一种包含活性组分的脂质体

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种包含活性组分的脂质体。

背景技术

中草药一直以来都是中医治疗中不可或缺的部分，对于疾病的预防和治愈在几千年就已经被证实并且沿用到现在。随着科学技术的发展更是进一步发现其本身蕴含的多糖、多酚、黄酮等有效活性成分。

中草药除了在医药方面有着无与伦比的贡献，在化妆品方面也是有着受人关注的潜力。在一项报告中表明了天然制剂非常受欢迎，在400名被调查的者中有241人(60.25％)都在使用天然外用产品。而如今许多化妆品配方中都含有植物提取物，用于美白祛斑，防晒，抗衰，保湿，柔软头发，乳化，透皮吸收促进剂，香料，抑菌防腐等。中草药除了可以在化妆品方面使用，还可以在食品，保健品等方面进行研究开发，而这些都依赖于其天然无污染的功效成分，这也都在表明中草药具有的巨大潜力。

脂质体是由英国的Alec D.Bangham在1961年首次合成，由于脂质体类似于生物膜，可包埋亲水性和疏水性物质，对人体无害无毒无免疫原性，利用脂质体为运输载体，可以避免功效成分受到体内酶类的破坏和免疫系统的抑制，同时可以增加功效成分在机体内的保留时间，更好地发挥作用，因而促进了脂质体在医药、食品工业、化妆品等领域中的应用。2012年获美国食品药品监督管理局批准上市，由美国Talon制药公司利用脂质体具有降低药物毒性的优点，开发的硫酸长春新碱脂质体针剂，降低了长春新碱的神经毒性同时增加了长春新碱的靶向部位的药物浓度；2018年9月美国Insmed公司开发出了阿米卡星脂质体，以用于治疗成人肺部分枝杆菌复合体疾病，脂质体可以将阿米卡星硫酸盐递送至肺部，有着良好的治疗效果；欧莱雅公司利用类脂质体技术开发了一款兰蔻抗衰老化妆品等系列脂质体化妆品，就是将维生素A、维生素E、醋酸盐等因其光稳定性和热稳定性较差容易在空气中氧化，但是其又有着较好的美容效果，作为化妆品的组分包埋于脂质体中，使得被包埋药物更好地在皮肤上发挥作用。

中药配方在健康保护和疾病预防控制方面一直发挥着非常重要的作用，基于中药治未病的思想，常被用于预防和延缓衰老及与衰老相关的慢性疾病和亚健康。针对中草药在实际的生产运用中存在着活性成分稳定性低，不易保存，导致利用率低也是限制其发展的问题，对中药材单一和复配的活性物成分在抗氧化活性的相互作用以及通过运用脂质体进行包埋，提高稳定性，为中药活性成分在抗衰老保健品、化妆品和药品方面的应用提供一定的参考依据。

发明内容

本发明提供了一种包含活性组分的脂质体，该脂质体可提高活性组分的稳定性，提高其在化妆品、保健品和药品方面的应用。

本发明所提供的脂质体是将大豆卵磷脂、吐温-80及胆固醇置于圆底烧瓶中，加入溶解液使大豆卵磷脂完全溶解，后将其蒸发至均匀的薄膜，然后加入含有中草药活性提取物(ACL)的磷酸缓冲溶液，旋转水化至完全溶解后进行超声处理得到本发明的脂质体(ACL-L)；

所述的中草药，为黄芩或丹参；

所述的中草药活性提取物(ACL)，其一种制备方法如下：

1)取黄芪或丹参，用粉碎机进行粉碎，将粉碎后的中草药倒入烧瓶中，加入食用级乙醇，密封浸泡，加热回流提取，离心收集提取液；

2)把提取液加入膜分离器中，用陶瓷膜进行膜过滤；

3)通过透过液回流管出口收集透过液，待透过液管无液体或者只有少量液体流出时，打开料罐与泵联通的管道，收集截留液；

4)将截留液进行冷冻干燥，获得中草药活性提取物(ACL)。

所述的大豆卵磷脂、吐温-80及胆固醇，作为实施例的一种记载，大豆卵磷脂：胆固醇：吐温-80比例为20:5:8；

所述的中草药活性提取物(ACL)的磷酸缓冲液，作为实施例的一种记载，为浓度为0.2mol/L的PBS(pH为6.8)，ACL添加量为大豆卵磷脂：ACL＝2：1。

所述的超声，处理时间为2min。

本发明所提供的脂质体提高了活性成分的稳定性和储存时效，延长了活性成分的使用效能，为脂质体的多方面应用和规模化生产提供依据。

附图说明

图1：DPPH自由基清除能力和IC50图，其中(A)为黄芪，(B)为丹参60％乙醇一次提取，(C)为丹参95乙醇提取，(D)为丹参60％乙醇二次提取，(E)为丹参水提；

图2：铁还原能力图，其中(A)为黄芪，(B)为丹参60％乙醇一次提取，(C)为丹参95乙醇提取，(D)为丹参60％乙醇二次提取，(E)为丹参水提；

图3：多糖、多酚和类黄酮的单因素图(大豆卵磷脂：胆固醇)；

图4：多糖、多酚和类黄酮的单因素图(大豆卵磷脂：ACL)；

图5：多糖、多酚和类黄酮的单因素图(大豆卵磷脂：吐温-80)；

图6：多糖、多酚和类黄酮的单因素图(PBS-pH值)；

图7：ACL-L纳米粒度图；

图8：ACL-L透射电镜图；

图9：ACL-L的稳定性图，其中A为关于多糖稳定性，B为关于多酚稳定性，C为关于黄酮稳定性；

图10：ACL-L的缓释性能图，其中A为关于多糖缓释性能，B为关于多酚缓释性能，C为关于黄酮缓释性能。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

本发明所使用的主要试剂、仪器见表1、表2。

表1实验材料与试剂统计表

表2实验仪器统计表

ACL-L的包埋率的测定操作：准确移取0.1mLACL-L样品加入离心管中，同时加入10mg/mL鱼精蛋白溶液0.1mL。3min后加入生理盐水3mL。充分混合后，在4000r/min的转速下离心30分钟。从离心管的上层清液吸取1mL用苯酚-硫酸法、Folin-Ciocalteu法和NaNO2–Al(NO3)3–NaOH比色法测定其游离在脂质体外部的多糖、多酚和黄酮含量。其计算公式为：

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：制备黄芪陶瓷截留液冻干物脂质体(ACL-L)

中草药活性物的提取：分别取黄芪或丹参250g，使用粉碎机进行粉碎1min，加大其在回流提取时的接触面积。接着，将粉碎后的中草药导入2000ml的烧瓶中，并按照料液比＝1：4的情况下加入浓度为60％的食用级乙醇1000ml，密封浸泡2h。紧接着在80℃下加热回流提取3h，提取一次。离心收集提取液(ACL)，放置冰箱4℃保存备用。

精密称取200mg的大豆卵磷脂、吐温-80及胆固醇至圆底烧瓶中，紧接着加入6mL无水乙醇，摇晃振荡30s，使得大豆卵磷脂完全溶解。然后将其放进50℃的旋转蒸发仪中水浴旋转，蒸发至形成均匀的薄膜，这时加入含有一定量ACL的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(简称PBS)10mL。旋转水化至完全溶解后进行超声处理2min，制成ACL-L悬浊液。

将悬浊液加入洗膜完的膜分离机器的料罐中进行过膜，通过透过液回流管出口收集透过液，待透过液管无液体或者只有少量液体流出时，停止膜分离机器，然后打开料罐与泵联通的管道，收集截留液，将截留液进行冷冻干燥获得冻干物脂质体(ACL-L)。

1.1DPPH自由基清除能力测试

称取对照品维生素C(简称VC)100mg置于100ml容量瓶中加纯水定容，得到浓度为1mg/mL的溶液，然后精密移取1、2、4、6、8、10ml置于10ml容量瓶中加纯水定容，得到0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的对照品待测液。提取液冻干物待测液配制同上。同时精密称取3.94mgDPPH置于100ml容量瓶中定容，配制成0.1mmol/L的DPPH溶液，避光保存。

1、取2mL不同浓度的对照品溶液+2mL DPPH溶液，混合摇匀，避光静置30min，在517nm处测吸光度，为Ai。

2、取2mL不同浓度的对照品溶液+2mL无水乙醇溶液，混合摇匀，避光静置30min，测吸光度，为Aj。

3、取2mL无水乙醇溶液+2mL DPPH溶液，混合摇匀，避光静置30min，测吸光度，为A0。

提取液冻干物待测液步骤同上。

DPPH自由基清除率计算公式：

由图1可以看出在几种提取液中，各个膜分离后的物质的DPPH自由基清除能力有着较大的不同，其中丹参类提取液的清除率最高。

当样品浓度达到0.8mg/ml时，丹参以及含丹参的提取液的DPPH清除能力达到90％～95％左右。其次是黄芪陶瓷膜截留液，清除率为43.33％，IC50值为1.354mg/ml。

1.2还原力测试

称取对照品维生素C(简称VC)100mg置于100ml容量瓶中加纯水定容，得到浓度为1mg/mL的溶液，然后精密移取1、2、4、6、8、10ml置于10ml容量瓶中加纯水定容，得到0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的对照品待测液。提取液冻干物待测液配制同上。精密称取1000mg铁氰化钾置于100ml容量瓶中定容，配制成1％铁氰化钾溶液，避光棕色瓶保存。

1、取不同浓度的样品溶液1ml放置到10ml具塞比色管中，加入2.5ml pH＝6.6的PBS缓冲溶液，同时也加入1％的铁氰化钾溶液2.5ml，摇晃混合均匀后再50℃的水浴锅中保温20min。

2、混合液冷却到室温后加入10％的三氯乙酸2.5ml，混合均匀静止10min。取2.5ml混合液放入到新的具塞比色管中，加入2.5ml水以及0.1％的三氯化铁0.5ml，上下摇晃均匀，静止10min，用紫外分光光度计在700nm处测定其吸光度。

在抗氧化检测中，对样品的铁离子还原能力的检测也是一项重要指标。正常情况下，由于铁离子的还原力与提取液的本身的抗氧化能力存在正相关的关系，即在检测中样品的吸光度越大，其对应的铁还原能力越强，抗氧化性能越好。

由图2的铁还原能力图中可以看出，各个膜分离后的物质的铁还原能力有着一定区别。在不同种类的的提取液中，丹参类提取液的还原力基本较高，黄芪次之。而丹参类提取液中的丹参95％乙醇提取的150Dal膜提取液的铁还原能力最好，浓度为0.8mg/ml时，吸光度达到1.5左右。次之的黄芪提取液中，黄芪陶瓷截留的还原力最好，达到0.5左右。

实施例2：优化脂质体制备工艺的因素

2.1单因素实验

1、固定大豆卵磷脂∶胆固醇＝4∶1，大豆卵磷脂∶吐温80＝10∶3，PBS pH＝7.4。考察大豆卵磷脂：ACL的比例(2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10：1)对包埋率的影响。

如图3所示，在固定大豆卵磷脂为200mg，大豆卵磷脂：ACL＝4：1，大豆卵磷脂：吐温-80＝10：3，PBS的pH＝7.4的前提下，分别按照胆固醇∶大豆卵磷脂为2：1、3：1、4：1、5：1、6：1进行单因素考察。在图中可以观察到，多糖和黄酮都是在比例为5：1时包埋率达到最大值，分别为20％和41.7％。而多酚则在4：1时达到最大值，包埋率为37.2％。并且无论是哪一种活性物都是随着比例的增大，胆固醇的减少，其包埋率都是先上升后下降。那是因为磷脂双分子层本身通透性具有一定的不稳定性，过多的胆固醇会导致脂质体通透性过小，刚性较强，容易形成结晶物，但是随着胆固醇的减少，流动性调节能力增强，让其变得更加稳定，减小通透性，减低芯材的泄露，提高包埋率。

2、固定大豆卵磷脂：ACL＝5∶1，大豆卵磷脂∶吐温＝10∶3，PBS pH＝7.4，考察大豆卵磷脂∶胆固醇比例(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)对包埋率的影响。

如图4所示，在固定大豆卵磷脂为200mg，大豆卵磷脂：胆固醇＝4：1，大豆卵磷脂：吐温-80＝10：3，PBS的pH＝7.4的前提下，按照大豆卵磷脂：ACL为2：1、4：1、6：1、8：1、10：1的比例进行单因素考察。以脂质体包埋率作为指标，在图中可以看出多糖、多酚和黄酮都是在比例为4：1时包埋率达到最大值，分别为17.5％、38.8％以及37.1％。

随着比例的增大，ACL用量的减少，包埋率逐渐下降，这是由于磷脂双分子层对ACL进行包埋时，对包埋的样品有一定的浓度要求，高浓度的样品在增大芯材与磷脂的接触面积和概率的同时也会，使其更加容易往磷脂里面渗透，从而加强脂质体对样品的包埋率。但是过高浓度的芯材会导致脂质体薄壁破裂，从而降低包埋率。所以ACL-L由于前期ACL浓度过高导致包埋率较低。随着浓度的减少后，达到包埋的合适浓度，包埋率开始上升，但是当芯材浓度减少到一定程度后与磷脂的接触面积减少，包埋率再次下降。

3、固定大豆卵磷脂∶胆固醇＝4∶1、大豆卵磷脂：ACL＝5∶1，PBS pH＝7.4，考察不同大豆卵磷脂∶吐温80的比例(10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5)对包埋率的影响。

如图5所示，在固定大豆卵磷脂为200mg，大豆卵磷脂：ACL＝4：

1，大豆卵磷脂∶胆固醇＝4：1，PBS的pH＝7.4的前提下，按照大豆卵磷脂：吐温-80比例为10：1、10：2、10：3、10：4、10：5滴进行单因素考察，在图中多糖多酚、黄酮在比例为10：4时包埋率达到最大值，分别为18％、37％和39％。

可以发现随着吐温-80的增加，比例的减少，3种活性物的脂质体包埋率先逐渐上升然后再下降。这是因为在脂质体制备的过程中吐温-80是作为乳化剂的作用，乳化剂与乳化效果呈正相关关系。当乳化剂用量较少时，乳化效果会比较差，整个包埋体系系统不稳定，硫酸双分子层分层不均一，导致包埋率低。相反随着用量增加，乳化效果加强，对壁材的溶解能力也强，包埋效果更好。但是如果乳化剂过多的话则会反过来堵塞大豆卵磷脂的流动性，影响对样品的包埋。因此在前期随着滴加吐温-80用量逐渐增加时，脂质体稳定性加强，ACL-L的包埋率提高，在比例为10：5时乳化剂用量过多，导致流动性变差，样品容易泄露，包埋率下降。

4、固定大豆卵磷脂∶胆固醇＝4∶1，大豆卵磷脂：ACL＝5∶1，大豆卵磷脂∶吐温80＝10∶3，考察不同PBS缓冲液的pH值(6.6、6.8、7.0、7.2、7.4)对包封率的影响。进行单因素实验，考察各因素变量对样品脂质体包封率的影响。

如图6所示，在固定大豆卵磷脂为200mg，大豆卵磷脂：ACL＝4：1，大豆卵磷脂∶胆固醇＝4：1，大豆卵磷脂：吐温-80＝10：3的前提下，按照PBS的pH＝6.6、6.8、7.0、7.2、7.4进行单因素考察，由图可以看出，随着pH值的增加，3种活性物的包埋率逐渐增加，在pH为7.0时，包埋率分别为20％、45％、44％。但是随着pH值的继续加强，ACL-L的包埋率开始下降。那是因为脂质体在溶液中就像带电粒子一样，有着相反电荷的脂质体会不由自主地吸引聚集在一起。而在脂质体聚集和融合的过程中可以通过在配方中添加少量酸性或碱性脂质来控制。并且脂质体在弱酸或者弱碱情况下，磷脂双分子层的流动性还会受到酸碱的刺激，导致流动性增强，从而减少芯材的外泄，提高包埋率，但是过强的酸碱效果则会破坏其结构，导致包埋率下降。因此ACL-L的包埋率会随着pH值的变化而变化。

2.2正交实验

根据单因素实验，选择大豆卵磷脂：胆固醇、大豆卵磷脂与ACL比、PBS的pH值3个因素以及最佳因素的3个水平进行正交实验，通过3因素3条件对ACL-L包埋率的影响，以确定制备ACL-L的最佳工艺条件。

通过观察确定选择大豆卵磷脂：胆固醇的比例为1：4、1：5、1：6，大豆卵磷脂：ACL的比例为2：1、4：1、6：1以及PBS的pH值＝6.8、7.0、7.2等3个水平。

表3多糖正交实验结果表

表4多酚正交实验结果表

表5黄酮正交实验结果表

由表3、表4和表5的极差进行比较分别可以看出，脂质体对ACL的多糖、多酚和黄酮分别进行包埋，其受单因素的影响依次为：pH>脂样比>脂胆比、脂胆比>脂样比>pH、脂样比>pH>脂胆比。

在以上3个表格中，多糖正交的正交序列6的包埋率最高，为42.86％，序列1次之，为41.26％。而多酚的则是正交序列1的包埋率最高，为60.18％，序列5次之，为59.62％。，在黄酮正交里面，正交序列4的包埋率最高，为69.07％，序列7次之，为57.98％，再次之为序列1，包埋率为51.18％。因此根据该包埋率进行综合考虑，选择正交序列1为ACL-L的最佳制备工艺，分别为200mg大豆卵磷脂、4：1下的胆固醇50mg、2：1比例下的ACL取100mg、80mg吐温-80以及pH为6.8的PBS。

实施例3：ACL-L物理性质的测定

3.1ACL-L粒径及分布测定

利用粒度分析仪测定脂质体的粒径及分布，测定温度为25℃，准确移取100μLACL-L，定容到10mL容量瓶，用蒸馏水稀释100倍，样品测量3次，取平均值。

由图7可以看出，脂质体的粒径范围为：342nm-530nm之间，平均粒度为460nm，多相分散系数(PDI)为0.652。

3.2ACL-L透射电镜下形态的检测

精密移取1mLACL-L用PBS(pH 7.2)稀释2倍，接着吸取少许溶液滴到附有碳膜的铜网上，10min后用滤纸吸去剩余的液体，然后滴上浓度为2％的磷钨酸进行染色，大约5min后再用滤纸吸去多余的染色液，室温下无尘风干后用透射电子显微镜进行观察。

由图8可以看出ACL-L整体呈现球形囊泡状，整体比较稳定，符合脂质体的基本特征，可以很好地把ACL包裹在里面。

实施例4：ACL-L化学性质的测定

4.1ACL-L储藏稳定性的研究

以保留率为指标，研究ACL-L常温避光与4℃避光、常温避光和常温不避光条件下ACL里面多糖、多酚、黄酮的保留率，以此评估样品脂质体的贮藏稳定性。以未被包埋的ACL为空白对照，空白脂质体作为校零对照。保存5个星期，每1个星期测一次

式中：M1为初始样品的质量(mg)；M2为储藏一段时间后样品的质量(mg)。

由图9可以看出，无论是对于多糖，或者多酚，亦或者黄酮，ACL-L在常温避光、常温不避光以及4℃避光的稳定性远比黄芪多糖相对应情况的稳定性好。在4℃避光下，经过5个星期的存储，ACL-L多糖保留率为20％，多酚的保留率为46％，黄酮的保留率为46％，而相比于ACL原溶液，其活性物的保留率分别为4.5％、33.3％以及31％。两者对比下，ACL-L保留率高出15.5％、12.7％和15％。而在其他两种情况下，ACL-L的保留率也有所提高，由此可以看出黄芪陶瓷截留物进行包埋成为脂质体后可以很好避免外界环境的干扰，减少降解率，提高其稳定性，加强储存效果，扩展应用场景。

4.2ACL-L体外释放特性的研究

用ACL溶液为对照试验，以PBS作为释放介质，考察ACL-L的释放特性。移取ACL-L4mL加入预处理好的透析袋中，然后将密封的透析袋浸没在400mL的释放介质中，在温度为37℃±0.5℃，搅拌速度为700r/min下进行透析。在1、2、4、6、8、10、12、24h后分别取1mL透析袋外样品，并补充等量预热到37℃的新鲜PBS，通过上述方法测定样品的质量，每个样品平行测定3次，累积释放率按下式计算：

式中：Mn为某一时刻n释放的样品质量(mg)；M为总样品的质量(mg)。

由图10可以看出ACL经过脂质体包埋后，其对于多糖、多酚、黄酮的缓释性能相比于ACL原溶在24小时内的缓释效果更好。脂质体对多糖的缓释性能从4h开始逐渐体现出来，由一开始与原溶液多糖释放效率相差2.2％到24h后变成相差10％，且差值随着时间的推移呈现逐渐扩大的趋势。脂质体对于多酚和黄酮的缓释也有一定效果，缓释24h后释放差值分别达到7％和5％，且差值同样呈现扩大趋势。

ACL-L的制备提高了活性成分的稳定性和储存效能，同时也延长了

性成分的使用效能，一定程度上避免资源浪费，为其在多方面应用和连续化或者半连续化生产提供了一定依据。