一种钆铂放疗增敏剂的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及放疗增敏剂技术领域，尤其是涉及一种钆铂放疗增敏剂的制备方法与应用。

背景技术

放射治疗，又称放疗，是临床癌症治疗的重要手段，放射疗法利用高能量电离辐射，通过对特定的身体肿瘤部位施加辐射来治疗癌症。目前临床上约有70%的癌症患者需要接受放射治疗，40%的肿瘤可以通过放射治疗根治。

放疗对癌细胞的损伤与O

目前，利用纳米输送系统将O

发明内容

本发明的目的是提供一种钆铂放疗增敏剂的制备方法与应用，以解决现有的纳米输送系统提高肿瘤微环境中的O

为实现上述目的，本发明提供了一种钆铂放疗增敏剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、以乙酰丙酮钆、乙酰丙酮铂为原料制备钆调控的铂基纳米材料Pt@Gd

S2、取步骤S1合成的Pt@Gd

反应结束后离心收集沉淀，将沉淀洗涤、离心后分散于去离子水中，制得钆铂放疗增敏剂Pt@Gd

优选地，步骤S1具体为：

S1-1、将乙酰丙酮钆和乙酰丙酮铂溶解于一缩二乙二醇中，80 ℃、400 - 500 rpm搅拌反应40 min；向溶液中加入聚乙烯亚胺，80 ℃、400 - 500 rpm搅拌反应20 min；向溶液中加入三乙醇胺溶液，80 ℃、400 - 500 rpm搅拌反应30 min；搅拌结束后，将产物转移到特氟龙内衬的高压釜中，在200 ℃下保持24 h。

S1-2、产物以14000 rpm、15 min离心收集沉淀，用无水乙醇和去离子水各洗3遍，最终产物分散在去离子水中，即得钆调控的铂基纳米材料Pt@Gd

优选地，步骤S1-1中，聚乙烯亚胺、乙酰丙酮钆、乙酰丙酮铂、一缩二乙二醇的质量体积比为1:40:40:40。

优选地，步骤S1-1中，三乙醇胺、乙酰丙酮钆、乙酰丙酮铂、一缩二乙二醇的质量体积比为1:50:50:50。

优选地，步骤S2中，Pt@Gd

优选地，步骤S2中，离心收集沉淀为以14000 rpm、10 min离心收集沉淀；洗涤为用去离子水洗涤2 - 3遍。

优选地，制备的钆铂放疗增敏剂Pt@Gd

因此，本发明采用上述一种钆铂放疗增敏剂的制备方法与应用，具有如下技术效果：

（1）本发明制备的钆铂放疗增敏剂具有MRI能力且分散性良好，利用钆离子对铂纳米颗粒生长的调节特性，有效优化了铂纳米颗粒的稳定性和分散性，同时赋予了铂纳米颗粒MRI能力；

（2）本发明制备的钆铂放疗增敏剂具有过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性，可以催化过氧化氢(H

附图说明

图1为实施例一制得的GP的透射电镜图片；

图2为实施例一制得的GP的Mapping图片；

图3为实施例一制得的GP的XPS图片；

图4为不同浓度GP与H

图5为荧光倒置显微镜检测MC 38细胞与不同时间、不同浓度的GPP共孵育后的细胞摄取情况；

图6为不同浓度的GPP对HUVEC细胞的生物相容性测定结果图；

图7为不同浓度的GPP的药物体外溶血测定结果图；

图8为不同处理对MC 38细胞的细胞毒性测定结果图；

图9为DCFH-DA荧光探针检测不同浓度GPP与MC 38细胞共孵育后产生·OH的荧光图像；

图10流式细胞术检测不同处理对MC 38细胞的诱导凋亡的能力验证；其中（A）部分为不同处理组流式细胞术散点图；（B）部分为不同处理组凋亡细胞统计图；

图11为细胞克隆实验检测不同处理对MC 38细胞增殖能力的抑制；其中（A）部分为不同处理组结晶紫染色结果观察图；（B）部分为不同处理组增值率统计图。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例一

钆调控的铂纳米材料的制备

将20 mg的乙酰丙酮钆和20 mg的乙酰丙酮铂溶解于20 mL一缩二乙二醇中，在80℃，500 rpm的磁力搅拌下反应40 min。

在溶液中加入0.5 g聚乙烯亚胺（PEI），在80 ℃，500 rpm的磁力搅拌下反应20min。

在溶液中添加0.4 mL三乙醇胺溶液，在80 ℃，500 rpm的磁力搅拌下反应30 min。

搅拌结束后，将产物转移到特氟龙内衬的高压釜中，在200 ℃下保持24 h。

最后以14000 rpm，15 min离心收集沉淀，用无水乙醇和去离子水各洗3遍，最终产物分散在去离子水中，即得钆调控的铂纳米材料（Pt@Gd

效果例一

取实施例一合成的Pt@Gd

搅拌结束后，以14000 rpm，10 min离心收集沉淀，用去离子水洗2遍，产物分散在去离子水中，即得钆调控的铂纳米制剂（Pt@Gd

实验测试

（1）如图1所示，取适量GP材料，超声处理后滴加至铜网上，烘干制备成透射电镜样品，并用透射电子显微镜观察，结果显示实施例一制备的GP粒径约为20 nm。

（2）如图2所示，取适量Pt@Gd

（3）如图3所示，对Pt@Gd

在1188.9 eV (Gd3d)和141.8 eV (Gd4d)处的峰可以归因于Gd

（4）如图4所示，通过观察TMB溶液在652nm处的紫外-可见光吸收，进一步评价GP的类过氧化物酶活性。随着GP剂量的增加，652 nm处的吸收逐渐增加，说明GP可以有效催化H

（5）如图5所示，荧光倒置显微镜检测GPP被肿瘤细胞摄取的能力。

将Pt@Gd

结果显示，随着浓度和时间的增加，红色荧光强度逐渐增强，说明MC 38对Pt@Gd

（6）如图6所示，通过MTT实验检测GPP对正常细胞的毒性作用。

取对数生长期的HUVEC细胞消化，以1×10

此后，吸去培养液，每孔加入MTT培养基100 μL孵育3 h，随后弃去培养基，每孔加入150 µL DMSO，振荡10 min使紫色结晶物全部溶解，利用酶标仪读取各个浓度在490 nm处的吸光值，由吸光值计算细胞存活率与纳米材料浓度的关系。

结果显示，HUVEC细胞的存活率在纳米材料浓度低于320 μg/mL时均大于80%，说明GPP对正常细胞具有良好的生物相容性。

（7）通过小鼠摘眼球取血获得新鲜的血液，在常温下，3000 rpm、15 min离心以获得红细胞。加入5 mL PBS缓冲液，轻轻吹打混匀，离心弃上清，并将沉淀红细胞在20 mL的PBS中重悬。将GPP加入红细胞悬液中，配制的最终浓度为0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100 µg/mL。

以PBS稀释的红细胞悬液为阴性对照，以超纯水稀释的红细胞悬液为阳性对照，添加不同浓度GPP的红细胞为实验组。将各组溶液在37℃恒温培养箱中孵育3小时，然后将溶液以3000 rpm离心15 min，将样本摆在同一水平线上，用手机或照相机对其溶血现象进行拍摄。

吸取样本上清液100 µL于96孔板中，用酶标仪检测样本在542 nm的吸光度，并计算溶血率。

如图7所示，结果发现，当用不同浓度的GPP与红细胞共孵育时，可以观察到红细胞基本全部下沉，上清液与阴性对照组相比变化不大。这说明GPP没有使红细胞发生溶血，具有良好的血液相容性。

（8）如图8所示，通过MTT实验检测GPP对肿瘤细胞的杀伤效果。

取对数生长期的MC 38细胞消化，以1×10

24 h后吸去培养液，每孔加入MTT培养基100 μL孵育3 h，随后弃去培养基，每孔加入150 µL DMSO，振荡10 min使紫色结晶物全部溶解，利用酶标仪读取各个浓度在490 nm处的吸光值，由吸光值计算细胞存活率与纳米材料和RT的关系。

结果显示，MC 38细胞的存活率在纳米材料浓度为40 μg/mL时GPP组低于50%，并且GPP+RT组细胞存活率更低，说明GPP对MC 38细胞具有很好的细胞毒性，放疗增强了对MC 38细胞的杀伤效果。

（9）如图9所示，使用DCFH-DA荧光探针检测GPP诱导ROS生成的能力。

取对数生长期的MC 38细胞消化，以30

结果显示，随着GPP浓度的增加，绿色荧光增强，说明GPP能够诱导产生ROS。

（10）如图10所示，使用凋亡试剂盒检测测试（8）中GPP处理后肿瘤细胞的凋亡情况，凋亡实验所用染料为Annexin-V FITC和7-AAD。

图10中（A）部分为流式细胞术散点图，其中：

Q1代表Annexin-V FITC-/7-AAD+，表示细胞死亡；

Q2代表Annexin-V FITC+/7-AAD+，表示晚期凋亡；

Q3代表Annexin-VFITC+/7-AAD-，表示早期凋亡；

Q4代表Annexin-V FITC-/7-AAD-，表示正常细胞。

图10中（B）部分为凋亡细胞统计图。

结果显示，GPP处理后，肿瘤细胞的凋亡率明显增加，表明本发明制备GPP具有促进肿瘤细胞凋亡的能力，GPP+RT组凋亡率进一步增加，表明放疗能够增强GPP诱导肿瘤细胞凋亡的能力。

（11）如图11所示，通过克隆形成实验检测GPP和RT对MC 38增殖能力的抑制。

取对数生长期的MC 38细胞消化，以5

随后观察细胞克隆情况。增殖结束后，使用PBS冲洗细胞两次，使用4%多聚甲醛固定15min，随后加入结晶紫染色30 min，PBS冲洗，最后对克隆结果进行分析。染色观察结果如图11中（A）部分所示，增值率统计图如图11中（B）部分所示。

结果显示GPP组克隆球少，表明GPP能够有效抑制MC 38的增殖，GPP+RT组几乎没有克隆球产生，表明放疗增强了GPP对MC 38的抑制能力。

因此，本发明采用上述一种钆铂放疗增敏剂的制备方法与应用，利用钆离子对铂纳米颗粒生长的调节特性，合成了具有MRI能力的钆铂放疗增敏剂；该钆铂放疗增敏剂具有CAT活性，能够催化H

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。