一种三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶的制备方法及应用。

背景技术

外伤、肿瘤、畸形以及牙周病等会导致骨缺损是临床常见问题。自体骨移植是修复此类骨缺损的金标准,但仍存在多次手术、疗程长、伦理和二次创伤等问题。当前人工骨植入材料主要有钛合金、聚醚醚酮(PEEK)、无机生物陶瓷和高分子复合材料。人工骨植入材料中的钛合金和PEEK材料缺乏成骨活性，且不可降解，这些问题限制了其进一步应用。生物陶瓷多孔支架如羟基磷灰石、硫酸钙、磷酸钙、磷酸镁和生物玻璃等具有优越的生物相容性、一定的成骨活性和骨传导性，被认为是理想的人工骨替代材料，在临床使用中取得了一定的治疗效果。然而，生物陶瓷材料脆性大、韧性差等问题限制了其骨填充中的应用。因此，亲水性高分子基支架特别是复合无机材料的复合支架因与细胞外基质具有相似的理化特性和成骨活性而广泛用于骨损伤修复中。

更重要的是，如何通过材料的设计调动内源性的细胞功能是目前骨修复材料研究的重点。骨组组工程中的三要素包括支架，生长因子和干细胞；支架是基础，外源性干细胞和生长因子的搭载可以显著提高支架的成骨活性。干细胞和细胞因子的植入存在成本高昂、可能产生潜在副作用等问题而应用受到限制。设计活性材料有效调动内源性细胞功能是转化应用中的重点。考虑到内源性细胞在骨修复过程中的信号因子的表达、功能发挥和血管化过程受到能量代谢的调控，而且成骨过程中涉及到大量有机无机物的合成都与细胞能量代谢密切相关。值得注意的是，TCA循环是细胞产生能量的主要途径。大量开研究发现将TCA循坏中的代谢产物(如柠檬酸或琥珀酸)修饰到生物材料上可促进细胞产生更多的ATP，从而为高能量需求的蛋白合成、细胞有丝分裂、迁移和组织修复/再生创造有利的微环境。与TCA循环过程涉及到的辅酶、转运蛋白等成分相比，TCA代谢中间产物的有机酸，如柠檬酸、琥珀酸和苹果酸等在自然界中更容易合成，这些有机酸的化学结构明确，结构稳定，取材广泛价格低廉。然而，有机酸含量过高和释放过多会显著降低微环境中pH水平，容易加重损伤部位炎症的产生和组织的水肿发生，对细胞和组织带来一定的损伤，抑制组织的形成。构建安全、稳定、生物相容性良好的生物能量活性骨修复材料具有重要转化价值。

TCA循环有机酸的盐离子具有更优越的生物安全性和稳定性，而且这些盐在体内特定环境下能够转化成糖代谢过程中对应的有机酸。已有平台将TCA代谢离子复合在骨修复材料中提高其成骨性能。Schneiders等人证实在胶原/羟基磷灰石支架内装载柠檬酸盐可以有效提升该骨植入材料的成骨活性。Konishi等人(9)近期将柠檬酸盐和海藻酸盐装载到骨水泥内部提高其成骨活性和力学性能。然而这些平台是预先将低剂量的柠檬酸盐和支架前驱体溶液混合，该方法装载的柠檬酸盐有限，特别是柠檬酸盐与支架的相互作用力和释放对成骨性能的影响没有报道。

王等人的于2023年7月11日公开的专利名称为“3D打印水凝胶骨修复支架、离子交联型壳聚糖基水凝胶的制备方法”的申请号CN116407680A中国专利申请，公开了一种用柠檬酸盐(质量浓度为3-5％)和三聚磷酸盐(质量浓度为3-5％)交联3D打印水凝胶用于骨修复的方法。但是，它没有提到单纯柠檬酸盐能否单独交联该体系，同时该体系中通过柠檬酸盐浸泡该支架的主要是用于体外沉积钙磷盐。此外，它没有提到单纯的柠檬酸盐交联是否会提高高分子基水凝胶的成骨效应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：开发出合成方法简单，兼具成骨活性、良好机械强度和绿色安全的经济型骨修复材料，本发明的目的之一在于提供了一种复合三羧酸循环代谢物盐离子的骨修复材料的制备方法；本发明的目的之二在于提供所述三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶在颅骨缺损修复或四肢骨填充修复或牙槽骨缺损修复或牙周炎修复中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶的制备方法，所述步骤包括：通过模板法制备亲水高分子基支架，配置一定浓度的三羧酸循环代谢盐离子溶液，将亲水高分子基支架置于三羧酸循环代谢盐离子溶液中，完全浸没，浸泡处理一定时间获得固载三羧酸循环代谢盐离子的亲水高分子基骨修复水凝胶，洗涤去除未吸附的三羧酸循环代谢盐离子即得。

进一步可选地，所述亲水高分子基支架中的亲水高分子主要是透明质酸、琼脂糖、海藻酸、壳聚糖、纤维素、葡聚糖、纤维蛋白、明胶，胶原蛋白、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙醇酸、聚乳酸中的一种或几种的组合物。

进一步可选地，所述三羧酸循环代谢物盐离子溶液包括柠檬酸钾、柠檬酸锂、柠檬酸钠、柠檬酸镁、α-酮戊二酸钾、α-酮戊二酸锂、α-酮戊二酸钠、α-酮戊二酸镁、琥珀酸钾、琥珀酸锂、琥珀酸钠、琥珀酸镁、苹果酸钾、苹果酸锂、苹果酸钠、苹果酸镁、马来酸钾、马来酸锂、马来酸钠、马来酸镁中的一种或几种的组合。

进一步可选地，所述三羧酸循环代谢物盐离子溶液为柠檬酸钠(Na

进一步可选地，三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶的具体制备步骤为：

(1)先将壳聚糖溶解于含2％冰乙酸的纯水中，加热搅拌溶解；再加入明胶进行加热搅拌溶解，获得均质的明胶壳聚糖水凝胶；然后将京尼平充分溶解于明胶壳聚糖水凝胶，得到液态的京尼平共价交联明胶和壳聚糖水凝胶，迅速将京尼平共价交联明胶和壳聚糖水凝胶加入预制模型中，在37℃恒温孵箱过夜，使其充分交联至水凝胶呈现深色，将交联好的水凝胶冷冻，后取出备用；

(2)分别制备柠檬酸钠饱和溶液、α-酮戊二酸钠饱和溶液、琥珀酸钠饱和溶液；

(3)将交联好的水凝胶分别在20倍体积的柠檬酸钠饱和溶液、α-酮戊二酸钠饱和溶液、琥珀酸钠饱和溶液中浸泡48h；

(4)将浸泡后的水凝胶置于去离子水中用超声震荡清洗30min，洗净未与水凝胶结合的钠盐，以分别获得柠檬酸钠、α酮戊二酸钠、琥珀酸钠改性的水凝胶。

进一步可选地，所述壳聚糖和明胶的质量比为1：5。

进一步可选地，所述柠檬酸钠饱和溶液、α-酮戊二酸钠饱和溶液、琥珀酸钠饱和溶液的浓度在10μM-3M之间。

2、所述三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶在颅骨缺损修复或四肢骨填充修复或牙槽骨缺损修复或牙周炎修复中的应用。

本申请构建了明胶和不同多糖复合的双网络水凝胶，用三羧酸循环代谢物盐离子处理水凝胶，探究离子对水凝胶机械性能和成骨活性的影响。通过引入共价交联，提高了水凝胶的稳定性。

在不搭载细胞、生长因子等生物成分的情况下，所述三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶在体外可以促进MC3T3-E1细胞成骨向分化，在体内可以促进大鼠颅骨缺损的修复，其中CGG-Cit水凝胶效果更佳，12周时可使临界骨缺损愈合。

本发明具有如下的优点和有益效果：

1、本发明提供的三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶，具有良好的机械性能、抗溶胀性能以及体内促成骨效果。

2、本发明提供的三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶的制备方法，相比传统的改性方式，该方法不涉及有机溶剂的使用，所使用的主要成分降解产物为人体代谢物，生物安全性较高，无潜在致癌及毒副作用。

3、本发明提供的三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶的制备方法，相比传统的改性方式，该方法较为简单，可以大规模生产，成本低廉，制备的材料均匀性良好。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明的三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶机制模式图(以柠檬酸钠盐为例)。

图2为本发明的电镜图；其中，(A)表示共价交联的明胶/壳聚糖水凝胶(CGG)的电镜图，(B)表示三羧酸循环代谢物中的柠檬酸盐改性CGG水凝胶(CGG-Cit)的电镜图。

图3为网络水凝胶CGG、三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶CGG-Cit、α酮戊二酸盐改性的CGG水凝胶(CGG-αKG)和琥珀酸盐改性的CGG水凝胶(CGG-Suc)的XPS图：其中，(A)表示双网络水凝胶CGG和三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶CGG-Cit的XPS图，(B)表示三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶CGG-αKG和CGG-Suc的XPS图；(C)表示CGG和CGG-Cit水凝胶高分辨率XPS光谱结果。

图4为网络水凝胶CGG、三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶CGG-Cit、CGG-αKG和CGG-Suc的FT-IR图：其中，(A)表示双网络水凝胶CGG和三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶CGG-Cit的FT-IR图，(B)表示三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶CGG-αKG和CGG-Suc的FT-IR图。

图5为本发明的力学性能测试结果图；其中，(a1)表示网络水凝胶CGG和三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶的应力-应变曲线，(a2)表示水凝胶的弹性模量，(a3)表示水凝胶的韧性。

图6为本发明的抗溶胀性测试结果图；其中，左图表示网络水凝胶CGG、三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶CGG-Cit、CGG-αKG和CGG-Suc在PBS溶液浸泡三天的形态变化，右图表示水凝胶的溶胀曲线。

图7为本发明的成骨性能体外检测结果图：水凝胶浸提液促成骨效果的ALP染色。

图8为本发明的成骨性能体外检测结果图：水凝胶浸提液促成骨效果的茜素红染色。

图9为本发明的成骨性能体外检测结果图：水凝胶浸提液培养MC3T3-E1细胞七天的成骨标志基因表达情况。

图10为本发明的成骨性能体内检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1、一种三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶的制备方法

本实施例提供了一种三羧酸循环代谢物盐离子改性骨修复水凝胶，具体制备方法如下所示：

步骤1：制备明胶壳聚糖水凝胶(Gelatin/chitosan，CG)，具体而言，取16g壳聚糖粉末，8mL冰乙酸溶液，用纯水定容到400mL。在65℃油浴条件下，以600r/min的速度搅拌，待壳聚糖溶解后，加入80g明胶粉末，继续搅拌2h直至无肉眼可见粗颗粒，停止搅拌，65℃恒温静置2h待气泡除尽，以获得均匀的CG。随后取10mL均匀的CG，加入0.01g京尼平粉末，温和倒置使其充分溶解，获得液态CGG水凝胶。迅速将CGG水凝胶加入预制模型中，在37℃恒温孵箱过夜使其充分交联至水凝胶颜色变深，而后将水凝胶放于-20℃冰箱中过夜，第二天取出备用。

步骤2：分别制备柠檬酸钠饱和溶液、α-酮戊二酸钠饱和溶液、琥珀酸钠饱和溶液至1M；

步骤3：充分交联的CGG水凝胶分别在20倍体积的柠檬酸钠饱和溶液、α-酮戊二酸钠饱和溶液、琥珀酸钠饱和溶液中浸泡48h；

步骤4：最后，将浸泡后的水凝胶置于去离子水中用超声震荡清洗30min，洗净未与水凝胶结合的钠盐，以分别获得柠檬酸钠、α-酮戊二酸钠、琥珀酸钠改性的水凝胶，缩写分别为CGG-Cit、CGG-αKG和CGG-Suc水凝胶。

实施例2、关于三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶的结构分析

如图1所示，以柠檬酸钠溶液为例说明，当CGG水凝胶浸入柠檬酸钠溶液(1M)时，三羧酸循环代谢物盐离子可以极化水合水分子，并让氨基去质子化；这些作用会导致聚合物的亲水基团与水合水分子之间的氢键断裂，增加疏水链间的相互作用，形成分子间聚集和链缠结微结构。同时，溶解在CGG水凝胶中的柠檬酸盐离子可以与氨基配位或与多糖的单体结构结合，形成离子交联复合物，在双网络水凝胶结构中发挥交联剂的作用，在CGG网络中形成更强、更稳定的复合结构，从而使CGG-Cit水凝胶具有强大的机械性能、抗溶胀性、稳定性。

实施例3、关于三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶的表征分析

1、电镜表征：

结果如图2所示，CGG-Cit水凝胶是均匀的多孔结构。

2、XPS和FT-IR表征：

XPS结果如图3所示，与CGG水凝胶相比，CGG-Cit、CGG-αKG和CGG-Suc水凝胶中出现了Na1s信号。此外，高分辨率XPS光谱结果(图3，C)显示，与CGG凝胶相比，在CGG-Cit水凝胶中观察到更高的-C＝O峰(284.3eV和531.3eV)和更低的-C-OH峰(286.2eV和532.9eV)，这意味着柠檬酸盐中的大量羧酸基团与CGG水凝胶配位。

FT-IR结果如图4所示，CGG水凝胶在1630cm

综上所述，通过XPS和FT-IR实验，证明离子已经结合至水凝胶，通过扫描电镜证明水凝胶均为均匀的多孔结构。

实施例4、力学性能测试

1、测试方法：

用模具制备高度为5mm，直径为8mm的圆柱状CGG、CGG-Cit、CGG-αKG和CGG-Suc水凝胶，进行力学测试。

首先，使用万能力学测试仪进行压缩性能检测，速率为1mm/min，测得应力-应变曲线，前10％应变段曲线计算弹性模量；材料断裂点前的曲线计算韧性。每组重复三个样本。

2、测试结果：

测试结果如图5所示，两种离子改性水凝胶力学强度大幅度提高。具体地，图5中(a1)三种水凝胶的应力-应变曲线，图5中(a2)三种水凝胶的弹性模量，图5中(a3)表示三种水凝胶的韧性，可见CGG-Cit、CGG-αKG和CGG-Suc水凝胶力学强度大幅度提高。

实施例5、抗溶胀性、吸水性测试

1、测试方法：

为了测试水凝胶的溶胀性能和吸水性能，用模具制备高度为3mm，直径为8mm的圆柱状水凝胶，用三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶进行测试。首先，用吸水纸擦干表面的水分，测量三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶初始体积记为V

2、测试结果：

测试结果如图6所示，三种离子改性水凝胶有良好的抗溶胀性。

实施例6、水凝胶成骨性能体外检测

1、测试方法：

将MC3T3-E1细胞以1×10

2、测试结果：

结果如图7和图8所示，三种离子改性水凝胶具有在体外促成骨能力，CGG-Cit水凝胶效果更加显著。水凝胶浸提液培养MC3T3-E1细胞七天的成骨标志基因表达情况如图9所示，Sp7、Bglap、Opn、Opg表达量升高。

实施例7、水凝胶成骨性能体内检测

1、测试方法：

1)8周龄的雄性SD大鼠随机分为5组，分别为空白对照组，CGG、CGG-Cit、CGG-αKG和CGG-Suc水凝胶组，每组各时间点五只。术前12h禁食禁饮。

2)异氟烷进行气体麻醉，待大鼠呼吸平稳、四肢无力后将四肢固定于鼠板；大鼠颅顶部位备皮，碘伏消毒后沿中线剪开皮肤，作2.0cm的矢状切口，暴露骨面。

3)用低速环钻于颅中缝两侧造两个直径5mm的全厚骨组织缺损，使用生理盐水降温并冲净残留的骨组织。使用模具取两块厚度1mm，直径5mm的圆形水凝胶薄片置于缺损处，对照组不放置任何材料。放置好水凝胶后，首先缝合骨膜层以达到固位效果，后对位缝合皮肤。

4)术后给予大鼠正常饮食，观察大鼠状态。8周、12周后用高浓度异氟烷过量通气处死大鼠，取大鼠颅骨PBS冲洗后放于4％多聚甲醛常温固定24h。

5)使用Micro-CT成像系统扫描大鼠颅骨，扫描精度为15.6μm，扫描条件为70kVp，200μA。使用SCANCO Evaluation软件以及Skyscan软件重建并分析三维图像。

2、测试结果：

结果如图10所示，三种三羧酸循环代谢物盐离子改性水凝胶具有在体内促成骨能力，CGG-Cit水凝胶效果更加显著。

综上，创伤、感染、肿瘤等原因导致的颅颌面骨缺损的治疗是临床难点。设计、开发出具有高强度、抗溶胀、且有成骨活性的材料是骨组织工程的关键。本发明设计了一种新的、简单温和的水凝胶改性方式，用常见三羧酸循环代谢物钠盐浸泡明胶多糖水凝胶，提高材料的机械性能，并引入京尼平共价交联提高水凝胶的稳定性。

如上述实施例所示，CGG-Cit、CGG-αKG和CGG-Suc水凝胶力学性能增强，且具有抗溶胀性。生物相容性和成骨性能检测证明，CGG-Cit水凝胶对MC3T3-E1细胞均有良好的生物相容性，且能促进细胞成骨向分化。体内颅骨临界骨缺损修复实验发现，三种水凝胶均可以促进骨缺损修复，其中CGG-Cit效果更显著，12周时可促临界骨缺损近乎完全愈合。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。