活性物质Petanin的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及活性物质Petanin的应用。

背景技术

黑色素是一种生物色素，是酪氨酸或3,4-二羟苯丙氨经过一连串化学反应所形成，动物、植物与原生生物都有这种相同色素。黑色素通常以聚合的方式存在。

黑色素其实是一种氨基酸衍生物，在每个人的体内都有。20-25岁是黑色素沉淀形成的活跃期。它们存在于皮肤基底层的细胞中间，而是一种叫“黑色素原生物质”的物质，也叫做“色素母细胞”(或黑色素母体)。基于人种差异，色素母细胞(黑色素母体)在体内的数量因人而异，有人天生黑色素母体就相对较多，从而导致黑色素生成较多，这也是每个人的肤色天生会存在差异的原因。色素母细胞分泌麦拉宁色素，当紫外线(B波、A波)照射到皮肤上(B波即UVB作用于皮肤基底层)，肌肤就会处于“自我防护”的状态，即由紫外线刺激麦拉宁色素，激活酪氨酸酶的活性，来保护我们的皮肤细胞。

黑色素经由细胞代谢的层层移动，到了肌肤表皮层形成不同类型的斑点如雀斑、晒斑、黑斑等形状了，另外黑色痘印也是由炎性反应刺激皮肤色素合成增加而形成。由于内外界刺激，黑色素母体被激活形成的痘印也属于黑色素沉积而遗留下来的问题。

发明内容

“邓楷，等，黑果枸杞花青素结构差异对其稳定性及细胞抗氧化活性的影响.天然产物研究与开发.2022,34:213-219”，通过分离纯化，得到了化合物：Petunidin-3-O-(trans-p-coumaroylrutinoside)-5-O-glucoside(本发明中简称为Petanin)；结构式如下：

本发明的目的在于提供活性物质Petanin的应用，Petanin在制备抑制黑色素产品中的应用，产品可包括药品和化妆品，通过斑马鱼死亡情况和毒性情况可确定出Petanin在化妆品中的添加浓度为0.1％，通过分析斑马鱼头部黑色素信号强度，可以确定Petanin具有显著美白功效，统计学分析p＜0.01。

斑马鱼(Zebrafish,Danio rerio)是近年来应用越来越广泛的重要模式生物。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因同源性高，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，具有饲养成本低、体积小、发育周期短、体外受精、透明易观察、单次产卵数较高等特点。而与线虫和果蝇这样的模式生物相比，虽然后者也可用于大规模筛选，但并不能阐明高等生物特有的组织或器官发育和功能。目前，已有一系列论文报道影响斑马鱼胚胎发育的突变体的筛选及鉴定，揭开了斑马鱼广泛应用于与发育和疾病相关的基因功能分析的序幕。因此近年来斑马鱼已经发展成为人类疾病和毒理学研究得的良好的动物模型目前斑马鱼已被美国国家卫生研究院(NIH)列为继人和小鼠之后的第三大模式生物。近几年来，欧洲经济与合作发展组织(OECD)和日本的生殖毒理学家就采用斑马鱼作为检测水环境内分泌干扰物浓度的早期敏感对象，并取得积极成果。

在毒理研究中，实验模型的选择一直是个难题，普通的动物模型如大鼠和小鼠存在着生长周期较长(8周以上)，检测指标不确定，灵敏度差，样品纯度高且难以大规模研究等缺点，而单纯的细胞材料又很难再现体内的实际情况。斑马鱼模型现已广泛应用于包括急性毒性、发育毒性与致畸性、胚胎毒性、心血管毒性、肝毒性、神经毒性、肾毒性、行为毒性和生殖毒性等在内的一系列药物毒性评价中。2009年欧洲斑马鱼药物筛选技术服务公司Biobide(www.biobide.es)获得了美国食品与药品管理局(FDA)和欧洲药品评估局(EMEA)的GLP认证，标志着斑马鱼药物毒理学与安全性评价模型已经得到了欧美国家政府的正式认可。2013年4月8号，美国FDA在其官网刊文报道斑马鱼在药物早期毒性评价中的作用。斑马鱼的基因与人类基因相似度达到87％，这意味着在它身上得出的水质监测结果，多数情况下都适用于人类。

斑马鱼模型检测化合物毒理学案例中。用化合物处理斑马鱼，可观察到斑马鱼一系列的特异的组织器官发育异常，结合半致死率评价方法，并与哺乳动物的致畸作用进行比较，这样就可以对化合物毒性获得较为准确的评估。数据显示，斑马鱼药物评价系统识别非致畸物质成功率为75％，识别致畸物质成功率则高达100％。该评价系统的特异性(70％～80％)和敏感性(>80％)非常突出，优于小鼠或者大鼠等常规实验动物。报道还表明，阿斯利康等5家跨国医药巨头已经用斑马鱼进行先导化合物早期发育毒性评价，涉及了58种遴选的化合物，整体的预测准确定超过80％，具有很高的可靠性和灵敏度。

为了解决上述的技术问题，本发明所采用的技术方案是：

活性物质Petanin的应用，所述应用包括Petanin以及其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备抑制黑色素产品中的应用。

斑马鱼在发育初期全身透明，胚胎发育至24h时黑色素开始从视网膜上皮生长。色素细胞起源于背部外胚层分化的一群细胞—神经嵴细胞，然后增殖、迁徙、分化成色素母细胞。本发明利用Petanin对斑马鱼在黑色素形成的过程进行干预，将干预后的斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼头部黑色素信号强度(S)，发现其统计学分析p<0.01，明显低于0.05，判定为具有美白效果，且美白功效为17％。

进一步地，所述抑制黑色素，是指抑制黑色素生成、或减少已生成的黑色素。

进一步地，所述产品为具有美白、祛斑功能的产品。

进一步地，所述产品为药品、化妆品。

进一步地，所述产品选自面膜、面霜、乳液、爽肤水、洗面奶。

进一步地，所述产品为口服产品。

进一步地，Petanin在化妆品中的添加浓度为0.1％。

测定Petanin在化妆品中的添加浓度方法，包括以下内容：

将Petanin溶解于水中制成水溶液，或将Petanin制备成能在水中均匀分散的悬浮液，将受精后6h的斑马鱼饲养在所述水溶液中，在28℃条件下避光孵育45h，根据斑马鱼死亡情况和毒性情况，确定Petanin对正常斑马鱼的添加浓度。

斑马鱼受环境和化合物影响出现死亡和发育毒性，因此，通过斑马鱼死亡情况和毒性情况可确定Petanin的添加浓度。斑马鱼和人类基因有着87％的高度相似性，因此，斑马鱼检测的添加浓度可认定为是适用于人类的安全浓度。化妆品及其原料可通过斑马鱼的死亡情况和毒性情况确定适用于人类的添加浓度。

本发明中所述“药学上可接受的”是指包括任意不干扰活性成分的生物活性的有效性且对它被给予的宿主无毒性的物质。

本发明所述药学上可接受的辅料，是药物中除主药以外的一切附加材料的总称，辅料应当具备如下性质：(1)对人体无毒害作用，几无副作用；(2)化学性质稳定，不易受温度、pH、保存时间等的影响；(3)与主药无配伍禁忌，不影响主药的疗效和质量检查；(4)不与包装材料相互发生作用。本发明中辅料包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包含糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包含乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包含微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包含十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包含亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包含0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；调节剂包含盐酸、枸橼酸、氢氧化钾(钠)、枸橼酸钠及缓冲剂(包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)等；乳化剂包含聚山梨酯-80、没酸山梨坦、普流罗尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包含吐温-80、胆汁、甘油等。术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。上述酸碱为广义的路易斯酸碱。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物同样可以用于注射制剂。其中，所述注射剂选自液体注射剂(水针)、注射用无菌粉末(粉针)或注射用片剂(系指药物用无菌操作法制成的模印片或机压片，临用时用注射用水溶解，供皮下或肌肉注射之用)。

其中，所述注射用粉剂的中除含有上述化合物外，还至少含有赋形剂。本发明中所述赋形剂，为有意加到药物中的成分，其在所用的量上不应具有药理学特性，但是，赋形剂可以有助于药物的加工、溶解或溶出、通过靶向给药途径递药或有助于稳定性。

本发明的有益效果是：

本发明的Petanin可以在制备抑制黑色素产品中应用，具有显著美白功效，统计学分析p＜0.01，Petanin添加浓度为0.1％，产品包括药品或化妆品，具体可以包括面膜、面霜、乳液、爽肤水、洗面奶。

附图说明

图1为正常对照组中斑马鱼头部黑色素信号强度图；

图2为Petanin0.1％实验组中斑马鱼头部黑色素信号强度图。

具体实施方式

以下对本发明的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，此处所描述的实施例仅是本发明中的一部分，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

具体实施方式中使用的Petanin，参照“邓楷，等，黑果枸杞花青素结构差异对其稳定性及细胞抗氧化活性的影响.天然产物研究与开发.2022,34:213-219”制备。

实施例1

利用斑马鱼测定Petanin的-添加浓度：

实验体系：野生型AB品系斑马鱼；

斑马鱼鱼龄：受精后6小时(6hpf)；

每组实验样本量：30尾(N＝30)；

成鱼饲养及繁殖方法：按照本公司实验室标准饲养和繁殖方法，符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求；

样品处理：将Petanin粉末溶于纯净水中，配制成质量百分数为0.002％、0.02％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％和0.5％浓度的水溶液。

实验步骤：

1.随机选取上述斑马鱼于6孔板中，每孔30尾。

2.将上述8种不同浓度的Petanin水溶液作为实验组，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。

3.28℃条件下避光孵育45h。

4.根据斑马鱼死亡情况和毒性情况，确定样品对正常斑马鱼的添加浓度。

实验检测结果如表1所示。

表1实验检测结果

由表1可知，当Petanin添加浓度＜0.15％时，没有出现正常斑马鱼死亡的情况，本发明选择的添加浓度为0.1％。

实施例2

利用斑马鱼测定Petanin的美白效果：

实验体系：野生型AB品系斑马鱼；

斑马鱼鱼龄：受精后6小时(6hpf)；

每组实验样本量：30尾(N＝30)；

成鱼饲养及繁殖方法：按照本公司实验室标准饲养和繁殖方法，符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求；

样品处理：将Petanin粉末溶于纯净水中，配制成质量百分数为0.1％的水溶液。

实验步骤：

1.随机选取上述斑马鱼于6孔板中，每孔30尾。

2.实验组用Petanin质量百分数为0.1％的水溶液，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。

3.28℃条件下避光孵育45h。

4.每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用高级图像处理软件(Image J)分析并采集数据，分析斑马鱼头部黑色素信号强度(S)，根据如下公式计算并判断样品是否具有美白功效。

判定依据为：统计学分析p<0.05，判定为显著。实验结果如表2所示。

表2实验结果

由表2可知，当Petanin浓度为0.1％时，统计学分析p<0.01，具有显著的美白功效，美白功效为17％。

如图1和图2所示，图中虚线部位均为定量区域，Petanin组的斑马鱼头部黑色素信号强度与正常对照组相比，明显减少，揭示了该样品具有美白功效。