树枝状聚合物或树枝基元脂质的类型。可替代地，配制品可以命名为Y X％DOTAP或Y X％DODAP，其中X表示总脂质中的DOTAP(或DODAP)摩尔百分比，并且Y表示树枝状聚合物或树枝基元脂质的类型。

实施例2.SORT LNP稳定性

测试LNP的稳定性。使用微流体混合方法或十字形/三通混合方法产生5A2-SC820％ DODAP(“肝-SORT”)和5A2-SC8 50％ DOTAP(“肺-SORT”)。将不同LNP配制品通过尺寸、多分散性指数(PDI)和ζ电位来表征，通过针对每种配制品各3次动态光散射进行检查。LNP的特征示出在表8中。

表8：SORT LNP特征

使用Ribogreen RNA测定来测试包封效率(Zhao等人，2016)。简言之，当mRNA溶解在酸性缓冲液(10mM柠檬酸盐，pH 4)中时，mRNA以>95％的效率包封在LNP中。在28天内观察两种类型的LNP(5A2-SC8 20％ DODAP(“肝-SORT”)和5A2-SC8 50％DOTAP(“肺-SORT”))的特征。图6示出了LNP在28天进程内的特征变化。

另外，为了测量LNP在溶液中的稳定性，在小鼠中观察LNP的稳定性和由此产生的mRNA表达。简言之，向小鼠静脉内注射0.1mg/kg，并且进行体内观察。注射后5h添加萤光素并且使其可视化。如图7所示，肺-SORT LNP在肺中产生了组织特异性辐射，即使在14天后其仍然很高，而信号在第21天和第28天有轻微衰减。图8示出了在用肺-SORT或肝-SORT处理后的特定时间小鼠器官的图像。

实施例3.TR mRNA在不同细胞类型中的表达

将TR mRNA加载到20％ DODAP 4A3-SC7 LNP或10％ DOTAP 5A2-SC8 LNP中，并且使用顶端推注给药将其递送至分化良好的人支气管上皮细胞培养物中。在各种细胞类型中观察细胞表达，并且绘制表达TR的细胞类型的百分比。如图3的上图所示，20％ DODAP 4A3-SC7 LNP优先引起分泌细胞表达TR，而10％ DOTAP 5A2-SC8 LNP使纤毛细胞优先表达TR。这种优先递送可以允许递送到肺的治疗物优先影响肺中的特定细胞类型。还将TR mRNA加载到没有SORT脂质(例如DODAP或DOTAP)的LNP中以鉴定DODAP或DOTAP如何影响效力。如图5的下图所示,与没有DOTAP或DODAP的相应LNP相比，包含DOTAP或DODAP的LNP显示出TR表达增加。

实施例4.经由吸入气雾剂递送的LNP的萤光素酶活性和组织病理学

将Luc mRNA加载到多种LNP(包括包含SORT脂质和树枝状聚合物或树枝基元的LNP)中。产生4A3-SC7 20％ DODAP、4A3-SC7 10％ DODAP、5A2-SC8、5A2-SC810％ DOTAP的LNP并且加载Luc mRNA。通过雾化(Aerogen solo)将0.4/2/8mg LNP配制的Luc2 mRNA(1mg/ml))递送至pie室中，估计(未测量)每只小鼠的递送剂量为0.01、0.06或0.22mg/kg。小鼠为7周龄B6雄性白化体小鼠。在递送LNP后5h，向小鼠施用萤光素。检测萤光素酶活性，作为递送至靶标的量度。图4示出了萤光素酶在小鼠中的分布和表达，证明了表达是成功的并且LNP的递送可以使用吸入气雾剂递送来进行。

实施例5.含有EPC的LNP的毒性

通过对人支气管上皮细胞进行顶端推注给药，测试包含乙基磷酸胆碱(EPC)代替DOTAP或DODAP的LNP的毒性。释放的乳酸脱氢酶(LDH)％被用作细胞死亡的度量，并且指示LNP的毒性。在处理之前(处理前)和处理后24小时检测LDH的释放。如图5所示，50％ DOTAPLNP的处理导致约15％的LDH释放，而EPC没有显示出显著的LDH释放％。重要的是，DOTAP和EPC具有相似的季胺部分，这表明针对细胞靶向的活性可能是相似的，但EPC的毒性要小得多。

实施例6.DNAI1 mRNA的产生

在GenScript合成对应于DNAI1基因的DNA。用HindIII和EcoRI HF限制性内切酶消化pUC57/DNAI1。此外，将消化的pVAX120载体和DNAI1 cDNA进行凝胶纯化并且连接(DNAI1的ORF是密码子优化的)。利用未修饰的核苷酸，使用标准的体外翻译程序来产生RNA。使用痘苗病毒加帽系统和帽2'-O-甲基转移酶进行加帽反应。

实施例7.递送至受试者的DNAI1 mRNA的检测。

通过施用如本文别处所述的组合物对患有或疑似患有原发性纤毛运动障碍(PCD)的受试者给予治疗。定期监测受试者肺中的DNAI1表达。取受试者的肺组织样品，其包含肺纤毛细胞。收获细胞并且制备用于RNA分离。使用第一链合成试剂盒和随机六聚体(randomhexamer)从RNA产生cDNA。使用一组正向和反向引物和荧光探针(特异于DNAI1)和特异于用于表达归一化的对照或管家基因的第二组运行qPCR反应。使用对应于DNAI1探针的荧光读数来检测DNAI1的表达。

实施例8.在hBE中用DNAI1 mRNA的功能拯救

将重复剂量的本文所述脂质组合物递送至缺乏DNAI1的人基底上皮细胞(hBE)，如图10A的第一列中所述。研究结果总结在图10E的左列中。在存在粘液的情况下观察到细胞摄取。处理后纤毛的活动是与正常对照可比较的。纤毛的正常摆动频率和同步波样运动得到恢复。图10B的第一列进一步说明了DNAI1-HA mRNA靶向纤毛细胞，DNAI1-HA和乙酰化微管蛋白(纤毛细胞的生物标记物)的免疫荧光显示了在给药后72h在hBE中DNAI1-HA的表达。

实施例9.在小鼠中的效力和耐受性研究

在小鼠中测试单次施用和递增剂量的包含萤光素酶mRNA有效载荷的本文所述脂质组合物的效力和耐受性。所述研究的关键特征总结在图10A的中间列中。将小鼠用经由雾化器气雾化的包含可电离阳离子脂质(例如，4A3SC7、5A2SC8)和SORT脂质(例如，DODAP、DOTAP)的脂质组合物处理。测量萤光素酶的表达以评估效力，并且测量组织病理学以评估耐受性。在用脂质组合物处理的小鼠的全身图像中观察到良好的分布和高水平的蛋白质表达，诸如图10E的中列所描绘的那些。组织病理学结果是与对照动物可比较的，表明耐受性高。测试短递送时间(例如，5-8min)和所用的低浓度(例如，0.5mg/mL)的结果为增加剂量提供了支持。

实施例10.在NHP肺组织中的DNAI1表达

在非人灵长类动物(NHP，食蟹猴)研究中评价两种脂质组合物RTX0001(5种组分)和RTX0004(4种组分)以证明在肺组织中的DNAI1表达。RTX0001包含4A3-SC7、DODAP、DOPE、胆固醇和DMG-PEG，其摩尔比为分别19.05:20:19.05:38.09:3.81。RTX0004包含5A2-SC8、DOPE、胆固醇和DMG-PEG，其摩尔比为分别19.05:23.81:47.62:4.76。所述研究的主要特征总结在图10A左侧第四列中。进一步的实验细节总结在图10B的中间列中。简言之，将两种配制品(一种包含SORT LNP配制品(包含例如DODAP、DOTAP)并且另一种包含LNP配制品)通过插管以单剂量递送至NHP。两种组合物都含有DNAI1-HA mRNA。在0.1mg/kg或更少的气雾化组合物剂量下，在6小时和24小时，在NHP的肺中检测DNAI-HA mRNA和DNAI1-HA蛋白表达。图10C的右列示出了在处理后6小时在经处理的NHP的肺组织中观察到的DNAI1-HA mRNA和相应蛋白质的表达。包含SORT分子的组合物导致在NHP的肺中观察到更强的DNAI1-HA和DNAI1-HA mRNA表达。未检测到不良临床观察或耐受性问题，排除了在较高剂量或多剂量环境下使用配制品。图10D示出了通过用经修饰的核苷酸m1Ψ替代mRNA中100％的U，使细胞因子反应最小化。

实施例11.筛选脂质配制品

筛选包含可电离阳离子脂质(例如，4A3SC7、5A2SC8)的有或没有SORT脂质(例如，DODAP、DOTAP)的脂质组合物，以能够实现更长的储存和运输，降低所需剂量，缩短雾化时间(例如，雾化流速)并且增加耐受性，如图10A左侧第二列中所述。通过改变可电离脂质、SORT脂质、缓冲液身份(例如，PBS)和浓度、盐身份(例如，NaCl)和浓度、冷冻保存剂身份(例如，蔗糖、海藻糖、甘露醇、木糖醇、乳糖)和浓度、N/P比和PEG含量来筛选脂质组合物。对于筛选N/P比：记录FA、psd、游离％和产量，评估效力和耐受性/毒性(例如，纤毛活动、LDH、细胞因子)，并且评价雾化时间(例如，单剂量、小鼠模型)。基于粒度、多分散性指数(PDI)、包封效率(游离mRNA百分比)来评价各种配制品。然后在人基底上皮(hBE)细胞培养物、小鼠模型和NHP小鼠模型中针对效力、靶向效率/特异性、稳定性、和耐受性/毒性(例如，纤毛活动、LDH、细胞因子、血液化学标记物)筛选脂质组合物。

实验细节和读出内容总结在图10A左侧第二列中。表9总结了具有不同N/P比的三种不同配制品。

表9：测试脂质配制品的效力、稳定性和耐受性

此外，测试不存在脂质组合物的气雾剂组合物(例如，仅一种或多种盐、一种或多种缓冲液、一种或多种冷冻保存剂)以确定每种组分及其浓度对雾化流速的影响。

气雾化脂质组合物可以提供与通过静脉内另外施用脂质组合物的协同作用。

实施例12.用于原发性纤毛运动障碍的mRNA治疗的临床研究

通过施用如本文别处所述的组合物对患有或疑似患有原发性纤毛运动障碍(PCD)的成年受试者给予治疗。可以基于在40％与90％之间的DNAI1和/或FEV1的致病突变来选择受试者。所述研究为单次递增剂量(SAD)、多次递增剂量(MAD)或开放标签扩展(OLE)研究。将受试者分为安慰剂、低剂量和高剂量处理组，并且接受相应量的配制品(或安慰剂)。观察受试者的安全性和耐受性以及预测FEV1百分比的绝对变化。用所述配制品处理的受试者显示出高耐受性以及预测FEV1百分比增加的迹象。图9A总结了这项研究的主要组成部分。图9B说明了在气液界面(ALI)培养的纤毛上皮细胞(小鼠气管上皮细胞或MTEC)的离体模型，用于测试本文所述DNAI1 mRNA处理的拯救功效。从PCD条件性KO小鼠模型(Dnaic1 KO)获得MTEC，并且在气液界面培养。所述细胞(纤毛细胞、杯状细胞或基底细胞)形成紧密连接并且产生粘液，从而重塑和恢复了与天然上皮相似的特性。图9C说明了通过DNAI1 mRNA处理拯救了KO小鼠细胞中的纤毛活动，并且在停止给药后，治疗效果保持稳定达数周。在分化期间，从第7天开始，对Dnaic1 KO小鼠细胞进行每周三次基础处理。最后一次给药是在第19天阿尔芒蒂耶尔(Armentieres)。在开始给药后5天，首次检测到经处理的Dnaic1 KO培养物中的纤毛活动。到第24天，经处理的Dnaic1 KO细胞的活动达到正常(相对于PCD/无TAM对照)细胞的36％。在最后一次处理后23天(评估的最后一个时间点)，经处理的Dnaic1 KO细胞的纤毛活动保持高于正常细胞的20％(超过最大值的50％)。在研究的整个持续时间内，在未处理的Dnaic1 KO培养物中未检测到纤毛活动。

实施例13.在NHP中的剂量发现和重复施用研究

将如本文所述的脂质组合物用于非人灵长类动物(NHP)的剂量发现和重复施用研究。在图10A的最右列中描述了这种研究的概述。测试脂质组合物以确定用于试验新药研究的临床候选物，确定适当的剂量和给药频率，确定最大耐受剂量，并且选择用于临床开发的雾化装置。图10B中最右边三列总结了所述研究的这些和其他目标。实验读出内容是如通过上述技术测量的药代动力学(PK)、耐受性、生物分布和免疫反应。

实施例14.细胞中DNAI1-HA mRNA表达的检测

在气液界面(ALI)培养人DNAI1敲低细胞。将培养的细胞用单剂量的含有DNAI1-HAmRNA的LNP(10μg/mL培养基)处理。在给药后24小时、48小时、7天和14天，用抗乙酰化微管蛋白(纤毛细胞标记物)和抗HA抗体对细胞进行免疫染色。图11A示出了这些细胞在所指示时间点的免疫荧光成像，证明了靶细胞成功表达DNAI1-HA mRNA。看到DNAI1-HA到纤毛轴丝中的整合在处理后48-72小时之间达到峰值。将分化良好的人DNAI1敲低细胞用单剂量的本文所述DNAI1-HA mRNA的配制品处理，并且用抗乙酰化微管蛋白和抗HA免疫染色。新表达的DNAI1-HA到纤毛的轴丝中的整合在处理后48至72小时之间达到峰值。在单次施用后超过24天内，在纤毛轴丝中检测到DNAI1-HA。重复施用导致纤毛活动的拯救，其在停止给药后保持数周。图11B说明了新制造的带HA标签的DNAI1迅速掺入人支气管上皮细胞(hBE)的纤毛中。将分化良好的人DNAI1敲低细胞用单剂量的LNP配制的DNAI1-HA(10μg在2ml培养基中)处理(基础施用)。在给药后72小时，用抗乙酰化微管蛋白和抗HA对细胞进行免疫染色。超过90％的纤毛细胞呈DNAI1-HA阳性。

实施例15.上皮细胞类型的生物标记物和多重免疫荧光组套

开发了一种多重免疫荧光组套，以根据某些生物标记物区分某些上皮细胞类型。表10中总结了组套中的特定生物标记物和靶向的相应细胞类型。图12示出了组套结果。在每个组套中，经由免疫荧光通过一种或多种生物标记物的存在来鉴定相应细胞类型。

表10：多重IF组套细胞类型和相应标记物

实施例16.在LNP配制品中观察特异性细胞趋向性特征

使用Vitrocell雾化将分化良好的人支气管上皮(hBE)细胞用LNP A、B或D(200μg)处理一次。基于细胞标记物区分纤毛细胞、基底细胞、棒状细胞和杯状细胞，如表11中所详述。图13A示出了用tdTomato mRNA成功转染的每种细胞类型的百分比，如通过表达tdTomato的每种细胞类型的百分比(TR阳性％)来测量，并且证明了每种LNP配制品的特异性细胞趋向性特征。图13B示出了在敲低的原代hBE ALI培养物中，配制的DNAI1 mRNA的气雾剂施用拯救了纤毛活动。从ALI后第25天(培养时期)开始，将分化良好的人DNAI1-敲低细胞(hBE)每周用LNP配制的DNAi1(每次Vitrocell雾化300μg)处理2次。在ALI后第50天施用最后一个剂量。在开始给药后7天，首次检测到经处理的DNAI1敲低培养物中纤毛活动增加。获救的纤毛活动具有正常的摆动频率(9-17Hz)并且看起来是同步的。

表11：用于区分细胞类型的细胞标记物

实施例17.基底细胞和分泌细胞中Tomato Red(TR)的表达

分析在HBE培养物(人支气管上皮细胞培养物)中不同细胞类型中TR(Tomato Red)mRNA的表达。将TR mRNA加载到20％ DODAP-4A3 SC7 40:1/PBS(图14A)、4A3-SC7-20％DODAP 40:1/缓冲液27/冷冻(图14B)、4A3-SC7-20％ DODAP 30:1/缓冲液27/冷冻(图14C)、4A3-SC7 20％14:0EPC，30:1/缓冲液27/冷冻(图14D)、4A3-SC720％14:0TAP，30:1/缓冲液27冷冻(图14E)中的一种中并且通过气雾剂递送来递送到分化良好的人支气管上皮培养物中。观察各种细胞类型中的TR蛋白表达，并且绘制不同细胞类型中阳性TR细胞的百分比。观察到的细胞类型和相应的细胞标记物如实施例16中所述。如图14的每个图所示，在经理的培养物中，主要在基底细胞和分泌细胞中看到TR。注意HBE培养物具有大量的杯状细胞。

实施例18.DNAI1-HA在来自NHP肺样品的呼吸系统上皮细胞中表达

通过气雾剂递送，用低剂量的包含如本文所述SORT脂质的脂质组合物中所含的DNAI1-HA mRNA处理非人灵长类动物(NHP)。使用多重免疫荧光定量来自经处理的动物的肺组织块中的DNAI1-HA表达。在处理后6小时(6h)或处理后24小时(24h)分析肺组织块，其中含有缓冲液的脂质组合物作为对照(媒介物)。每种细胞类型的细胞标记物如在实施例6中详述。如图15和图16A-图16B所示，在来自用含有DNAI1-HA mRNA的脂质组合物处理的NHP的肺样品中检测到DNAI1-HA表达。此外，DNAI1-HA表达与上皮细胞(包括棒状细胞、基底细胞和纤毛细胞)的标记物共定位，表明脂质组合物优先靶向呼吸系统上皮。将单次0.4mg/kg施用的吸入型LNP配制的DNAI1-HA mRNA引入两只NHP(一只雄性和一只雌性)。在给药后6小时收集肺和支气管切片。通过将来自每只动物的4个肺切片的细胞计数(计数约500,000至1,400,0000个细胞)和1个支气管切片的细胞计数(计数约16,000至65,000个细胞)的细胞计数合并来计算DNAI1-HA阳性的百分比。

实施例19.在敲低的原代支气管人ALI培养物中，配制的DNAI1 mRNA的气雾剂施用拯救了纤毛活动

在ALI培养人原代支气管上皮DNAI1敲低细胞。在ALI培养时期后第25天开始，将分化良好的细胞用LNP C(300μg/d，使用Vitrocell雾化)处理2次/周(T，F)。在ALI培养后第50天施用最后一个剂量。在某些剂量后，通过截面积(CSA)和摆动频率来测量纤毛活动。图17示出了在开始给药后7天，首次检测到经处理的DNAI1敲低培养物中纤毛活动增加。

实施例20.KO-原代气管小鼠ALI培养物中纤毛活动的延长拯救

从Dnaic1小鼠中收获小鼠气管上皮细胞(MTEC)。如实施例8所述培养细胞，并且生长直至分化。将正在分化的Dnaic1敲除(KO)小鼠细胞用低剂量的包含本文公开的SORT化合物并且携带DNAI1 mRNA的脂质组合物处理。在某些时间点确定如通过纤毛截面积(CSA)和纤毛摆动频率(CSF)测量的纤毛活动。野生型(WT)和PCD/无TAM细胞用作阳性对照，并且未处理的Dnaic1 KO细胞用作阴性对照。经处理的Dnaic1 KO细胞中的纤毛活动可能高于未处理的Dnaic1 KO细胞。

实施例21.另外的SORT分子

在小鼠IV研究中针对强肺或脾特异性和耐受性筛选SORT脂质。图10B左列第二个讨论了通过筛选的SORT脂质实现的细胞趋向性。评价五种SORT分子，并且与RTX0001相比，导致在hBE细胞培养物中2-7倍的更高效力。

实施例22.稳定性和功效研究

筛选用于冷冻的缓冲液和冷冻保存剂、浓度、重量渗透压摩尔浓度和离子强度。某些缓冲液在不同的SORT脂质和脂质组合物中提供稳定性。筛选的缓冲液导致一些配制品在冷冻/解冻循环后粒度增加。所有配制品在冷冻/解冻循环后的最终粒度导致可接受的粒度范围(<130nm)。

在体外和体内雾化实验中，在冷冻条件下储存(冷冻/解冻)后测试配制品的效力和耐受性。将在冷冻/解冻循环下和在没有冷冻/解冻的情况下在筛选的缓冲液中的具有SORT脂质的脂质组合物雾化在hBE中。一些配制品具有很小的效力变化(增加或降低)，但所有配制品都维持高于RTX0001的效力。研究表明，在用于脂质组合物的筛选的缓冲液中保持高效力。

实施例23.另外的筛选研究

在降低的25％和50％的总脂质/mRNA比(N/P比)的情况下评价包含SORT脂质的脂质组合物。对于一些脂质组合物，50％的mRNA减少导致在hBE和小鼠雾化两者中效力少量降低，而其他测试的脂质组合物保持其效力。与RTX0001相比，在总脂质减少50％的情况下测试时，观察到包含SORT脂质的两种脂质组合物具有粒度的少量增加。

在PEG脂质含量的变化和不同的N/P比的情况下筛选脂质组合物。随着PEG脂质量的减少，观察到粒度少量增加。筛选的PEG浓度范围提供了120nm粒度。

结果支持了脂质组合物中PEG脂质％的变化(例如，增加)可能导致效力变化(例如，增加)。在hBE雾化研究中，PEG脂质量的降低导致效力增加，并且PEG脂质量的增加导致效力降低。

实施例24.SORT NHP研究

检查NHP(食蟹猴(Cynomolgus monkey)，长尾猕猴(Macaca fascicularis)，起源于毛里求斯，2.5至3岁，雄性：2.7-3.3kg/雌性：2.5-3.0kg；总共N＝18只，N＝8只/剂量组(4只雄性/4只雌性)，N＝2只媒介物对照(1只雄性/1只雌性))通过使用口鼻面罩吸入进行的气雾剂递送的功效。递送剂量为0.12mg/kg或0.24mg/kg。在施用RTX0052(本文所述脂质组合物)后6小时、24小时、72小时或7天时检查DNAI1的表达。确定在施用媒介物(组1)；低剂量(组2，目标剂量为0.08mg/kg；在30分钟内目标气雾剂浓度Ec为0.0052mg/L)；和高剂量(组3，目标剂量为0.24mg/kg；在90分钟内目标气雾剂浓度Ec为0.0052mg/L)的NHP中确定功效的读出内容。图18A说明了施用于NHP的气雾剂浓度，并且图18B说明了递送至NHP的剂量的示例性测量。图18C说明了气雾剂组合物液滴的表征(MMAD：质量中值空气动力学直径；GSDL：几何标准偏差)。液滴表征结果在用于吸入毒性研究的经济合作与发展组织(OECD)指南433的推荐范围内，其中MMAD≤4μm并且GSD在1.0与3.0之间的。

通过液相色谱和质谱法(LC/MS-MS)确定NHP血液、肺、肝和脾组织中的液滴(脂质)的测量。样品基质：血液(血浆和血细胞级分)、肺、肝、脾。血浆中可电离脂质的定量限(LOQ)为4ng/ml。血细胞级分中可电离脂质的LOQ为4ng/ml。肺组织细胞级分中可电离脂质的LOQ为10ng/ml。血浆中肉豆蔻酰二甘油酯(DMG-PEG)的PEG化的LOQ为20ng/ml。血细胞级分中DMG-PEG的LOQ为40ng/ml。肺组织中DMG-PEG的LOQ为20ng/ml。肺组织细胞级分中SORT脂质的LOQ为10ng/ml。血浆中SORT脂质的LOQ为1ng/ml。血细胞级分中SORT脂质的PEG化的LOQ为1ng/ml。肺组织中SORT脂质的LOQ为2ng/ml。图19A-图19C说明了在低剂量和高剂量的两个NHP组的肺中LNP脂质(来源于气雾剂液滴)的测量(图19A：在肺中的可电离脂质；图19B：在肺中的DMG-PEG；以及图19C：SORT脂质)。表12说明了在NHP的处理样品中对DNAI1-HA的检测。对于表12，每只动物处理2组肺样品(共6个)，并且测定：蛋白质印迹：抗HA和抗DNAI1；和ELISA：DNAI1-HA(捕获抗体：抗HA，检测Ab：抗DNAI1)。图20A说明了通过蛋白质印迹获得的在NHP肺中的DNAI1-HA蛋白表达。图20B说明了通过ELISA获得的在NHP肺中的DNAI1-HA蛋白表达。

表12.NHP样品中DNAI1-HA的检测

基于临床观察；身体和器官重量；临床化学和血液学；支气管肺泡灌洗液(BAL)细胞差异；血清和BAL中的细胞因子和补体水平；以及组织病理学确定RTX0052的耐受性。没有观察到认为与RTX0052处理相关的不良临床体征。在两个处理组之间没有观察到体重的显著变化。也没有与RTX0052明显相关的器官重量变化(绝对和相对体重)。在所有剂量水平下，在雄性和雌性的其他组织/器官中观察到的所有变化(有/没有统计学显著性)都与剂量和/或性别无关，或是量级微小的或在ITR背景范围内，因此被认为是偶然的或与程序/应激相关的。图21A说明了AST、ALT和ALP的临床化学测量。用RTX0052处理后，未观察到AST、ALT或ALP的显著变化。对于血液学和凝血，在暴露结束后6小时、24小时和72小时以及在吸入暴露后7天的观察中，测量出猴的血液学参数没有RTX0052-DNAI1相关变化。一些雌性猴在暴露结束后6小时、72小时和7天的血液中白血细胞和嗜中性粒细胞计数相对较高，但不被认为是不良的。在暴露结束后6小时、24小时和72小时以及在吸入暴露后7天的观察中，测量出猴的凝血参数没有RTX0052-DNAI1相关变化。图21B说明了白血细胞和嗜中性粒细胞的血液学计数。在媒介物组和RTX0052组两者的处理后测量中观察到嗜中性粒细胞的一些增加。图21C说明了BAL细胞差异。对于细胞因子和补体分析，在NHP血清和BAL中测量细胞因子水平。测量的分析物包括IFN-α2a、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IP-10、MCP-1和TNFα。所有细胞因子水平均在与正常报告水平相同的范围内。BAL结果同样正常，因为所有细胞因子均处于或低于血清定量下限(LLOQ)(IL-6、IL-10和MCP-1除外)。表13说明了分析物的血清和BAL LLOQ测量。图21D说明了血清中细胞因子的示例性测量。图21E说明了BAL中细胞因子的示例性测量。图21F说明了分别在血浆和血清中C3a和sC5b-9测量的示例性补体测量。图21G说明了在BAL中C3a和sC5b-9测量的示例性补体测量。

表13.血清和BAL中的LLOQ分析物测量

基于本文进行的组织病理学分析，没有证据表明与测试项目相关的宏观发现。所有总体观察都被认为是偶然的，因为它们是散发的并且与剂量无关，发生率低，或发生在对照和处理动物中或缺乏相关的组织病理学相关因素。在以0.24mg/kg的目标总吸入剂量水平处理的3/8只动物的肺中观察肺泡混合细胞浸润的最小至轻度增加。由于低的发生率和严重程度，这种变化被认为潜在地与测试项目有关，但并非是不良的。所有其他显微镜观察结果都被认为是偶然的、背景的或痛苦的变化，因为它们具有低的发生率或严重程度，或发生在对照和测试项目处理的动物中。总体处理的耐受性良好：在临床观察、临床化学或补体测量中未看到变化。观察到血液和BAL嗜中性粒细胞轻微和短暂增加。所有细胞因子水平均在正常报告范围内。在血清和BAL中都观察到IL-6水平少量的短暂增加。组织病理学指示了3/8只动物的肺泡混合细胞浸润的最小至轻度增加。

实施例25.SORT大鼠研究

检查大鼠(Sprague-Dawley(SD)，8至11周龄，雄性：300-350g/雌性：175-250g；总共N＝130，N＝40只/剂量组(20只雄性/20只雌性)，N＝10只媒介物对照(5只雄性/5只雌性))以了解使用流过式暴露系统通过吸入进行的气雾剂递送的功效。递送剂量为低(0.25mg/kg目标剂量)、中(0.49mg/kg目标剂量)或高(0.99mg/kg目标剂量)。在施用RTX0052后6小时、24小时、72小时或7天时检查DNAI1的表达。确定在施用媒介物(组1)；低剂量(组2，目标剂量为0.25mg/kg；在60分钟内目标气雾剂浓度Ec为0.0055mg/L)；中剂量(组3，目标剂量为0.49mg/kg；在120分钟内目标气雾剂浓度Ec为0.0055mg/L)；和高剂量(组4，目标剂量为0.99mg/kg；在240分钟内目标气雾剂浓度Ec为0.0055mg/L)的大鼠中确定RTX0052功效的读出内容。图22A说明了施用于大鼠的气雾剂浓度。图22B说明了在三个阶级中气雾剂均匀性的示例性测量。图22C说明了递送至大鼠的剂量的量。图22D说明了气雾剂组合物液滴的表征(MMAD：质量中值空气动力学直径；GSDL：几何标准偏差)。液滴表征结果在用于吸入毒性研究的经济合作与发展组织(OECD)指南433的推荐范围内，其中MMAD≤4μm并且GSD在1.0与3.0之间的。

通过液相色谱和质谱法(LC/MS-MS)确定大鼠血液、肺、肝和脾组织中的液滴(脂质)的测量。样品基质：血液(血浆和血细胞级分)、肺、肝、脾。血浆中可电离脂质的定量限(LOQ)为4ng/ml。血细胞级分中可电离脂质的LOQ为4ng/ml。肺组织细胞级分中可电离脂质的LOQ为10ng/ml。血浆中肉豆蔻酰二甘油酯(DMG-PEG)的PEG化的LOQ为20ng/ml。血细胞级分中DMG-PEG的LOQ为40ng/ml。肺组织中DMG-PEG的LOQ为20ng/ml。肺组织细胞级分中SORT脂质的LOQ为10ng/ml。血浆中SORT脂质的LOQ为1ng/ml。血细胞级分中SORT脂质的PEG化的LOQ为1ng/ml。肺组织中SORT脂质的LOQ为2ng/ml。图23A-图23C说明了在低剂量、中剂量和高剂量大鼠组的肺中LNP脂质(来源于气雾剂液滴)的测量(图23A：在肺中的可电离脂质；图23B：在肺中的DMG-PEG；以及图23C：SORT脂质)。图24A说明了通过蛋白质印迹获得的在大鼠肺中的DNAI1-HA蛋白表达。在1.2mg/kg 6小时组中，10个肺样品中有6个呈DNAI1-HA阳性。图24B说明了通过ELISA获得的在大鼠肺中的DNAI1-HA蛋白表达。

基于临床观察确定RTX0052的耐受性。没有与RTX0052-DNAI1处理相关的临床体征。观察到在两个处理组之间没有的显著体重变化。食物消耗不受RTX0052-DNAI1处理的影响。没有与RTX0052-DNAI1明显相关的器官重量变化(绝对和相对体重)。在所有剂量水平下，在雄性和雌性的其他组织/器官中观察到的所有变化(有/没有统计学显著性)都与剂量和/或性别无关，或是量级微小的或在ITR背景范围内，因此被认为是偶然的或与程序/应激相关的。

图25A说明了在经处理的大鼠中AST、ALT和ALP的临床化学测量。在暴露结束后6小时、24小时和72小时以及在吸入暴露后7天的观察中，测量出大鼠的临床参数没有RTX0052-DNAI1相关变化。一些平均值与对照值不同(有统计学显著性和无统计学显著性)，但差异与剂量和/或性别无关或是量级微小的。因此，它们被认为没有生物学显著性。图25B说明了在经处理的大鼠中白血细胞和嗜中性粒细胞的血液学计数。对于血液学和凝血，在暴露结束后6小时、24小时和72小时以及在吸入暴露后7天的观察中，测量出大鼠的血液学参数没有RTX0052-DNAI1相关变化。在暴露结束后6小时、24小时和72小时以及在吸入暴露后7天的观察中，测量出大鼠的凝血参数没有RTX0052-DNAI1相关变化。一些平均值与对照值不同(有统计学显著性和无统计学显著性)，但差异与剂量和/或性别无关或是量级微小的。因此，它们被认为没有生物学显著性。在媒介物组和RTX0052组两者的处理后测量中观察到嗜中性粒细胞的一些增加。图25C说明了在经处理的大鼠中的BAL细胞差异。图25D说明了在经处理的大鼠中α-2-巨球蛋白的示例性测量。A2M是大鼠中有记载的炎症标记物。在反复急性炎性刺激后12至48小时血清水平增加。对于安全性评价，A2M是大鼠中急性期反应的优选标记物。在RTX0052处理后，未观察到A2M血清水平的显著变化。

宏观发现是，无论处理大鼠的终止时间点(暴露结束后6小时、24小时和72小时以及暴露后7天)如何，在大鼠中的所有宏观发现都被认为是偶然或自发的并且与RTX0052-DNAI1无关。显微镜发现是，无论处理大鼠的终止时间点(暴露结束后6小时、24小时和72小时以及暴露后7天)如何，本研究大鼠的显微镜病理学发现没有指示由于RTX0052-DNAI1引起的全身毒性或局部毒性(口咽、鼻咽、气管、喉、肺)。在暴露结束后7天实施安乐死的一只终末组2雄性大鼠(2016G)中，肝尾状叶出现多灶性全小叶性肝出血性凝固性坏死和病灶周围急性嗜中性粒细胞炎症，这与其宏观发现相关。该显微镜发现被认为是自发变化，其与RTX0052-DNAI1无关，而是与大鼠肝尾状叶的自发扭转相关(1)。在暴露结束后72小时实施安乐死的另一只终末组2雌性大鼠(2512E)中，在腹股沟皮肤/皮下组织区域中注意到良性皮下导管细胞腺瘤。该发现被认为是自发变化，其与RTX0052-DNAI1无关，因为它在组3和组4的任何大鼠中都不存在。在本研究的处理大鼠中的所有其他显微镜发现都被认为是偶然或自发的并且与RTX0052-DNAI1无关。对照大鼠的所有其他显微镜发现都被认为是偶然和自发的。LNP脂质组分(可电离脂质、DMG-PEG和SORT脂质)在处理后从肺组织中被迅速清除。在每个时间点，未检测到血液(血浆和细胞级分)中各自的测量水平或低于测定LOQ。在暴露后6小时，通过WB(图24A)和ELISA(图24B)，1.2mg/kg的10个肺样品中有5个对DNAI1-HA蛋白表达呈阳性。没有看到耐受性终点；临床化学、血液学、BAL细胞差异或A2M的显著变化。未观察到指示局部或全身毒性的显著组织病理学发现。

实施例26.在气雾剂递送3种不同LNP后的多剂量组织病理学分析

通过雾化多剂量施用在缓冲液#27中的4mg 95％ DNAI1+5％萤光素酶mRNA。比较三种候选配制品(RTX0001、RTX00051和RTX0052)。读出测定包括在最后一次给药后4h和IVIS后通过ELISA检测蛋白质，通过qPCR/dPCR检测mRNA水平；以及在最后一次给药后72小时和7天的肺组织病理学。多剂量研究评价了先导LNP候选物在通过雾化施用于小鼠后的毒性。为了递送LNP配制品，设置笼使小鼠适应8天。对此研究，四组小鼠适应。图26A说明了与有待用雾化LNP/DNAI1-HA mRNA重复处理的四组小鼠相关的信息。图26B说明了重复给药小鼠的给药、成像和尸检方案。对经处理的小鼠进行体内成像。在给药后4h，在大约4min的时间段内以恒定流量雾化2mL在PBS中的30mg/mL萤光素。用异氟烷(3％用于诱导，2％用于维持，1L/min氧气流量)麻醉动物。在1min内捕捉腹部图像(分箱设置为8，f停止在1)。校准单位显示为平均辐射(光子/s/cm2/sr)，表示从用户定义的区域全向辐射的通量。总通量＝在ROI面积(cm2)上求和或积分的每个像素中的辐射率(光子/秒)x 4π。平均辐射＝ROI内每个像素的辐射之和/像素或超级像素的数量(光子/秒/cm2/sr)。

图27A-图27B说明了重复给药小鼠的全身体内成像(IVIS)。用2L/min的零级干燥空气流在2小时内以66.6μL/min通过雾化向约7周龄幼稚B6白化体雄性动物施用4.0mg LNP配制的DNAI1-HA/萤光素酶。在给药后4小时，通过雾化向两只小鼠施用2mL萤光素(30mg/mL)，并且在萤光素施用后1-15min内在IVIS上成像。对所有图像以相同的色阶应用伪彩色。肺信号绘制在图27A的图中。全身信号绘制在图27B的图中。图27C说明了重复给药小鼠的组织病理学结果。所有配制品都具有良好的耐受性，并且大多数动物表现出最小至轻度的炎症得分。单只RTX0052处理的动物在暴露后3天时具有中度炎症；然而，这在截止7天时消退，所有动物仅显示出最小炎症。耐受性数据支持在大鼠或NHP中的进一步研究。组织病理学评分系统如下：0或正常：在研究条件下并且考虑到相关动物的年龄、性别和品系，组织被认为是正常的。在其他情况下，可能存在将被认为偏离正常的变化；1或最小：变化量几乎不超过被认为在正常极限内的变化量；3或中度：病变明显，但有严重程度增加的显著潜力；可能有有限的组织或器官功能障碍；以及4或严重：程度尽可能认为地那样完全，或强度或程度大到足以预期显著的组织或器官功能障碍。图27D说明了qPCR结果，其显示出DNAI1-HA mRNA的相对丰度。在最后一个剂量(剂量8)的最后一次成像后，灌注2只小鼠/组。移植脾、肝和肺。将每个器官的一半保存在RNAlater中。将组织匀浆，并且用RNeasy Plus UniversalMini试剂盒(Qiagen)纯化总RNA。用ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒(NEB)进行逆转录。进行定量PCR并且进行分析。图27E说明了蛋白质印迹，其显示出DNAI1-HA的蛋白质表达。将25μg蛋白质加载到4％-12％ Bis·Tris凝胶上。转移到0.45μm硝基纤维素中并且用单克隆大鼠抗HA进行探测。将印迹剥离并且用兔抗DNAI1进行重探测。

实施例27.单剂量吸入研究

此实施例说明了基于肺的靶细胞(例如，纤毛细胞、棒状细胞或基底细胞)中的耐受性、生物分布和蛋白质表达谱来选择脂质配制品的示例性实验方法。基于实施例24-26中的研究，选择DNAI1 mRNA并且选择三种优化5组分配制品，用于在NHP中进行比较。递送0.4至0.6mg/kg之间的剂量，以在TB区域实现1-2μg/cm

图30A说明了上皮细胞类型的多重免疫荧光(IF)图像。将上皮细胞用EPCAM标记。将纤毛细胞用乙酰化微管蛋白(AC-微管蛋白)标记。将棒状细胞用分泌球蛋白家族1A成员1(SCGB1A1)标记。将杯状细胞用粘蛋白5AC(MUC5AC)标记。将基底细胞(干细胞)用细胞角蛋白5(CK5)标记。图30B说明了多重IF分析，其证明了在肺中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。图30C说明了多重IF分析，其证明了在用RTX0051的情况下，在肺中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。mIF的高灵敏度使得能够检测组织和细胞中通过其他蛋白质测量方法不可检测到的蛋白质表达。通过吸入LNP配制的DNAI1-HA mRNA施用0.4mg/kg的单剂量。在给药后6小时从两只NHP收集肺切片。通过将单独动物的所有4个检查肺切片的细胞计数合并来计算DNAI1-HA阳性细胞的百分比。每只动物计数的细胞总数为约500,000至1,400,000个细胞。示出了每只受处理的动物的单独数据点和每组的平均值±标准偏差(N＝2)。

图30D说明了多重IF分析，其证明了在支气管中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。图30E说明了多重IF分析，其证明了在用RTX0051的情况下，在支气管中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。通过吸入LNP配制的DNAI1-HA mRNA施用0.4mg/kg的单剂量。在给药后6小时从两只NHP收集支气管切片。从每只动物单个染色切片计算DNAI1-HA阳性细胞的百分比。计数的细胞总数为约16,000至65,000个细胞。示出了每只受处理的动物的单独数据点和每组的平均值±标准偏差(N＝2)。图30F说明了多重IF分析，其证明了在气管中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达。通过吸入LNP配制的DNAI1-HA mRNA施用0.4mg/kg的单剂量。在给药后6小时从两只NHP收集气管切片。从每只动物单个染色切片计算DNAI1-HA阳性细胞的百分比。计数的细胞总数为约16,000至28,000个细胞。示出了每只受处理的动物的单独数据点和每组的平均值±标准偏差(N＝2)。图31A-图31E说明了BAL细胞因子和补体的结果。图32A-图32E说明了血浆细胞因子的结果。

图33说明了在暴露后6小时在BAL和血液中观察到嗜中性粒细胞的短暂增加。在暴露后6小时看到BAL嗜中性粒细胞以及血液WBC和嗜中性粒细胞的短暂增加。嗜中性粒细胞和WBC水平在72小时恢复到基线。没有观察到血液或BAL细胞群中的其他显著变化。图34说明了所选择的临床化学结果。处理后，在单独动物中观察到AST、LDH和肌酸激酶的少量增加。在媒介物和TA处理的动物中都看到这些增加，但是短暂的，并且值在截止72小时恢复到基线。血液化学组套的其他部分没有观察到显著增加。凝血测定显示，媒介物和TA处理的动物具有相似的结果。图35说明了如通过临床观察和器官重量确定的耐受性的总结。在暴露过程中，在暴露后多达3小时和之后6小时内观察动物。在暴露日的AM和PM进行笼侧临床观察(例如，临床体征等)，直至安乐死。特别注意临床体征，包括但不限于呼吸暂停、呼吸困难(呼吸吃力(labored breathing))、不适、明显流涕、嗜睡、心跳异常、发绀、粘膜变色、血便/血尿、体重过度减轻(相对于基线体重，>20％)。在暴露期间内和之后，没有任何动物报告不良反应。在研究持续时间内没有观察到体重变化。处理组之间的器官重量和相对于体重归一化的重量没有统计学差异。在用RTX0001和RTX0052处理的动物中，归一化的肺重量看起来略高，但由于样品量小，没有统计学显著性。在单次高剂量施用RTX0001、RTX0051和RTX0052后，在用所有三种配制品的情况下均观察到肺的炎症。观察到的3级(中度)炎症的严重程度令人担忧，并且在这些高浓度下可能影响肺功能。虽然在用所有配制品的情况下都看到这种程度的炎症，但呈现形式不同。在RTX0001和RTX0052的情况下，在6小时的早期观察包括3级多灶性嗜中性粒细胞肺泡炎症，其截止72小时已进展为混合细胞炎症(也是3级)。在72小时，观察到RTX0051有3级多灶性嗜中性粒细胞肺泡炎症，类似于在6小时针对RTX0001和RTX0052观察到的情况；尚且未知这是否会进展为类似于RTX0001和RTX0052的混合细胞炎症(给出后续取样)。

实施例28.单剂量吸入研究

本实施例比较了4组分(RTX0004)和5组分(SORT，RTX0001)LNP的在靶细胞中mRNA和蛋白质表达的肺分布。比较包括LNP配制品评估；以mRNA(例如，编码DNAI1-GA的mRNA)作为货物的LNP配制品、以经修饰的核苷酸(例如，包含经修饰的核苷酸的mRNA)作为货物的LNP配制品、和具有针对稳定性和翻译效率经序列优化的mRNA的LNP配制品。对NHP(毛里求斯食蟹猴，1-3岁，雌性，约3kg，每种配制品N＝4，每个尸检时间点2只)进行插管和通气，并且通过气雾剂递送用LNP进行处理。目标递送剂量为0.1mg/kg。用于评估的尸检时间点分别在6小时和24小时。图36A说明了气雾剂递送系统的图。使用左侧所示的测试装置估计通过气管内导管递送的气雾化药物的量。将预先称重的玻璃纤维和MCE过滤器直接附接在气管内导管的出口处。在动物处理之前、期间和之后进行多次收集。将玻璃过滤器干燥并且使用两种重量分析进行定量。使用RiboGreen测定分析MCE过滤器以得到mRNA的量。图36B说明了气雾剂粒度测量的结果。针对在传导气道中的沉积，测量供试品暴露的粒度(在人类中，分支0-15代)。

图37说明了NHP中存在的DBAI1-HA mRNA剂量。黑色水平虚线表示0.1mg/kg的目标呈现剂量。空心黄色圆圈显示在使用RTX0001/DNAI1-HA mRNA给药(GF，n＝2)之前和之后的过滤器收集。空心黄色方块显示在使用RTX0004/DNAI1-HA mRNA给药(GF，n＝2)之前和之后的过滤器收集。使用MCE过滤器和RiboGreen测定对于mRNA获得类似结果。图36和图37共同示出了气雾剂粒度范围适合于在传导气道中沉积(在人类中，分支0-15代)。RTX0001/DNAI1-HA mRNA达到0.1mg/kg的目标递送剂量，并且RTX0004/DNAI1-HA mRNA达到目标递送剂量的25％-50％之间。未观察到堵塞或装置性能/流速变化的问题。两种供试品雾化良好，并且流速差异最小。与RTX0001/DNAI1-HA mRNA相比，RTX0004/DNAI1-HA mRNA具有略高的流速。对于RTX0004/DNAI1-HA mRNA更快的流速和更低的暴露可能是由于通过APS测量观察到更大的气雾剂液滴尺寸。

使用原位杂交(ISH)测定来使用定制设计的ISH探针检测递送到NHP肺的DNAI1-HAmRNA。将ISH结果分析为箱：0+：零个最少拷贝/细胞；1+：至少一个拷贝/细胞；2+：4个最少拷贝/细胞；3+：10个最少拷贝/细胞；和4+：16个最少拷贝/细胞。图38A说明了肺组织的DNAI1-HA mRNA ISH结果。来自测定鉴定的数据：分析的每只动物4个样品中的1个。在所有动物中检测DNAI1-HA mRNA。图38B说明了在用RTX0001处理后，显著部分的肺细胞含有DNAI1-HAmRNA，如通过ISH和箱评分所测量的。图38B证明了在用RTX0001处理后，高达25％的肺细胞含有超过15个拷贝的DNAI1-HA mRNA/细胞。图38C说明了用于ISH分析的肺组织的成像。

图39A说明了将高水平的DNAI1-HA递送到肺并没有导致类似的向肝或脾的递送。使用数字PCR测量在单次0.1mg/kg施用后全血、肺、肝和脾组织中的DNAI1-HA mRNA水平。所使用的引物对RTX序列优化的DNAI1-HA序列是特异性的。在RTX0001暴露后6小时取样的所有三个肺区域中检测到高水平的DNAI1-HA mRNA。在脾和肝中，仅测量到DNAI1-HA mRNA在测定的LLOQ处或低于LLOQ。图39B说明了NHP中DNAI1-HA标签蛋白的正染色。对于RTX0001，在施用后6小时或24小时检测DNAI1-HA。mRNA水平较高的区域与显示出DNAI1-HA蛋白水平最高的区域相关。DNAI1-HA mRNA存在于所有8只经处理的动物中。在媒介物处理的动物中未检测到信号。mRNA水平在6小时最高并且在24小时较低。与RTX0004相比，RTX0001处理的动物的mRNA水平最高(与喷射剂量测量一致)。使用连续切片，mRNA水平较高的区域与显示出DNAI1-HA蛋白水平最高的区域相关。在用RTX0001处理的NHP中，在6小时和24小时检测到DNAI1-HA。图39C说明了关键上皮细胞类型的多重IF组套。使用10个NHP FFPE肺组织块(每只动物1个)用于mIF测定鉴定。将来自每个块的两个载玻片一式两份地染色。报告单标记物阳性细胞、具有DNAI1表达的双阳性细胞的细胞计数、和双阳性细胞中的DNAI1 MFI。将上皮细胞用EPCAM标记。将纤毛细胞用乙酰化微管蛋白(AC-微管蛋白)标记。将棒状细胞用分泌球蛋白家族1A成员1(SCGB1A1)标记。将杯状细胞用粘蛋白5AC(MUC5AC)标记。将基底细胞(干细胞)用细胞角蛋白5(CK5)标记。

图40A说明了NHP肺样品的多重IF组套结果。DNAI1-HA在呼吸系统上皮细胞中表达。通过将每只动物1个检查肺切片的细胞计数合并来计算DNAI1-HA阳性细胞的百分比。在来自用RTX0001处理的NHP的肺样品中检测DNAI1-HA的表达。DNAI1-HA的表达与上皮细胞的标记物共定位，所述上皮细胞包括棒状细胞、基底细胞和纤毛细胞(棒状细胞和基底细胞是纤毛细胞的前体)。在来自用RTX0004处理的NHP的肺样品中未检测到染色。图40B说明了在肺中的靶细胞中的DNAI1-HA蛋白表达的多重IF分析。通过吸入施用单剂量0.1mg/kg的RTX0001/DNAI1-HA mRNA。在给药后6小时和24小时从两只NHP收集肺切片。通过将单独动物的所有4个检查肺切片的细胞计数合并来计算DNAI1-HA阳性细胞的百分比。每只动物计数的细胞总数为约690,000至1,100,000。示出了每只受处理的动物的单独数据点和每组的平均值±标准偏差(N＝2)。

本研究表明，对于两种配制品，气雾剂粒度与在传导气道中的沉积一致，并且在整个暴露过程中流速一致(对于两种配制品，大于>0.20mL/min)。两种配制品的暴露时间都很短(在4至9分钟之间)。生物分布结果表明mRNA分布良好，并且用配制品RTX0001处理的NHP的水平更高。在用配制品RTX0001处理的动物的纤毛细胞、棒状细胞和基底细胞中检测到DNAI1蛋白。在用RTX0004的情况下检测到很少或没有DNAI1-HA表达(注意：与RTX0001相比，递送的剂量为25％-50％)。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选的实施方案，但是对于本领域的技术人员清楚的是，此类实施方案仅通过举例提供。本发明不受说明书中提供的具体实施例的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文对实施方案的描述和说明不意味着以限制性意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变动、变化和取代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文根据各种条件和变量阐述的具体描述、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时，可以采用在本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，考虑了本发明也应覆盖任何这样的替代方案、修改、变化或等效方案。下面的权利要求旨在限定本发明的范围，并且从而覆盖在这些权利要求及其等效方案的范围内的方法和结构。

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