一种具有乙酰胆碱抑制活性的灵芝三萜粗提物的制备方法

技术领域

本发明涉及真菌发酵产物制备方法和功效应用，特别涉及一种具乙酰胆碱酯酶抑制活性的灵芝三萜粗提物的制备方法。

背景技术

老年痴呆症，是发生于老年和老年前期以进行性神经退化为特征的大脑退行性病变，已经成为继心血管疾病和肿瘤之后严重威胁老年人生命健康的主要疾病之一。老年痴呆症致病因素多、发病机制复杂，单一成分单一靶点难以奏效，多角度多策略攻击疾病系统可以克服许多单靶点药物的局限性。近些年来，药食同源天然提取成分因具有多组分、多靶点及协同效果、安全性高、毒副作用小等特点，在发病机制复杂以及慢性疾病的防治中显示出巨大的优势和开发应用前景。灵芝自古作为中医以食疗来预防和治疗肿瘤、糖尿病、高血压等慢性疾病的首选食物，研究报道，灵芝三萜具有良好的抗炎、抗肿瘤、保护肝脏和抗氧化等多方面生物活性和药理作用。AChE又称为真性胆碱酯酶，是生物神经传导中的一种关键酶，该酶能特异性降解神经递质-乙酰胆碱，使其水解为乙酸和胆碱，从而使乙酰胆碱缺失，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，导致神经信号传递失败，从而引起大脑出现退行性病变。目前，AChE抑制剂被认为是老年痴呆症较为有效的药物治疗手段。因此，可从灵芝中寻找具有神经保护活性的AChE抑制剂，开发相关保健食品或药物，其具有适宜患者长期服用，与化学合成抑制剂相比，毒副作用小、安全性高等优点，特别适合老年痴呆症发病期长、需长期服药。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种具有乙酰胆碱抑制活性的灵芝三萜粗提物的制备方法，实现短时间获得高含量的灵芝三萜，同时，寻找具有神经保护活性的AChE抑制剂，为开发防治老年痴呆症相关保健食品或药物提供依据。

技术方案：一种具有神经保护作用的灵芝三萜液体发酵粗体物的制备方法，该方法所用灵芝为黄边灵芝Ganoderma luteomarginatum，并通过如下步骤进行：

(1)培养基配制

斜面培养基和种子培养基配制：玉米粉葡萄糖培养基：玉米粉40g，加入1000mL的水，煮沸，保持30分钟，不断的搅拌，纱布过滤，取滤液。加20g琼脂，等琼脂全部溶解完，加入葡萄糖搅拌待全部溶解，补水至1000mL，装入试管与锥形瓶中，高压蒸汽灭菌锅灭菌25min。

菌种活化培养基为常规PDA培养基。

发酵培养基配制：玉米粉作为碳源，添加量3％，蛋白胨作为氮源，添加量0.3％，无机盐MgSO4添加量0.05％，KH

(2)灵芝菌种培育：全程在无菌操作台上操作。选取一根形态较好的灵芝，在其菌柄与菌盖的连接处，切除上表皮与下表皮，将菌肉切成绿豆大小(刀要锋利，防止有损表面菌种)。并将切好的菌种浸泡酒精半小时，以杀死杂菌。将杀菌后的灵芝菌种放入灭菌好的斜面培养基中，放入设定好的培养箱中(27℃，无光)培养5天。中间多去观察菌种的长势，是否长杂菌和空白是否长菌。五天过后截取一小块菌丝放入培养皿中进行二次培养再次培养五天观测菌种生长情况，最终获得母种，菌种编号2021GL01。

(3)活化菌种：将灵芝菌种转接于PDA平板上，于27℃黑暗条件下培养7d，备用。

(4)制备种子液：无菌条件下，取活化灵芝菌种，接入装有100mL的种子液培养基的500mL锥形瓶中，于27℃、50-200r/min条件下培养7d，备用。

(5)液体发酵：将培养好的种子培养液，按照5～15％的接种量接入发酵培养基中，接种后于27℃、50～200r/min下培养3～10天。

(6)灵芝三萜粗体物制备：将(5)获得的灵芝发酵液经真空浓缩蒸干后，按照料液比25-45％加入乙醇溶液，于80-100℃超声波提取1-2h后，4000rpm/min离心5min，取上清液于70℃干燥后即可获得产品。

有益效果：本发明与传统通过灵芝子实体获得灵芝三萜的技术相比，缩短了制备时间和成本，同时显著提高了灵芝三萜的含量和提取率，同时该粗提物具有较好的神经保护活性，可开发相关保健食品或药物，对于防治老年痴呆症具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为液体发酵培养基优化单因素实验结果；

图2为三萜提取工艺优化单因素实验结果

图3为三萜提取率受提取时间与提取温度影响变化曲线；

图4为提取时间与提取温度对三萜提取率影响的等高线；

图5为三萜提取率受提取时间与料液比浓度影响变化曲线；

图6为提取时间与料液比浓度对提取率影响的等高线；

图7为三萜提取率受料液比浓度与提取温度影响变化曲线；

图8为料液比浓度与提取温度对提取率影响的等高线；

具体实施方式

1.培养基配制

斜面培养基和种子培养基配制：玉米粉葡萄糖培养基：玉米粉40g，加入1000mL的水，煮沸，保持30分钟，不断的搅拌，然后密及的纱布过滤，取滤液。加20g琼脂，等琼脂全部溶解完，加入葡萄糖搅拌待全部溶解，补水至1000mL，装入试管与锥形瓶中，高压蒸汽灭菌锅灭菌25min。

菌种活化培养基为常规PDA培养基。

2.灵芝菌种培育

全程在无菌操作台上操作。选取一根形态较好的灵芝，在其菌柄与菌盖的连接处，切除上表皮与下表皮，将菌肉切成绿豆大小(刀要锋利，防止有损表面菌种)。并将切好的菌种浸泡酒精半小时，以杀死杂菌。将杀菌后的灵芝菌种放入灭菌好的斜面培养基中，放入设定好的培养箱中(27℃，无光)培养5天。中间多去观察菌种的长势，是否长杂菌和空白是否长菌。五天过后截取一小块菌丝放入培养皿种进行二次培养再次培养五天观测菌种生长情况，最终获得母种，菌种编号2021GL01。

3.活化菌种

将灵芝菌种转接于PDA平板上，于27℃黑暗条件下培养7d，备用。

4.制备种子液

无菌条件下，取活化灵芝菌种，接入装有100mL的种子液培养基的500mL锥形瓶中，于27℃、50-200r/min条件下培养7d，备用。

5.液体发酵

将培养好的种子培养液，按照5～15％的接种量接入发酵培养基中，接种后于27℃、50～200r/min下培养3～10天。

6.灵芝三萜含量测定

将5获得的灵芝发酵液经真空浓缩蒸干后，按照料液比25-45％加入乙醇溶液，于80-100℃超声波提取1-2h后，4000rpm/min离心5min，取上清液于70℃干燥后获得灵芝三萜粗提物。对灵芝三萜的检测采用香草醛-冰醋酸法。取适量的样品溶液加入试管中再加入蒸馏水定容至2.0mL，用60℃水浴蒸干，加入0.4mL现配现用的5％香草醛-冰醋酸和1mL的高氯酸，摇匀后水浴后静止室温下。在546nm波长处测定吸光度，以无水乙醇为空白组进行测定。

7.液体发酵培养基的优化

7.1单因素实验

7.1.1碳源及其添加量的确定

固定氮源为0.5％的酵母粉，无机盐为0.2％的KH

确定最佳的碳源方案后，改变碳源的添加量，分别为0％、1％、2％、3％、4％，测定灵芝三萜的含量，确定最佳的碳源添加量。

根据图1，可知玉米粉的最佳的添加量为3％时，灵芝三萜提取率最高。

表1碳源对菌丝体生长和产胞外三萜的影响

注:“+”用来定性表示菌体数量多少,“+”越多表示菌体数量越多。表2同。

7.1.2氮源及其添加量的确定

固定碳源为3％的葡萄糖，无机盐为0.2％的KH

表2氮源对菌丝体生长和产胞外三萜的影响

确定最佳的氮源方案后，改变氮源的添加量，分别为0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％，测定灵芝三萜的含量，确定最佳的氮源添加量。

根据图1，可知蛋白胨的最佳的添加量为0.3％时，灵芝三萜提取率最高。

7.1.3无机盐添加量的确定

固定氮源为0.5％的酵母粉，碳源为3％的葡萄糖，改变无机盐KH

固定氮源为0.5％的酵母粉，碳源为3％的葡萄糖，无机盐KH

根据图1，可知KH

7.2正交实验设计

根据单因素实验结果，对碳源与氮源、无机盐KH

由表4判断各因素对灵芝三萜提取率的影响，对R值比较发现，对灵芝三萜的影响顺序是A>D>C>B，影响效果最为显著的是碳源玉米粉的添加量，最低的是蛋白胨的添加量。对k值进行比较发现，灵芝三萜的最佳提取率组合是A

表3培养基优化正交实验设计表

表4培养基优化正交实验结果

8.灵芝三萜提取工艺的优化

8.1单因素实验

8.1.1料液比浓度对三萜提取率的影响

控制时间2h，温度80℃，精密量取菌液0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL，测定三萜含量。由图2可知，提取灵芝三萜最佳的料液比浓度为30％。

8.1.2提取时间对三萜提取率的影响

控制料液比浓度为30％，提取温度为80℃，水浴加热时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，测定三萜含量。由图2可知，提取灵芝三萜最佳的时间为2h。

8.1.3提取温度对三萜提取率的影响

控制料液比浓度为30％，提取时间为2h，水浴加热温度分别为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，测定三萜含量。由图2可知，提取灵芝三萜最佳的温度为80℃。

8.2灵芝三萜响应面实验

根据单因素实验结果，用design expert软件制定响应面实验方案，再以其给定的方案实验所得数据绘制响应面曲线，确定三萜提取率最高的工艺参数。

表5三萜提取率回归方程方差分析结果

由图3和图4可以看出，提取温度与提取时间等高线图呈现曲线而不是直线，说明提取温度与提取时间二者相互作用对灵芝三萜的提取率的影响是显著的。随着提取温度与提取时间的增加提取率也在增加，当温度达到80℃，时间为2h时，提取率达到峰值。

由图5和图6可以看出，料液比浓度与提取温度等高线图呈现曲线而不是直线，说明料液比浓度与提取温度二者相互作用对灵芝三萜的提取率的影响是显著的。随着提取温度与料液比浓度的增加提取率也在增加，当温度达到80℃，料液比浓度为30％时，提取率达到峰值。

由图7和图8可以看出料液比浓度与提取时间等高线图呈现曲线而不是直线，说明料液比浓度与提取时间二者相互作用对灵芝三萜的提取率的影响是显著的。当料液比浓度浓度为30％时，时间为2h时，提取率达到峰值。相应的此时的三萜提取效率最高。

实验模型预测：灵芝三萜的最佳提取工艺是料液比浓度为30％，提取温度为80℃，提取时间为2h时，此时的最高提取率为0.675％。将预测结果进行验证实验(3次重复)，灵芝三萜产量为0.674％，与模型预测值很接近，表明该模型对于优化三萜提取工艺具有可行性。

9.乙酰胆碱酯酶抑制活性测定

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)抑制活性测定采用改良的Ellman法。其原理为：底物类似物碘化硫代乙酰胆碱经AChE催化后，生成乙酸和硫代胆碱，这两种化合物与显色剂DTNB反应后生成黄色物质，并在405nm波长处有特异光吸收值。将待测化合物与乙酰胆碱酯酶溶液混合，若碘化硫代乙酰胆碱降解的量减少，同时，与显色剂生成的黄色化合物减少，在405nm处的特异光吸收值变小，则待测化合物对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性，反之，则没有抑制作用。实验方法如下：

(1)将Na

(2)向反应体系中依次加入磷酸缓冲液(pH 8.0)110μL—待测化合物(1mM)10μL—AChE酶(0.1U/mL)40μL，在酶标仪中孵育20min，405nm测2次背景值，再加入DTNB(6.25mM)和碘化硫代乙酰胆碱(6.25mM)的等体积混合液40μL，每个样品3次重复。

(3)加入显色剂和底物后，每隔30秒检测一次405nm的吸光值；

(4)选取NC组吸光值(平均值)约为1时的样品吸光值，计算化合物吸光值(化合物测定值-背景值)的平均值，按照公式：(NC-化合物吸光值平均值)/NC*100％，计算化合物AChE抑制率。

实验测定结果，见表6，可知灵芝三萜粗提物对乙酰胆碱酯酶抑制活性达到了53.7％，具有较好的开发前景。

表6灵芝三萜粗提物的乙酰胆碱酯酶抑制活性(％)

注：TA:他克林反应终浓度0.333μM，化合物反应终浓度100μM；

“+”表示抑制率介于10％～20％之间；“++”表示抑制率介于20％～60％之间，建议不做IC

“+++”表示抑制率>60％，建议进一步检测IC