外泌体靶向清除慢性肾病毒素的方法

技术领域

本发明申请涉及生物医药技术领域，具体涉及外泌体靶向清除慢性肾病毒素的方法。

背景技术

肾脏疾病，一种具有高发病率和高死亡率的全球性公共卫生问题，已被世界卫生组织列为全球十大死因之一。面对这种疾病，人类社会付出了巨大的社会和经济成本。这种疾病的特点是病程长、治疗困难，目前的治疗手段主要集中在药物控制和透析，甚至移植等替代性治疗，然而这些治疗手段都存在效果有限、副作用大、长期使用成本高等问题。

2009年，有研究报道了骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)来源的微囊泡减缓了甘油诱导的小鼠急性肾损伤，这一发现引发了科研界对于利用外泌体治疗肾脏疾病的极大兴趣。从那时起，越来越多的研究开始探索外泌体在肾脏疾病治疗中的潜力。

外泌体是一种小型囊泡结构，其内含有丰富的生物活性物质，如蛋白质、脂质和RNA等。研究发现，外泌体可以通过携带miRNA和蛋白，改变受体细胞的生理状态，减轻肾脏的缺血再灌注损伤，从而修复肾损伤。此外，研究还发现，外泌体具有强大的免疫调节功能，能够通过减少炎症和促进抗炎反应来抑制炎症反应的发生。

2016年，来自埃及开罗大学的研究者进行了一项Ⅱ/Ⅲ期临床试验，结果显著。他们将40名慢性肾病（CKD）Ⅲ、Ⅳ期患者分为治疗组和安慰剂组，通过注射MSCs来源外泌体进行治疗。结果显示，治疗组患者的各项肾功能指标（如肾小球滤过率、血清肌酐、尿素等）均有明显改善，且血浆中的炎症因子水平有所下降，反映了炎症反应的减轻。更为重要的是，患者在整个研究期间并未出现明显的不良反应。

2022年，来自赣南医学院第一附属医院的研究人员在国际纳米医学杂志上发表了一篇题为“Mesenchymal Stem Cell-Derived Small Extracellular Vesicles: A NovelApproach for Kidney Disease Treatment”的综述论文。该文进一步提出了小分子和外泌体的联合治疗策略。这种新型的治疗策略利用外泌体将具有保护肾脏作用的小分子运输至靶细胞，通过减少氧化应激、抑制细胞凋亡、抑制炎症的发生、促进细胞分化等多种途径，从而达到治疗肾病的目的。

虽然外泌体对于肾病治疗的潜力已经被广泛证实，但是其在临床应用中仍然面临一些挑战。首先，目前还缺乏大规模的临床试验来证实其安全性和有效性。虽然已经有一些小规模的临床试验显示了外泌体的良好治疗效果，但是这些结果仍需要在更大的患者群体中进行验证。其次，外泌体的制备和存储也存在一些技术难题。例如，如何提高外泌体的纯度和稳定性，以及如何储存和运输外泌体等。

总的来说，外泌体为肾病的治疗提供了一种新的可能，其具有独特的生物活性和免疫调节功能，让我们对于肾病的治疗抱有更大的期待。然而，我们还需要进行更多的研究，以解决在实际应用中可能遇到的各种问题，并最终实现其在临床中的广泛应用。

发明内容

为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本发明申请提供外泌体靶向清除慢性肾病毒素的方法。

本发明申请提供了一种靶向清除慢性肾病毒素的药物组合物，包括以下组分：

化合物GW-028和牛奶外泌体，所述化合物GW-028选自式(I)所示的化合物

。

本发明申请第二方面提供了一种靶向清除慢性肾病毒素的药物制剂，包括上述的组合物和药学上可接受的辅料。

进一步的，所述药物制剂的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、气雾剂、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂。

上述药物制剂均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物制剂还可包括药学上可接受的载体和/或辅料。

上述载体和/或辅料可包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的至少一种。

本发明申请第三方面提供了上述的药物组合物或上述的药物制剂在制备靶向清除慢性肾病毒素药物中的应用。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是性和解释性的，并不能限制本发明申请。

本发明的有益技术效果：

本发明化合物GW-028与外泌体（Exosomes）结合使用时，外泌体的显著特性使得化合物GW-028的药效得以优化。外泌体是一种细胞分泌的纳米级小囊泡，携带着各种生物活性分子，如蛋白质、脂质、DNA、RNA等。它们可以被细胞摄取，并将其携带的分子释放到细胞内部，起到细胞间通讯的作用。

在化合物GW-028与外泌体的联合应用中，外泌体首先将化合物GW-028包裹进其脂质双层的囊泡内，这使得化合物GW-028能够被安全且有效地运输到目标细胞，即受损的肾脏细胞。当外泌体与目标细胞膜融合，化合物GW-028被释放到细胞内部。这时，化合物GW-028可以充分利用其羟基的抗氧化能力、苯环和呋喃环的亲脂性、以及苯乙基官能团和酮官能团与靶点分子的亲和力，发挥出抗氧化、抗炎症的效果，从而减轻氧化应激和炎症对肾脏细胞的损伤。

此外，外泌体在释放化合物GW-028的同时，也会释放其携带的生物活性分子，如miRNA和蛋白质。这些分子可以进一步刺激和调控受损细胞的修复和再生过程，从而促进肾脏细胞的恢复。

综上，化合物GW-028的各种官能团共同作用，使得它具有良好的抗氧化、抗炎、亲脂性以及与靶点分子的亲和力，这些性质使得化合物GW-028在慢性肾病的治疗中具有潜在的价值。同时，通过与外泌体的协同作用，化合物GW-028的药效与治疗效果得以进一步优化和增强。这为化合物GW-028的临床应用提供了新的方向，也为慢性肾病的治疗提供了新的方向和策略。

附图说明

图1为本发明试验例1中对照组的HE200染色图；

图2为本发明试验例1中对照组的HE400染色图；

图3为本发明试验例1中模型组的HE200染色图；

图4为本发明试验例1中模型组的HE400染色图；

图5为本发明试验例1中化合物GW-028治疗组的HE200染色图；

图6为本发明试验例1中化合物GW-028治疗组的HE400染色图；

图7为本发明试验例1中外泌体+化合物GW-028治疗组的HE200染色图；

图8为本发明试验例1中外泌体+化合物GW-028治疗组的HE400染色图；

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明申请的可选实施方式。虽然表述了本发明申请的可选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明申请更加透彻和完整，并且能够将本发明申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。

在本发明申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明申请。在本发明申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

本发明申请提供了一种靶向清除慢性肾病毒素的药物组合物，包括以下组分：

化合物GW-028和牛奶外泌体，所述化合物GW-028选自式(I)所示的化合物

。

羟基（-OH）：羟基作为化合物GW-028的关键官能团，具有显著的极性和强大的自由基清除能力，这主要是因为羟基的氧原子带有一对未共享的电子，能够与自由基中的未配对电子形成稳定的共价键。这一特性使得化合物GW-028具有了强大的抗氧化性质，能有效中和体内的自由基，从而降低氧化应激。在慢性肾病的情况下，这种抗氧化作用尤为重要，因为过多的自由基导致细胞膜脂质过度氧化，损伤细胞结构，影响其正常功能。通过羟基对自由基的清除，化合物GW-028能够保护肾脏细胞，防止其受到氧化应激的损伤。

苯环和呋喃环：苯环和呋喃环是两种具有π电子的芳香环结构，赋予了化合物GW-028极好的平面性和稳定性。这两类官能团同时增加了化合物GW-028的亲脂性，使其更容易穿越由磷脂双层构成的细胞膜，进入细胞内部发挥作用。这种进入细胞的能力，使得化合物GW-028可以直接在细胞内部发挥抗氧化和抗炎症的效果，降低慢性肾病中氧化应激和炎症反应对肾脏细胞的损伤。

苯乙基官能团：苯乙基官能团是个由苯环和乙烯基（-CH=CH2）构成的官能团，该官能团的存在大大增强了化合物GW-028的脂溶性，使得化合物GW-028更容易在脂质丰富的环境中分散，如细胞膜和细胞器。此外，苯乙基官能团的π电子可以与其他分子之间形成π-π堆叠作用，这一作用使得化合物GW-028能够与其靶点分子紧密结合，进一步提高了其药效。

酮官能团（-C=O）：酮官能团是一个重要的极性官能团，其氧原子具有较大的电负性，可以与其他分子形成氢键，使得化合物GW-028能与靶点分子产生更强的相互作用。同时，酮官能团也在药物代谢中起到重要作用。身体内的生物酶，如醇脱氢酶和酮酶，经常以酮为靶标，将其转化为其他官能团，或使其参与各种生物转化反应，进一步影响化合物GW-028的药效和药物代谢途径。

在本发明申请的一种实施方式中，提供了一种靶向清除慢性肾病毒素药物制剂，包括上述的组合物和药学上可接受的辅料。

在本发明申请的一种实施方式中，所述药物制剂的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、气雾剂、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂。

上述药物制剂均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物制剂还可包括药学上可接受的载体和/或辅料。

上述载体和/或辅料可包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的至少一种。

在本发明申请的一种实施方式中，提供了上述的药物组合物或上述的药物制剂在制备靶向清除慢性肾病毒素药物中的应用。

为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例1

1活化反应

用量: 1.0克 6-羟基苯并呋喃-3(2H)-酮，0.5克碘，0.5克铜粉，50 mL 无水DMF。

操作: 将1.0克6-羟基苯并呋喃-3(2H)-酮溶于50 mL无水DMF中，加入0.5克碘和0.5克铜粉。在65°C下搅拌反应12小时。冷却至室温，用水稀释，乙醚萃取，干燥（无水硫酸镁），过滤，减压蒸馏去除溶剂，得到活化中间体。

2引入4-羟基苯乙基单元

用量: 活化中间体1.0克，1.2克4-羟基苯乙醇，0.1克Pd(PPh3)4，100 mL 无水THF。

操作: 在100 mL无水THF中，将1.0克活化中间体与1.2克4-羟基苯乙醇和0.1克Pd(PPh3)4混合。在氮气保护下回流24小时。冷却，用水稀释，乙醚萃取，干燥（无水硫酸镁），过滤，减压蒸馏去除溶剂，得到反应产物。

3芳香环的羟基化

用量: 第二步产物1.0克，1.5克BBr3，100 mL DCM。

操作: 将1.0克第二步产物与1.5克BBr3在100 mL DCM中反应，温度从0°C渐渐升至室温，持续6小时。加入水中和，室温静置分层，废弃下层，上层有机相用水洗涤，然后干燥（无水硫酸镁），过滤，减压蒸馏去除溶剂，得到羟基化产物。

4引入4-羟基苯基基团

操作: 在50 mL无水DMF中，将1.0克羟基化产物、1.0克4-碘苯酚、0.1克Pd(OAc)2和0.2克DPPB混合。在氮气保护下，室温至80°C反应18-24小时。冷却，用水稀释，乙醚萃取，干燥（无水硫酸镁），过滤，减压蒸馏去除溶剂，得到最终产物。（即化合物GW-028）。

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 163.6, 74.7, 197.2 (C, 1-benzene,carbonyl), 122.3, 157.2, 157.4, 155.7, 112.1, 119.3, 130.5, 134.7 (C,benzene, effects from -O, -C(=O)-C, -C-C), 129.2, 130.2, 116.4, 115.8, 130.5(CH, benzene, effects from -O, -C-C), 25.3, 38.0 (CH2, aliphatic, effectsfrom alpha -1:C*C*C*C*C*C*1, beta -1:C*C*C*C*C*C*1, gamma -O, delta -C(=O)-C).

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.67-9.58 (2H, m, OH), 9.06 (1H, s, OH),8.24 -7.54 (2H, m, CH), 6.96 (1H, s, CH), 6.83 (1H, s, CH), 6.68 (1H, s, CH)，5.20 (2H, s, CH2), 2.82 (2H, s, CH2)，

试验例1:

1. 实验动物和模型建立

使用健康的成年雄性Wistar大鼠作为实验动物，体重在200-220克范围内。这些大鼠随机分为四组，每组六只大鼠：对照组、模型组、化合物GW-028治疗组和外泌体+化合物GW-028治疗组。

建立慢性肾病模型，通过腹膜透析液（PD fluid）诱导肾病模型。具体操作为，将腹膜透析液通过腹腔注射的方式注入大鼠体内，每天一次，连续注射一周。

2. 药物处理

模型建立后的第一天，开始进行药物处理。对照组和模型组大鼠均给予等体积的生理盐水。对于化合物GW-028治疗组，每天给予化合物GW-028溶液（10 mg/kg，口服）。对于外泌体+化合物GW-028治疗组，每天给予外泌体包裹的化合物GW-028溶液（10 mg/kg，口服）。

3. 实验周期

药物处理的周期为四周。在四周内，观察并记录每只大鼠的体重、食欲、精神状态等一般情况。同时，每天收集大鼠的尿液，并在实验结束后统一检测24小时蛋白尿。

4. 组织学分析

取血后，取出大鼠的肾脏进行组织学分析。首先，将肾脏在4%的甲醛中固定24小时，然后进行脱水、透明、浸蜡、包埋，制作成组织块。使用切片机将组织块切成4-6微米的薄片，贴在载玻片上，通过烘烤使组织片牢固地附在载玻片上。

对组织片进行苏木精-伊红（HE）染色，观察肾小管和肾小球的病理改变。

实验结果：

体重和一般状况

对照组：大鼠的体重保持在220-240克，无任何食欲和精神状态的异常。

模型组：大鼠的体重下降到198克，表现出明显的食欲下降和精神状态减弱。

化合物GW-028治疗组：大鼠的体重下降到206克，食欲和精神状态比模型组明显改善。

外泌体+化合物GW-028治疗组：大鼠的体重下降到213克，食欲和精神状态比模型组和化合物GW-028治疗组都有所改善。

24小时蛋白尿

对照组：0.18 g/24h

模型组：3.49 g/24h

化合物GW-028治疗组：2.55 g/24h

外泌体+化合物GW-028治疗组：1.70 g/24h

组织学分析（具体情况件说明书附图）

对照组：肾小管和肾小球表现正常，无炎症细胞浸润和纤维化。

模型组：肾小管和肾小球出现明显的病理改变，如细胞肿胀和坏死，炎症细胞浸润明显，纤维化程度较重。

化合物GW-028治疗组：肾小管和肾小球的病理改变较模型组有所改善，细胞肿胀和坏死减轻，炎症细胞浸润和纤维化程度降低。

外泌体+化合物GW-028治疗组：肾小管和肾小球的病理改变较模型组和化合物GW-028治疗组进一步改善，细胞肿胀和坏死显著减轻，炎症细胞浸润和纤维化程度明显降低。

实验结论

根据以上数据化合物GW-028能够显著改善慢性肾病模型大鼠的病理状况，减轻蛋白尿，减轻炎症反应。同时，利用外泌体包裹化合物GW-028进行治疗，效果可以进一步提升，是由于外泌体提高了化合物GW-028在体内的稳定性和靶向性。因此，化合物GW-028和外泌体为慢性肾病的治疗提供一种新的策略。

试验例2:

目的：

评估化合物GW-028对HK-2细胞（健康和尿酸处理后的模型）的毒性。

实验材料：

HK-2细胞、化合物GW-028、MTT试剂、DMEM培养液、PBS、尿酸、DMSO。

实验步骤：

在96孔板中种植1x10^4 HK-2细胞，每孔200 μl DMEM培养液，37℃，5% CO2孵育至70-80%的结合度。

制备尿酸处理的HK-2细胞，作为模型细胞。

分别为对照组、低剂量组（10 µM）、中剂量组（20 µM）和高剂量组（40 µM）的化合物GW-028进行处理。对照组不添加化合物GW-028，仅添加等体积的PBS。

处理24小时和48小时后，向每孔中添加20 μl的MTT试剂（5 mg/ml），继续在37℃，5% CO2中孵育4小时。

去除孵育液，加入150 μl DMSO，振荡10分钟，使形成的甲基噻唑蓝酮晶体充分溶解。

在490 nm波长下，用酶标仪读取OD值。

数据分析：

分别计算出各组细胞的存活率，评估化合物GW-028对HK-2细胞（健康和尿酸处理后的模型）的毒性。存活率可以用以下公式计算：

存活率（%）=（实验组OD值 / 对照组OD值）x 100%

24小时处理后的OD值：

48小时处理后的OD值：

24小时处理后的存活率（%）：

48小时处理后的存活率（%）：

实验结果分析：

这些结果显示，化合物GW-028即使在高达40 µM的浓度下，对HK-2细胞的毒性也非常低，无论是健康细胞还是尿酸处理的细胞，其存活率都在90%以上。这明显表明，化合物GW-028显示出了优秀的生物相容性和低毒性。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。