马齿苋醇提取物的制备方法及其在治疗肝纤维化中的应用

技术领域

本发明属于中药提取物方法及应用领域，涉及中药马齿苋提取方法及其提取物对小鼠肝纤维化的影响领域，尤其涉及从马齿苋中提取的生物碱及其作用机制的研究。

背景技术

目前，国内外专家从化学药物、细胞因子、基因等多个方面对肝纤维化的治疗进行了深入的研究，希望能够找到合适的治疗方法。然而，这些治疗计划由于其缺点不能广泛应用于临床实践。中医药治疗慢性疾病逐渐获得国际认可，相关研究表明，临床实践中最常用的中药主要集中在促进血液循环，抗炎，保护细胞膜和促进干细胞再生。研究发现，从草药中提取的天然提取物有助于抗纤维化并成为药物，这与其良好的抗炎作用有关。马齿苋（Portulaca oleracea L.），是马齿苋科植物，具有解毒、消炎、利尿和镇痛作用。马齿苋含有丰富的天然治疗成分，包括黄酮、皂苷和生物碱。它具有许多药理作用，如肝保护，抗氧化剂，抗炎，抗菌等。马齿苋的活性研究在抗氧化、抗炎及肝保护等，目前对马齿苋提取物治疗肝纤维化作用的研究和其机制尚不明晰，因此需要进一步探讨。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种简便、快速、以及环保提取率高的方法，并阐释了马齿苋提取物对肝纤维化的保护作用方式。本发明从马齿苋中提取得到主要含有生物碱组分(POL-1)。经过实验验证POL-1治疗肝纤维化作用是通过改善氧化应激状态，减少炎症，调整TLR4/NF-κB，Bcl-2/Bax和TGF-β1/Smad2通路来实现的，可为开发POL-1作为治疗肝纤维化候选药物提供科学依据。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。

本发明提供了一种马齿苋中生物碱POL-1在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。

进一步地，所述马齿苋中生物碱POL-1的提取方法，具体包括以下步骤：

步骤1：取干燥马齿苋药材20.0kg，用粉碎机粉碎，得马齿苋粉末；

步骤2：将步骤1所得粉末采用甲醇浸泡2h后，在2h之后按照固液比为：1：8，回流提取3次，第1次提取3小时、第2次提取3小时、第3次提取3小时，合并3次提取液之后用8层纱布过滤，得到滤液；

步骤3：将步骤2所得滤液经过旋转蒸发仪浓缩，浓缩后得到的浸膏5kg，取3kg的浸膏用蒸馏水进行溶解，溶解之后为2L的水溶液；

步骤4：将步骤3所得2L水溶液先用2L的石油醚进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的下层水溶液，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩下层的水溶液，得到浸膏A；之后，将浸膏A用1L的蒸馏水溶解，通过2L的乙酸乙酯进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的下层水溶液，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩下层的水溶液，得到浸膏B；之后，将浸膏B最后用1L的蒸馏水溶解，通过1L的饱和水正丁醇进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的上层的饱和正丁醇层，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩上层的正丁醇，得到浸膏C 650g；600g的浸膏C用4000mL的蒸馏水溶解，得到的溶液经过SP825L大孔树脂洗脱，洗脱步骤和判断洗脱结束步骤：流速：1.5mL/min，每隔1L收集一次洗脱液，洗脱至淡黄色，暂停收集，通过旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩之后会出现浸膏，如还有浸膏，继续用蒸馏水洗脱收集，当无浸膏之后，用10%乙醇洗脱。洗脱步骤和判断10%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用30%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断30%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用50%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断50%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用70%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断70%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。最后用蒸馏水溶解70%乙醇的浸膏，经过冷冻干燥得POL-1。

本发明还提供了一种马齿苋生物碱POL-1的提取方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1：取干燥马齿苋药材20.0kg，用粉碎机粉碎，得马齿苋粉末；

步骤2：将步骤1所得粉末采用甲醇浸泡2h后，在2h之后按照固液比为：1：8，回流提取3次，第1次提取3小时、第2次提取3小时、第3次提取3小时，合并3次提取液之后用8层纱布过滤，得到滤液；

步骤3：将步骤2所得滤液经过旋转蒸发仪浓缩，浓缩后得到的浸膏5kg，取3kg的浸膏用蒸馏水进行溶解，溶解之后为2L的水溶液；

步骤4：将步骤3所得2L水溶液先用2L的石油醚进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的下层水溶液，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩下层的水溶液，得到浸膏A；之后，将浸膏A用1L的蒸馏水溶解，通过2L的乙酸乙酯进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的下层水溶液，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩下层的水溶液，得到浸膏B；之后，将浸膏B最后用1L的蒸馏水溶解，通过1L的饱和水正丁醇进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的上层的饱和正丁醇层，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩上层的正丁醇，得到浸膏C 650g；600g的浸膏C用4000mL的蒸馏水溶解，得到的溶液经过SP825L大孔树脂洗脱，洗脱步骤和判断洗脱结束步骤：流速：1.5mL/min，每隔1L收集一次洗脱液，洗脱至淡黄色，暂停收集，通过旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩之后会出现浸膏，如还有浸膏，继续用蒸馏水洗脱收集，当无浸膏之后，用10%乙醇洗脱。洗脱步骤和判断10%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用30%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断30%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用50%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断50%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用70%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断70%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。最后用蒸馏水溶解70%乙醇的浸膏，经过冷冻干燥得POL-1。

进一步地，所述方法制备的马齿苋生物碱POL-1在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。

进一步地，所述方法制备的马齿苋生物碱POL-1治疗肝纤维化作用是通过改善氧化应激状态，减少炎症，调整TLR4/NF-κB，Bcl-2/Bax和TGF-β1/Smad2通路来实现的。

本发明中所述马齿苋提取物从SP825L大孔树脂中分离得到POL-1，其主要成分为生物碱。生物碱是植物中最重要的有机化合物之一，具有许多药用和医药用途。生物碱也是马齿苋中一种非常重要的化学物质。先前的报告显示，马齿苋属植物的生物碱具有抗氧化作用、抗炎作用、抗胆碱酯酶作用等。然而，POL-1对肝纤维化的作用及其作用机制尚不清楚，因此需要进一步探讨。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

本发明中所述马齿苋提取物（POL-1）的治疗肝纤维化得研究未被现有论文期刊所报道。本发明提供来源于马齿苋生物碱（POL-1）的一种分离方法，成功提取马齿苋生物碱。该方法操作步骤仅为四步，操作方法简便及快速，提取过程主要采用相似相溶原理。此外经研究表明化合物POL-1具有治疗肝纤维化的作用，因此本发明的化合物POL-1可以作为新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备治疗肝纤维化的候选药物。

附图说明

图1为正极模式UPLC-Q-TOF/MS对POL-1的化学成分分析。

图2为细胞活性测定实验。其中A为ET和不同浓度的POL-1对LX-2细胞活力的影响；B为POL-1抑制由TGF-β1诱导的LX-2细胞的活化。

图3为各组小鼠肝组织病理学切片HE染色实验结果和血清ALT和AST水平检测结果图。其中A为正常对照组HE染色图；B为模型组HE染色图；C为CT组HE染色图；D为POL-1H组HE染色图；E为POL-1L组HE染色图；F为各组小鼠血清中ALT的水平图；G为各组小鼠血清中AST的水平图。

图4为POL-1对肝纤维化小鼠肝脏病理学的影响和肝组织中collagen I和α-SMA的mRNA水平。其中，A为正常对照组肝组织切片MT染色图；B为模型组肝组织切片MT染色图；C为CT组肝组织切片MT染色图；D为POL-1H组肝组织切片MT染色图；E为POL-1L组肝组织切片MT染色图；F为各组小鼠肝组织中collagen I的mRNA水平；G为各组小鼠肝组织中α-SMA的mRNA水平。

图5 POL-1改善CCl4诱导的小鼠肝组织中氧化应激。其中A为各组小鼠肝组织中SOD水平；B为各组小鼠肝组织中GSH水平；C为各组小鼠肝组织中MDA水平。

图6 POL-1抑制CCl4诱导的纤维化小鼠的血清炎症因子。其中A为各组小鼠血清中TNF-α水平；B为各组小鼠血清中IL-6水平。

图7 各组小鼠肝组织TLR4，MyD88，NF-κBp65，Bax，Bcl-2，TGF-β1及Smad2蛋白的表达。其中，A为各组小鼠Western blotting分析电泳图；B为各组小鼠肝组织TLR4蛋白表达量柱状图；C为各组小鼠肝组织MyD88蛋白表达量柱状图；D为各组小鼠肝组织NF-κBp65蛋白表达量柱状图；E为各组小鼠肝组织Bax蛋白表达量柱状图；F为各组小鼠肝组织Bcl-2蛋白表达量柱状图；G为各组小鼠肝组织TGF-β1蛋白表达量柱状图；H为各组小鼠肝组织Smad2蛋白表达量柱状图。

具体实施方式

以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例一、本发明马齿苋提取物（POL-1）制备方法。

本发明所述马齿苋提取物（POL-1）的提取方法，具体步骤为：

步骤1：取干燥马齿苋药材20.0kg，用粉碎机粉碎，得马齿苋粉末；

步骤2：将步骤1所得粉末采用甲醇浸泡2h后，在2h之后按照固液比为：1：8，回流提取3次，第1次提取3小时、第2次提取3小时、第3次提取3小时，合并3次提取液之后用8层纱布过滤，得到滤液；

步骤3：将步骤2所得滤液经过旋转蒸发仪浓缩，浓缩后得到的浸膏5kg，取3kg的浸膏用蒸馏水进行溶解，溶解之后为2L的水溶液；

步骤4：将步骤3所得2L水溶液先用2L的石油醚进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的下层水溶液，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩下层的水溶液，得到浸膏A；之后，将浸膏A用1L的蒸馏水溶解，通过2L的乙酸乙酯进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的下层水溶液，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩下层的水溶液，得到浸膏B；之后，将浸膏B最后用1L的蒸馏水溶解，通过1L的饱和水正丁醇进行萃取3次，分层之后，合并3次萃取的上层的饱和正丁醇层，通过35 ℃的旋转蒸发仪浓缩上层的正丁醇，得到浸膏C 650g；600g的浸膏C用4000mL的蒸馏水溶解，得到的溶液经过SP825L大孔树脂洗脱，先用蒸馏水进行洗脱，洗脱步骤和判断洗脱结束步骤：流速：1.5mL/min，每隔1L收集一次洗脱液，洗脱至淡黄色，暂停收集，通过旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩之后会出现浸膏，如还有浸膏，继续用蒸馏水洗脱收集，当无浸膏之后，用10%乙醇洗脱。洗脱步骤和判断10%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用30%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断30%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用50%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断50%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。结束之后用70%乙醇洗脱，洗脱步骤和判断70%乙醇洗脱结束的方法与蒸馏水洗脱结束的步骤一致。最后用蒸馏水溶解70%乙醇的浸膏，经过冷冻干燥得POL-1。通过旋转蒸发仪判断是否还有浸膏，没有浸膏之后用10%乙醇洗脱，通过旋转蒸发仪判断是否还有浸膏，没有浸膏之后用30%乙醇洗脱，通过旋转蒸发仪判断是否还有浸膏，没有浸膏之后用50%乙醇洗脱，通过旋转蒸发仪判断是否还有浸膏，没有浸膏之后用70%乙醇洗脱，得到70%乙醇的洗脱液进行浓缩得浸膏，最后用蒸馏水溶解70%乙醇的浸膏，经过冷冻干燥得POL-1。

使用超高效液相色谱四极飞行时间质谱仪(UPLC-Q-TOF/MS；Thermo U3000质谱仪(Agilent 1290系统；Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)分析POL-1的化学成分。条件：流速：0.7 mL/min，进样量：10μL，溶剂体系：A：0.1%甲酸+水，B：甲酸+0.1%乙腈。

表1和图1显示POL-1中的主要化学成分，通过与相关文献和天然产物的质谱法数据库比对鉴定出20个化合物，对于NO.1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、17、19及20都是生物碱，说明通过SP825L大孔树脂洗脱的组分主要为生物碱。

表1 UPLC-Q-TOF/MS分析确定POL-1中的主要成分

。

实施例二、本发明马齿苋提取物（POL-1）治疗肝纤维化作用。

一、实验方法。

（1）将40只雄性小鼠随机分为正常对照组（NC）、模型组（CCl4）、CT组（阳性药秋水仙碱片0.1 mg/kg）和两个剂量的POL-1组（POL-1H，200 mg/kg；POL-1L，50 mg/kg），每组8只小鼠。除NC组外，其余各组均给予20%CCl4/橄榄油（1:4稀释），连续6周，每周3次持续6周。同期NC组腹腔注射相同体积的橄榄油。从造模7周开始，CT组和高/低剂量POL-1组分别给予0.1mg/kg、200mg/kg和50mg/kg，每日给药，连续4周。NC组每天灌胃同量生理盐水，持续4周。

（2）细胞活性测定法：将LX-2细胞接种于96孔板中，加入适量培养基，培养至一定密度。分为正常对照组（NC）、0.5 mmol/L乙醇（ET）组和实验组分别给予不同浓度（0、20、30、50、100、150、300、500和800μg/mL）的POL-1处理。根据CCK-8试剂盒的说明，测定细胞毒。采用CCK-8法检测POL-1对TGF-β1诱导的细胞增殖的影响。实验分为6组：正常对照组（NC）、TGFβ1诱导组和4个实验组（TGFβ1、ET、30、50和100μg/mL的POL-1）。然后将细胞数调整为5×10

（3）肝组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋。将组织切成5μm的切片。切片用苏木精-伊红（H&E）和马森三色染料（MT）染色。切片用亮场显微镜检测。

（4）全血于2mL EP管中4℃保存2h，3000转/分离心15min。上清为血清样本，用于后续血清转氨酶测定。根据试剂制造商的说明使用试剂盒测定血清ALT和AST水平。

（5）用TRIzol试剂（Invitrogen）从肝组织中提取总RNA。试剂盒将RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Green Master Mix对样品进行RT-PCR检测。检测Collagen I、α-SMA和GAPDH的mRNA 转录表达水平（表2）。

表2 RT-PCR引物序列表

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（6）氧化应激参数评估：取适量小鼠肝组织加入冰生理盐水洗去残留血液，放入组织匀浆器中制备匀浆，以3000 r · min-1离心得上清液，对SOD、GSH和MDA的含量进行测定。

（7）采用ELISA试剂盒检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平。

（8）取肝组织，对TLR4，MyD88，NF-κBp65，Bax，Bcl-2，TGF-β1及Smad2蛋白进行Western blotting分析。所有抗体在4℃下以1:1000稀释过夜，GAPDH作为加载对照。

二、实验结果。

图2A显示CCK8测定0.5mmol/L的乙醇（ET）及POL-1对LX-2细胞毒的作用，结果显示对ET对LX-2细胞无毒性作用。我们选择含有70%乙醇的POL-1作为研究对象，研究其对LX-2细胞的作用，发现干燥的POL-1有可能保留乙醇。以酒精剂测定，POL-1含有约3%的乙醇，其体积摩尔浓度约为0.43 mmol/L，因此我们选择0.5 mmol/L的乙醇（ET）作为载体组。而POL-1处理在150μg/mL时表现出抑制LX-2细胞，因此，选择30μg/mL，50μg/mL和100μg/mL剂量的POL-1对LX-2细胞增殖的实验的研究。图2的CCK8实验显示ET不抑制或促进10ng/mLTGF-β1诱导的 LX-2细胞增殖；而POL-1抑制了10ng/mLTGF-β1刺激的LX-2细胞的增殖能力。这些结果提示POL-1对动物肝纤维化模型具有一定的治疗作用。

图3A-E显示H&E染色结果，CCl4注射液引起肝脏病理改变，包括脂肪变性、坏死和纤维化间隔（图3B）。而CCl4加POL-1组显著减轻肝损伤（图3D和E）。此外，图3F和G显示与CCl4组比较，POL-1降低了血清中ALT和AST的含量。这些结果说明POL-1具有保护肝脏的作用。

图4A-E结果显示CCl4显著增加了胶原沉积，而用POL-1处理显著减弱了肝脏中的胶原沉积。此外，图4F和G显示PCR的结果，POL-1显著抑制collagen I和α-SMA的mRNA水平。这些结果表明，POL-1减轻了小鼠肝损伤，进一步显示出抑制肝纤维化的作用。

图5A-C检测POL-1对小鼠肝脏中氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平，而丙二醛(MDA)水平的影响。CCl4组显著降低SOD和GSH水平，而MDA活性则较空白组升高，显示抗氧化系统受损。POL-1能显著提高SOD和GSH含量，降低MDA含量，从而提高抗氧化能力。结果表明，POL-1对CCl4诱导的小鼠肝脏氧化损伤具有明显的抑制作用。

图6A和B显示CCl4组血清TNF-α和IL-6促炎因子含量明显高于空白组。同时，POL-1可降低血清TNF-α和IL-6水平。综上所述，POL-1抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化炎症。

在图7中，CCl4诱导TLR4，MyD88，NF-κBp65，Bax，TGF-β1和Smad2的蛋白质表达显著上调，但下调小鼠肝脏中的Bcl-2蛋白质。然而，用POL-1处理CCl4的小鼠减少了TLR4，MyD88，NF-κBp65，Bax，TGF-β1和Smad2的蛋白，但是上调了小鼠肝脏中的Bcl-2蛋白。我们的研究表明，POL-1治疗通过调节TLR-4/NF-κB，Bcl-2/Bax和TGF-β1/Smad2途径上的相关蛋白的表达来抑制小鼠的活性纤维化。

可见，本发明马齿苋提取物（POL-1）对CCl4诱导的小鼠肝纤维化具有一定的治疗作用；并可有效降低CCl4诱导的小鼠体内氧化应激水平和炎症因子释放，且呈浓度依赖。我们的研究还表明POL-1治疗通过调节TLR-4/NF-κB，Bcl-2/Bax和TGF-β1/Smad2途径上的相关蛋白的表达来抑制小鼠的活性纤维化。

综上所述，本发明提供马齿苋（POL-1）的提取方法，依次采用甲醇提取，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂萃取。采用SP825L大孔树脂洗脱正丁醇层，得到70%乙醇组分，得到POL-1。该方法简便、快速，且经该方法得到的化合物得率较高。从中药马齿苋根中提取出来，其具有治疗肝纤维化的作用，因此本发明的POL-1可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。