包含蛋白酶激活的治疗剂的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2021年5月7日提交的美国临时专利申请第63/185941号和2022年2月23日提交的美国临时专利申请第63/313087号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

I.发明领域

本发明涉及疾病治疗领域，特别涉及癌症的治疗。

II.背景

使用白细胞介素(IL)-12的细胞因子癌症免疫疗法在小鼠和人体中都显示出很强的抗肿瘤功效。然而，由于其严重的毒性，一些IL 12临床试验已经终止或失败。迄今为止，IL 12尚未被批准用于临床。免疫疗法用于激活免疫反应，因此，副作用通常来自健康器官中的药物作用。本领域需要降低治疗性治疗的毒性的策略。

发明概述

本公开涉及包含一个或多于一个肿瘤相关蛋白酶切割位点的掩蔽治疗剂的工程。在暴露于肿瘤微环境中的肿瘤相关蛋白酶后，多肽被切割，这暴露了治疗剂，减少了与全身施用相关的脱靶副作用和毒性。因此，本公开的方面涉及包含通过接头结合至掩蔽剂的细胞因子的多肽，其中接头包含至少两个SEQ ID NO:138的蛋白酶切割位点和至少两个SEQID NO:134的蛋白酶切割位点，并且其中掩蔽剂包含特异性结合至细胞因子的细胞因子受体多肽或其片段。进一步的方面涉及包含通过接头结合至掩蔽剂的细胞因子的多肽，其中接头包含与SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:219至SEQ IDNO:246之一至少具有80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中掩蔽剂包括特异性结合至细胞因子的细胞因子受体多肽或其片段。还描述了包含通过接头结合至掩蔽剂的细胞因子的多肽，其中接头包括甘氨酸-丝氨酸接头；并且其中掩蔽剂包括特异性结合至细胞因子的细胞因子受体多肽或其片段。

接头可包含与SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:219至SEQ ID NO:246之一具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，接头包含或组成为SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:219至SEQID NO:246之一的氨基酸序列。在一些方面，接头包含SEQ ID NO:48。

又一些其它方面涉及包含SEQ ID NO:197至SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:247或SEQID NO:248之一的氨基酸序列或与SEQ ID NO:197至SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:247或SEQID NO:248之一至少具有80％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些方面，多肽包含或组成为与SEQ ID NO:197至SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:247至SEQ ID NO:248之一具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

本公开的其它方面涉及多肽，该多肽包括通过接头结合至掩蔽剂的细胞因子，其中接头包含一个或多于一个肿瘤相关蛋白酶裂解位点，并且掩蔽剂包括特异性结合至细胞因子的细胞因子受体多肽或其片段。掩蔽剂是指阻断治疗剂与至少一种结合配偶体结合的分子。在一些方面，治疗剂包括抗体，结合配偶体包括抗原。在一些方面，治疗剂包含细胞因子，结合配偶体包含受体多肽。

其他方面涉及包含本公开的多肽的组合物。又一些其它方面涉及编码本公开多肽的核酸和包含本公开核酸和/或多肽的宿主细胞。还提供了用于制备多肽的方法，包括在宿主细胞中表达本公开的核酸并分离表达的多肽。其它方面涉及用于治疗癌症的方法，该方法包括向将本公开的多肽或组合物施用于有需要的对象，例如患有癌症的对象。

细胞因子可以包括白细胞介素-12(IL 12)，掩蔽剂可以包括白细胞介素12受体(IL 12R)多肽或其IL 12结合片段。在一些方面，IL 12包含p35和p40亚基中的一个或两个。在一些方面，IL 12包含通过二硫键连接的p35和p40亚基。在一些方面，IL 12包含通过肽接头连接的p35和p40亚基。在一些方面，IL 12R多肽或片段包含白细胞介素12受体β1(IL 12Rβ1)或其片段。IL 12可包含SEQ ID NO:3的多肽或与SEQ ID NO:3具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。IL 12R多肽或片段可包含白细胞介素12受体β2(IL 12Rβ2)或其片段。IL 12Rβ1多肽可包含IL-12Rβ1的人FNI-II结构域。在一些方面，IL 12Rβ1多肽包含SEQ ID NO:195的多肽或与SEQ ID NO:195具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些方面，该多肽与SEQ ID NO:195具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中该多肽结合至IL 12。在一些方面，多肽包含SEQ ID NO:197或与SEQ ID NO:197具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。

在一些方面，掩蔽剂融合到IL 12的p35亚基的N末端，并且其中包含肿瘤相关蛋白酶切割位点的接头位于掩蔽剂和IL 12的p35亚基之间。在一些方面，掩蔽剂融合到IL 12的p35亚基的C末端，并且其中包含肿瘤相关蛋白酶切割位点的接头位于掩蔽剂和IL 12的p35亚基之间。在一些方面，掩蔽剂融合到IL 12的p40亚基的C-末端，并且其中接头在掩蔽剂和IL 12的p40亚基之间。在一些方面，掩蔽剂融合到IL 12的p40亚基的N末端，并且其中接头在掩蔽剂和IL 12的p40亚基之间。在一些方面，细胞因子包括白细胞介素-2(IL-2)，掩蔽剂包括白细胞介素2受体α亚基(IL-2Rα)、白细胞介素2受体β亚基(IL-2Rβ)、白细胞介素2受体γ亚基(IL-2Rγ)、片段或其片段的组合。在一些方面，细胞因子包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，掩蔽剂包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31的氨基酸序列或SEQ ID NO:27、SEQID NO:29或SEQ ID NO:31的片段或组合。在一些方面，掩蔽剂包含与SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和/或SEQ ID NO:31具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，细胞因子包括干扰素-γ(IFNγ)，掩蔽剂包括干扰素-γ受体1(IFNγR1)、干扰素-γ受体2(IFNγR2)、片段或其片段的组合。在一些方面，细胞因子包含SEQID NO:26的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，掩蔽剂包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35的氨基酸序列或SEQ ID NO:33和/或SEQ ID NO:35的片段或组合。在一些方面，掩蔽剂包含与SEQ ID NO:33和/或SEQ IDNO:35具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，多肽包含至少四个肿瘤相关蛋白酶切割位点。在一些方面，多肽包含至少、至多或恰好4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个或其中可推导的任何范围的肿瘤相关蛋白酶切割位点。在一些方面，接头还包含至少一个丝氨酸蛋白酶敏感切割位点。丝氨酸蛋白酶敏感切割位点可以包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:3的切割位点。在一些方面，接头包含SEQ ID NO:219或与SEQ ID NO:219具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些方面，接头包含SEQ ID NO:220或与SEQ ID NO:220具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。

在一些方面，接头包含或还包含(GGGS)n，其中n是1至4。在一些方面，n等于2。

在一些方面，肿瘤相关蛋白酶切割位点包括至少一个本文所述的肿瘤相关蛋白酶切割位点。在一些方面，肿瘤相关切割位点包括具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:109至SEQ ID NO:190之一的氨基酸的切割位点。在一些方面，多肽包含至少两个不同的肿瘤相关蛋白酶切割位点。在一些方面，多肽包含至少2个、3个或4个或其中可推导的任何范围的不同的肿瘤相关蛋白酶切割位点。在一些方面，多肽包含至少2个相同的肿瘤相关蛋白酶切割位点。在一些方面，多肽包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个或其中可推导的任何范围的相同的蛋白酶切割位点。在包含多于一个蛋白酶切割位点的方面，蛋白酶切割位点可以是相邻的或者可以具有插入的氨基酸。在一些方面，至少、至多或恰好0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或其中可推导的任何范围的氨基酸，将一个肿瘤相关蛋白酶切割位点与另一个肿瘤相关蛋白酶切割位点分开。

在一些方面，细胞因子包括抗炎细胞因子。在一些方面，细胞因子包括促炎细胞因子。

在一些方面，多肽与肿瘤靶向剂缀合。在一些方面，肿瘤靶向剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗体或抗原结合片段包含基质靶向抗体或其基质结合片段。在一些方面，抗体或结合片段特异性结合至纤连蛋白、纤连蛋白的选择性剪接结构域、胶原蛋白、腱糖蛋白、骨膜蛋白、多配体蛋白聚糖、蛋白聚糖或肿瘤基质细胞特异性抗原。在一些方面，抗体或结合片段特异性结合至纤连蛋白的额外结构域A(EDA)或额外结构域B(EDB)。在一些方面，肿瘤靶向剂包含特异性结合至包含额外结构域A(EDA)的纤连蛋白的选择性剪接结构域的Fab。在一些方面，肿瘤靶向剂包含特异性结合至肿瘤相关抗原的抗体或其抗原结合片段。其他肿瘤靶向剂包括在US20140294723A1、WO2001062298A2、WO1997045544A1、WO2006119897A2、WO2006050834A2、WO2008120101A2、WO2010078916A1中列举的那些，这些文献通过引用并入本文。

在一些方面，肿瘤靶向剂包含胶原蛋白结合结构域。在一些方面，多肽包含至少两个胶原蛋白结合结构域。在一些方面，多肽包含至少2个、3个、4个、5个或6个胶原蛋白结合结构域。在一些方面，多肽包含来自核心蛋白聚糖或血管性假血友病因子(VWF)胶原蛋白结合域。在一些方面，胶原蛋白结合结构域包含含有SEQ ID NO:1的多肽或与SEQ ID NO:1具有或至少具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，多肽还包含与多肽缀合的血清蛋白。在一些方面，血清蛋白通过肽键与多肽缀合。在一些方面，血清蛋白包括白蛋白或其片段。在一些方面，血清蛋白为至少40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa或75kDa(或其中可推导的任何范围)。

在一些方面，多肽包含第二接头。在一些方面，第二接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。在一些方面，多肽包含第三、第四或第五接头。在一些方面，第三、第四或第五接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。在一些方面，接头包含(GGGS)n(SEQ ID NO:191)其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8或其中可推导的任何范围，或者GGGSGGGS(SEQ ID NO:47)。在一些方面，第二接头包含(GGGS)n(SEQ ID NO:191)，其中n＝6。在一些方面，接头包含(GGGS)N(SEQ IDNO:191)，其中＝6。在一些方面，多肽包含蛋白质标签。在一些方面，蛋白质标签包含6H标签(SEQ ID NO:87)。在一些方面，蛋白质标签包括本文所述的蛋白质标签。在一些方面，多肽不与颗粒、纳米囊泡或脂质体有可操作地连接。在一些方面，组合物不包含脂质体、颗粒或纳米囊泡。

该组合物可以包含或还包含额外的多肽。在本公开的方面，该方法可以包括或还包括施用额外的多肽。额外的多肽可以是本文所述的多肽。在一些方面，该组合物包含额外的多肽，其中该多肽是IL-12p35或p40亚基。在一些方面，额外的多肽包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少具有70％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，额外的多肽包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有或至少具有60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％，或其中可推导的任何范围的序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，方法或公开涉及皮肤癌的治疗，例如黑色素瘤的治疗。在一些方面，癌症包括黑色素瘤、结肠癌或乳腺癌。在一些方面，癌症包括实体瘤。

在一些方面，本公开的方法还包括施用一种或多于一种额外的癌症疗法。在一些方面，额外的疗法是本文所述的一种。在一些方面，对象已经或将接受免疫疗法。在一些方面，该方法还包括施用免疫疗法。在一个特定的方面，免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂可以是抗PD-1单克隆抗体或抗CTLA-4单克隆抗体。本文描述了在本公开的方面可以被抑制的其他示例性免疫检查点蛋白。在一些方面，免疫检查点抑制剂包括纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、易普利姆玛(ipilimumab)或曲美木单抗(tremelimumab)中的一种或多于一种。在一些方面，免疫检查点疗法是单一疗法。在免疫检查点疗法的背景下，术语单一疗法是指在治疗过程中施用一种免疫检查点抑制剂。单一疗法可以是仅包含PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂中的仅一种的疗法。在一些方面，免疫检查点抑制剂疗法包括联合疗法。例如，联合治疗可以是(i)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂和(ii)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂的组合。具体的联合疗法包括那些包含抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体的疗法。本文描述了在本公开的方法和组合物中有用的其他免疫疗法。在一些方面，免疫疗法或额外的疗法在多肽之前、之后或同时施用。在一些方面，多肽或组合物被全身施用。在一些方面，多肽或组合物在肿瘤内施用。在一些方面，多肽或组合物通过本文所述的施用途径施用。在一些方面，多肽或组合物通过静脉注射施用。在一些方面，对象先前已经接受了癌症疗法的治疗。在一些方面，已确定对象对先前的治疗无反应，或者其中对象经历了对先前治疗的非特异性毒性。

在一些方面，与施用相同剂量的未掩蔽的多肽的毒性相比，包含本公开的掩蔽的细胞因子多肽的治疗的毒性降低。该减少可以是或至少可以是：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其中可推导的任何范围。

在一些方面，由本公开的掩蔽的细胞因子多肽诱导的血清IFN-γ水平显著低于由未掩蔽的细胞因子多肽诱导的血清IFN-γ水平。在一些方面，由本公开的掩蔽的细胞因子多肽诱导的血清IFN-γ水平比由未掩蔽的细胞因子多肽诱导的血清IFN-γ水平低或至少低1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其中可推导的任何范围。

在一些方面，由本公开的掩蔽的细胞因子多肽诱导的肿瘤IFN-γ水平显著低于由未掩蔽的细胞因子多肽诱导的肿瘤IFN-γ水平。在一些方面，由本公开的掩蔽的细胞因子多肽诱导的肿瘤IFN-γ水平比未掩盖的细胞因子多肽诱导的肿瘤IFN-γ水平低或至少低1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其中可推导的任何范围。

在一些方面，本公开的掩蔽的细胞因子多肽显著减小了肿瘤体积。在一些方面，在施用本公开的掩蔽的细胞因子多肽后，肿瘤体积减少或至少减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其中可推导的任何范围。在一些方面，与施用未掩蔽的细胞因子多肽后肿瘤体积的减小相比，施用掩蔽的细胞因子多肽导致肿瘤体积减小或至少减小1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其中可推导的任何范围。

本文所用的术语“细胞因子多肽”是指多肽，它是细胞因子或其受体结合结构域，并保留部分细胞因子活性。在某些方面，细胞因子多肽是细胞因子的活性片段。

当提及包含氨基酸聚合物的基因产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。

术语“对象”、“哺乳动物”和“患者”可互换使用。在一些实施方案中，对象哺乳动物。在一些实施方案中，对象为人类。在一些实施方案中，对象为小鼠、大鼠、兔、狗、驴、或实验室测试动物如果蝇、斑马鱼等。

预期方法和组合物包括本文所述的任何实施方案的排除。

当与术语“包括”结合使用时，词语“一”或“一个”的使用可以表示“一个”，但是它也与“一个或多于一个”、“至少一个”和“一个或多个”的含义一致。

短语“和/或”表示“和”或“或”。为了说明，A、B和/或C包括：单独的A，单独的B，单独的C，A和B的组合，A和C的组合，B和C的组合，或A、B和C的组合。换句话说，“和/或”作为包容性的或。

词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”都是包容性的或开放的并且不排除其他未提及的元素或方法步骤。

使用的组合物和方法可以“包含”、“主要组成为”或“组成为”本说明书通篇所公开的成分或步骤的任一个。“基本上组成为”所公开的任何成分或步骤的组合物和方法将权利要求的范围限制到具体的材料或步骤，这些材料或步骤不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征。

在治疗、诊断或生理目的或效果上下文中的任何方法也可以用“用途”权利要求语言来描述，例如本文讨论的任何化合物、组合物或试剂在实现或实施所描述的治疗、诊断或生理目的或效果中的“用途”。

一种或多于一种序列或组合物的用途可以基于本文所述的任何方法来进行。在整个本申请中讨论其他实施方案。所讨论关于本公开的一方面的任何实施方案也可以应用于本公开的其他方面，反之亦然。

预期的是本说明书中所讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。

本发明的其他目的、特征和优点将从下面的详细描述中变得明显。然而，应该理解的是，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的具体实施方案，但仅以说明的方式给出，因为根据本详细描述在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。

附图简要说明

以下附图形成本说明书的一部分，并被包含以进一步证实本发明的特定方面。通过参照一个或多于一个这些附图结合本文所提供的具体实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。

图1.掩蔽的IL-12的作用机制。

图2A至图2D.proIL 12构建体的体外表征。a，示意图说明工程proIL 12变体的设计。b，在激活的原代CD8

图3.MMP2对不同接头的切割。将含有所示接头序列的ProIL 12分子(均为相同浓度)与不同浓度的MMP2一起温育，并通过SDS-PAGE观察切割。

图4.L

图5.C3H/HeJ小鼠的体重。8周大的雌性C3H/HeJ小鼠每天皮下注射指示量的IL-12或proIL 12(均以IL-12为基础，n＝8/组)，持续8天。最后一次注射后第二天称小鼠体重。

图6A至图6F.循环和肿瘤内促炎细胞因子/趋化因子的定量。在第0天，在C57BL/6小鼠背部皮肤上接种B16F10肿瘤。在第7天，用PBS、5mg IL-12、15mg M-L

图7a至图7b.proIL 12在同系肿瘤模型中的抗肿瘤功效。a，在第0天，C57BL/6小鼠背部皮肤接种MC38肿瘤。在第7、10和13天，用PBS(n＝7)、5mg IL-12(n＝7)或15mg M-L

图8.人肿瘤匀浆对proIL 12的激活。将IL-12和proIL12稀释至50mg/mL，并在37℃下与2mg/mL的人肿瘤裂解物或ANT裂解液一起温育过夜。作为阴性对照，proIL12也仅与缓冲液一起温育。将反应混合物在培养基中进一步连续稀释，并以指定的浓度应用于预激活的小鼠CD8

图9.不可切割的掩蔽的IL-12最小化全身性IFN产生，同时维持肿瘤内IFNγ。用5μgIL-12或15μg M-(G

图10.不可切割的掩蔽的IL-12在MC38结肠癌中发挥抗肿瘤功效。在第0天，用MC38结肠癌细胞皮下接种小鼠，并在第7天、10天和13天用盐水或15μg M-(G

详细说明

细胞因子是抗肿瘤活性的关键因素，但迄今为止还没有许多细胞因子被转化到临床上。IL 12是最强的抗肿瘤细胞因子之一，但由于其高毒性，临床试验已经终止或不成功。因此，降低其毒性是将其应用于临床的重要策略。为了改善CBD-IL12疗法，将IL12受体IL12Rβ1的结构域融合到IL12上，形成IL12Rβ1-IL12。这种融合是无活性的，但是在受体形成剂和细胞因子之间包含MMP或凝血酶切割位点产生了可以在肿瘤微环境中被激活的细胞因子。发明人已经证明，IL12的免疫毒性因此降低，并且IL12Rβ1-IL12与蛋白酶敏感接头的融合保留了治疗效用。本发明人还发现，在接头中引入多切割位点(例如串联MMP、串联凝血酶和MMP-凝血酶二分体和重复体)将增加蛋白酶敏感性，并可能增加IL12Rβ1-IL12疗法的抗肿瘤功效。此外，使用与本公开的掩蔽治疗分子融合的胶原蛋白结合结构域是特别有用的，因为CBD增加了掩蔽治疗剂在肿瘤微环境中的保留，这延长了掩蔽治疗剂暴露于蛋白酶的时间，并增加了未掩蔽治疗剂的局部浓度。总之，本发明人开发了通过融合细胞因子受体和细胞因子来降低治疗剂毒性的技术。肿瘤特异性蛋白酶切割接头以激活肿瘤内的细胞因子。

Ⅰ.多肽方面

A.治疗剂和掩蔽剂

本公开的方面涉及治疗剂和掩蔽剂，掩蔽剂结合治疗剂并防止治疗剂与其靶标结合，以降低与治疗剂相关的毒性。本公开的多肽包含肿瘤相关蛋白酶切割位点，当治疗剂遇到相关蛋白酶时，该位点暴露治疗剂。由于蛋白酶在肿瘤微环境中是富集的，因此与全身施用未掩蔽的治疗剂相比，全身施用时正常组织中的活性治疗剂减少。

1.细胞因子和掩蔽多肽

在一些方面，治疗剂包含细胞因子或来自细胞因子的治疗性多肽。在某些方面，细胞因子包括细胞因子的功能活性片段。在一些方面，功能活性细胞因子片段结合并激活相应的受体。在一些方面，细胞因子包括IL12。IL12是异二聚糖基化细胞因子，由二硫键连接的p35(～35kDa)和p40(～40kDa)亚基组成。人IL12 p35序列如下所示：

人IL12 p40序列如下所示：

小鼠IL12 p35序列如下所示：

小鼠IL12 p40序列如下所示：

合适的IL12掩蔽剂包括结合至IL12并阻止IL12与其它分子如IL12R结合的多肽。示例性多肽包括来自IL12R的多肽，例如IL12Rβ1和IL12Rβ2。

小鼠IL12Rβ1由具有下列任一氨基酸序列的多肽表示：

人IL12Rβ1由具有以下氨基酸序列的多肽表示：

人IL12Rβ2由具有以下氨基酸序列的多肽表示：

小鼠IL12Rβ2由具有以下氨基酸序列的多肽表示：

在一些方面，细胞因子包括包含SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽或包含SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:6所示多肽片段的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:6的多肽或其片段至少具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导的任何范围)同一性的多肽。

在一些方面，细胞因子包括IL12多肽，掩蔽剂包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或包含由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:22表示的多肽片段的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:22的多肽或其片段至少具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导的任何范围)的多肽。

在一些方面，细胞因子包括IL-2。人IL-2序列包含

小鼠IL-2序列包含

在一些方面，IL-2的掩蔽剂包含IL-2R多肽。在一些方面，IL-2R多肽包含来自IL-2Rβ、IL-2Rα或IL-2Rγ亚基的多肽。人白细胞介素-2受体亚基包含以下氨基酸序列：

小鼠白细胞介素-2受体亚基具有以下氨基酸序列：

人类白细胞介素-2受体亚基α具有以下氨基酸序列：

小鼠白细胞介素-2受体亚基α具有以下氨基酸序列：

人类白细胞介素-2受体亚基γ具有以下氨基酸序列：

小鼠白细胞介素-2受体亚基γ具有以下氨基酸序列：

在一些方面，细胞因子包括含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的多肽，或含有由SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24表示的多肽片段的氨基酸序列的多肽，或与SEQID NO:23或SEQ ID NO:24的多肽或其片段至少具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导的任何范围)的多肽。

在一些方面，细胞因子包括IL12多肽，掩蔽剂包含SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或包含由SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:32表示的多肽片段的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:32的多肽或其片段至少具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导的任何范围)的多肽。

在一些方面，细胞因子包括IFNγ。小鼠IFNγ包含以下序列：

人类IFNγ包含以下序列：

还预期SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的IFNg包含作为第一个氨基酸的蛋氨酸。IFNγ可以是功能性片段，例如在C末端截短的片段。例如，IFNγ多肽可以是包含SEQ IDNO:25或SEQ ID NO:26的至少30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个或132个连续氨基酸的多肽。在一些方面，IFNγ多肽可以是包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的至少第1至30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131或132(或其中可推导的任何范围)位氨基酸的多肽。

在一些方面，IFNγ多肽的掩蔽剂包含来自IFNγ受体1或IFNγ受体2的多肽。人IFNγ受体1包含以下序列：

小鼠IFNγ受体1包含以下序列：

人IFNγ受体2包含以下序列：

小鼠IFNγ受体2包含以下序列：

在一些方面，细胞因子包括含有SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列的多肽，或含有由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26表示的多肽片段的氨基酸序列的多肽，或与SEQID NO:25或26的多肽或其片段至少具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导的任何范围)的多肽。

在一些方面，细胞因子包括IFNγ多肽，掩蔽剂包含SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或包含由SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36表示的多肽片段的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36的多肽或其片段至少具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导的任何范围)的多肽。

在本公开的方面，掩蔽剂可以是本文所述的多肽或多肽的功能片段。在一些方面，掩蔽剂包含结合至细胞因子的受体多肽或其片段。

2.抗体

在一些方面，治疗剂包括抗体，例如治疗性抗体。在一些方面，通过用半胱氨酸(Cys)对重链或轻链可变区中的氨基酸进行位点特异性置换来修饰治疗性抗体。被置换的Cys侧链中的巯基(SH)基团作为化学手柄，用于连接干扰抗体与其抗原结合能力的掩蔽剂。掩蔽剂可以是在空间上抑制抗体-抗原结合，但不与抗体或抗原特异性相互作用的基团。

或者，掩蔽剂可以与抗体相互作用，例如通过静电力或范德华力。肿瘤相关蛋白酶切割位点可以在掩蔽剂和抗体之间或连接它们。

在一些方面，掩蔽剂在通过切割肿瘤相关蛋白酶切割位点而释放后，可具有其自身的药理学活性。选择Cys置换位点，使得用Cys置换原始氨基酸不会不利地影响抗体特异性和强结合其抗原的能力。此外，去除掩蔽剂会留下仍然共价连接到Cys上的残余化学基团。

一方面，提供了根据式(I)的前药抗体：

(M-L)

其中Ab是其重链或轻链可变区中至少一个氨基酸被Cys置换的抗体，其中被置换的氨基酸(a)在框架区中；(b)至少具有30％的侧链暴露，并且(c)距离CDR氨基酸在10埃以内，优选5埃；M是抑制Ab与其抗原结合的掩蔽剂；每个L独立地是与M和Ab结合的接头部分，L包含肿瘤相关的切割位点并在前述Cys处与Ab结合；并且m是1、2、3或4。

在一些方面，抗体Ab中至少一个被置换的氨基位于重链可变区的Kabat系统第1、3、5、19、23、25、43、46、68、72、74、75、76、82a、82b、83、84、85或105位，或者位于轻链可变区的Kabat系统第1、3、5、7、8、18、20、45、57、60、63、65、66、67、69、77或100位。在一些方面，抗体Ab中至少一个被置换的氨基酸位于重链的Kabat系统第23位或轻链的Kabat系统第67位。在一些方面，提供了在轻链的Kabat系统第67位具有Cys的抗体。抗体可以是抗CTLA4抗体或抗CD137抗体。在一些方面，提供了在重链的Kabat系统第23位具有Cys的抗体。抗体可以是抗CTLA4抗体或抗CD137抗体。

本公开的掩蔽治疗性抗体可以是多克隆的、单克隆的、小鼠的、人的、人源化的或嵌合的。重链和轻链可变区中适合用Cys置换的氨基酸是骨架氨基酸，其侧链暴露在溶剂中，优选至少30％暴露在溶剂中，以便被置换的Cys易于连接掩蔽剂。同样重要的是，被置换的氨基酸靠近CDR氨基酸，以便掩蔽剂可以有效地干扰抗体-抗原结合。优选的距离不超过10A，更优选不超过5A。Cys置换的优选位置包括重链可变区的第23位和轻链可变区的第67位，按照Kabat编号。两个位置都在各自可变区的框架区内。通过本领域众所周知的位点特异性置换技术，可以将Cys置换到这些位置上。第一个位点的置换可以用简写法称为VLX67C，其中X表示被置换的氨基酸。在天然抗体中，这个位点是高度保守的，并且经常为Ser。第二个位点的置换可以类似地称为VH X23C。

本公开的掩蔽抗体可以在VH区或VL区或两者都有置换。如果抗体仅具有这些置换中的一个，则可以连接的封闭部分-接头化合物的理论最大数量是两个，尽管掩蔽的抗体剂可能在统计学上测定更低的数量，这反映了连接过程中的化学低效。如果抗体具有两种置换，理论上最大数量是4。

在一些方面，抗体是双特异性抗体，其具有两对不同的重链和轻链。因此，本公开的掩蔽抗体可以是双特异性抗体，其中仅一个重/轻链对被掩蔽，或者其中两个重/轻链对都被掩蔽。用Cys置换VH或VL区域中的氨基酸，以引入可通过马来酰亚胺加成化学进行缀合的巯基侧链，从而制备抗体-药物缀合物，这也是已知的。例如，参见Eigenbrot等人，2007年和Bhakta等人，2016年)。

可用于干扰或阻断被掩蔽抗体与其抗原的活性的掩蔽剂包括：聚乙二醇(PEG)、白蛋白结合多肽、附着蛋白、肽和可溶性球状蛋白如白蛋白或纤维蛋白原。在一些方面，阻断剂包含分子量至少约为2kDa的PEG，其中2kDa对应于具有约45-(CH2CH2O)-重复单元的PEG，优选分子量至少约为5kDa的PEG，其中5kDa对应于具有约115-(CH2CH2O)-重复单元的PEG。

如本领域已知的，通过Cys巯基(SH)的迈克尔加成，具有本文所述Cys的抗体可以与具有马来酰亚胺端基的掩蔽剂缀合。这种缀合的程序是本领域众所周知的；参见例如Shepard等人的WO 2017/112624 A1(2017)，其通过引用并入本文。WO2019036433中公开了用于治疗性抗体的特异性掩蔽剂的其它实例，其通过引用并入本文。

在其它方面，治疗剂可以是抗体，其中可变区被可变区链的N-末端与形成卷曲螺旋的肽的连接所掩盖。形成卷曲螺旋的肽彼此结合形成卷曲螺旋(即，各自的肽各自形成螺旋，并且这些螺旋彼此缠绕)。卷曲螺旋可以在空间上抑制抗体结合位点与其靶的结合。在一些方面，该抗体包括二价抗体。形成卷曲螺旋的肽之间的非共价结合足以形成抑制抗体可变区结合的稳定卷曲螺旋；例如，形成卷曲螺旋的肽不必通过各自肽的末端半胱氨酸之间的二硫键进一步连接。非天然存在的半胱氨酸的存在可能是不利的，因为它们会导致错误折叠或错误结合的问题。通过这种形式掩蔽抗体可以将结合亲和力(以及在ADC的情况下的细胞毒性活性)降低至小于百分之一。抗体可以以这种形式被掩蔽，而在暴露时不会显著损害表达、纯化、缀合、药代动力学或结合或其他活性。

在一些方面，掩蔽剂包括卷曲螺旋。形成卷曲螺旋的肽是可以相互结合形成卷曲螺旋的肽对。“卷曲螺旋”是一个技术术语，指的是缠绕成超螺旋结构的α-螺旋束。亮氨酸拉链形成肽是结合形成卷曲螺旋的肽的一个实例。在本公开中形成的卷曲螺旋通常由两个形成卷曲螺旋的肽形成。卷曲螺旋可以与肽上平行或相反方向的α螺旋一起形成。卷曲螺旋的进一步特征在于氨基酸侧链在束核中的折叠，称为杵臼(knobs-into-holes)，其中来自一个螺旋(杵)的残基折叠到被面对的螺旋(臼)的四个侧链包围的空间中。参与杵臼相互作用的残基通常是疏水的，而外部残基是亲水的，因此卷曲螺旋的序列在侧链的化学性质中显示出“七肽”重复。WO2011034605提供了形成卷曲螺旋的肽中七肽重复的共有公式的实例，其通过引用并入本文。

在一些方面，卷曲螺旋包括式II：

(XI，X2，X3，X4，X5，X6，X7)n II

其中XI是疏水性氨基酸或天冬酰胺；X2、X3和X6是任何氨基酸；X4是疏水性氨基酸；X5和X7各自是带电荷的氨基酸残基。

卷曲螺旋的实例包括：

形成卷曲螺旋的肽通过包括肿瘤相关蛋白酶切割位点的接头连接到抗体可变区的N-末端。典型的抗体包括重链和轻链可变区，在这种情况下，形成卷曲螺旋的肽连接到各自的N-末端。二价抗体有两个结合位点，可以相同也可以不同。在正常的单特异性抗体中，结合位点是相同的，并且抗体具有两个相同的轻链和重链对。在这种情况下，每条重链连接到相同的形成卷曲螺旋的肽，每条轻链连接到相同的形成卷曲螺旋的肽(其可以与连接到重链的肽相同或不同)。

在双特异性抗体中，结合位点是不同的，由两对不同的重链和轻链形成。结合位点可以对不同的靶标或同一靶标上的不同表位具有特异性。如果结合位点对不同的靶标具有特异性，则靶标可以在同一细胞上(例如癌细胞上的两种不同的表面抗原)或两种不同的细胞上(例如癌细胞上的一种表面抗原和免疫细胞如T细胞上的一种表面抗原)。例如，双特异性抗体的一个结合位点可以针对CD3或4-1BB。

在双特异性抗体中，一个结合位点的重链和轻链可变区可以分别连接到形成卷曲螺旋的肽。其他结合位点的重链和轻链可变区也可以或也可以不与形成卷曲螺旋的肽连接。如果两个结合位点的重轻对都与形成卷曲螺旋的肽连接，那么通常两个重链可变区都与相同类型的形成卷曲螺旋的肽连接，两个轻链可变区也是如此。例如，如果两个结合位点都对同一肿瘤上的表面抗原具有特异性，则掩蔽两个结合位点可能是有用的。例如，当一个结合位点对肿瘤表面抗原具有特异性，而另一个结合位点对免疫细胞上的表面抗原具有特异性时，掩蔽一个结合位点而不是两个结合位点可能是有用的。对肿瘤表面抗原或免疫细胞抗原具有特异性的结合位点可以被掩蔽。一些对肿瘤表面抗原和免疫细胞都具有特异性的双特异性抗体掩蔽了两个位点。

卷曲螺旋可以由形成同二聚体的相同肽或形成异二聚体的两种不同肽形成。为了形成同二聚体，轻链和重链抗体被连接到相同的形成卷曲螺旋的肽上。为了形成异二聚体，轻链和重链抗体与不同的形成卷曲螺旋的肽相连。对于一些形成卷曲螺旋的肽对，优选的是其中一对中的一个与抗体的重链连接，另一个与抗体的轻链连接，尽管反方向也是可能的。

每个抗体链可以连接到单个形成卷曲螺旋的肽或串联的多个这样的肽(例如，两个、三个、四个或五个肽)。如果是后者，串联连接的肽通常是相同的。此外，如果采用串联连接，轻链和重链通常连接到相同数量的肽上。

抗体链与形成卷曲螺旋的肽的连接可降低抗体的结合亲和力，例如，相对于没有这种连接或切割这种连接后的相同抗体，降低到至多1/10、1/50、1/100、1/200、1/500、1/1000、1/1500、1/2000、1/4000、1/5000或1/10000。在一些这样的抗体中，结合亲和力降低了1/50至1/10000、1/50至1/5000、1/50至1/4000、1/50至1/1000、1/100至1/10000、1/100至1/5000、1/100至1/4000、1/200至1/10000、1/200至1/5000、1/50至1/1500、1/100至1/1500、1/200至1/1500、1/200至1/1000、1/500至1/1500、1/50至1/1000、1/100至1/1000、1/200至1/1000、1/500至1/1000、1/50至1/500、1/100至1/500。

抗体包括非人的、人源化的、人的、嵌合的和镶嵌化的抗体(veneeredantibodies)、纳米体、dAb、scFV'、Fab等。一些这样的抗体包含对癌细胞抗原的免疫特异性，优选在细胞表面上的一种，其可在抗体结合时内在化于细胞内。抗体可针对的靶标包括癌细胞上的受体及其配体或反受体(例如，CD3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、CD123、Her-2、EphA2、淋巴细胞相关抗原1、VEGF或VEGFR、CTLA-4、LIV-1、黏连蛋白-4、CD74和SLTRK-6)。

在一些方面，抗体包括维布妥昔单抗或本妥昔单抗、抗CD30、阿仑单抗、抗CD52、利妥昔单抗、抗CD20、曲妥珠单抗Her/neu、尼妥珠单抗、西妥昔单抗、抗EGFR、贝伐单抗、抗VEGF、帕利珠单抗、抗RSV、阿昔单抗、GpIIb/IIIa、英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗TNF-α、巴利昔单抗(baciliximab)、达克利珠单抗、抗IL-2、奥马珠单抗、抗IgE、吉妥珠单抗或伐达妥昔单抗、抗CD33、那他珠单抗、抗VLA-4、维多珠单抗α4β7、贝利尤单抗、抗BAFF、奥昔组单抗、替普利珠单抗、抗CD3、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、依帕珠单抗、抗CD22、阿仑珠单抗(alemtuzumumab)、依库丽单抗、卡那单抗、美泊利单抗、瑞利珠单抗、托珠单抗、乌司奴单抗和布雷奴单抗(briakinumab)。

在WO2018107125中描述了其它方面，其通过引用并入本文。

B.胶原蛋白结合结构域

胶原蛋白是细胞外基质(ECM)蛋白，其可调节多种细胞生物学功能如正常组织和肿瘤组织中的增殖、分化和黏附(Ricard-Blum，Cold Spring Harb Perspect Biol 3:a004978，2011)。胶原蛋白是哺乳动物体内最丰富的蛋白质，几乎存在于28种异构体中的一种或多于一种的所有组织中(Ricard-Blum，Cold Spring Harb Perspect Biol 3:a004978，2011)。血管内皮下空间富含胶原蛋白。由于其在生理条件下的不溶性，因此在血液中几乎不存在胶原蛋白(Dubois等人，Blood 107：3902-06，2006；Bergmeier和Hynes，ColdSpring Harb Perspect Biol4:a005132，2012)。据报道，由于异常的结构，肿瘤脉管系统是可渗透的(Nagy等人，British journal of cancer 100:865，2009)。因此，由于血管渗漏，胶原蛋白暴露在肿瘤中(Liang等人，Journal of controlled release 209:101-109，2015；Liang等人，Sci Rep 6:18205，2016；Yasunaga等人，Bioconjugate chemistry 22:1776-83，2011；Xu等人The Journal of cell biology 154:1069-80，2001；Swartz和Lund，Nat Rev Cancer 12:210-19)。此外，与正常组织相比，肿瘤组织包含增加量的胶原蛋白(周等人，J Cancer 8:1466-76，2017；ProvenzaNO等人，BMC Med 6:11，2008)。

血管性假血友病因子(vWF)作为凝血因子，可与I型和III型胶原蛋白以及血小板上的黏附受体GPIb结合(Lenting等人，Journal of thrombosis and haemostasis:JTH10:2428-37，2012；Shahidi Advances in experimental medicine and biology 906:285-306，2017)。受伤时，内皮细胞下方的胶原蛋白暴露于血浆中，vWF-胶原蛋白结合引发血栓形成级联反应(Shahidi Advances in experimental medicine and biology 906:285-306，2017；Wu等人Blood 99:3623-28，2002)。在报道的非细菌来源的蛋白质/肽中，vWFA结构域对胶原蛋白的亲和力最高(Addi等人，Tissue Engineering Part B:Reviews，2016)。特别是在A结构域内，vWF的A3结构域已被报告为胶原蛋白结合结构域(CBD)(Ribba等人Thrombosis and haemostasis 86:848-54，2001)。如上所述，本发明人认为，具有vWFA3 CBD的融合蛋白可以实现靶向细胞因子免疫治疗，即使当由于胶原蛋白通过渗漏的肿瘤脉管系统暴露而被全身注射时，也可实现。

在一些方面，胶原蛋白结合结构域包含来自核心蛋白聚糖的多肽。示例性核心蛋白聚糖多肽包括人核心蛋白聚糖或其片段，其由以下序列表示：

源自人类核心蛋白聚糖的肽：LRELHLDNNC(SEQ ID NO:41)，和源自牛核心蛋白聚糖的肽：LRELHLNNNC(SEQ ID NO:44)。

在一些方面，CBD包含来自vWF的多肽片段。在一些方面，CBD包含源自人序列的vWFA1、第1237至1458位残基(成熟vWF的第474至695位)或其片段，其由以下氨基酸序列表示：

在一些方面，CBP包含vWF A3的全部或片段，其由以下氨基酸序列表示：

在一些方面，CBP包含具有6H标签的vWF A3结构域多肽(SEQ ID NO:87)，其具有以下氨基酸序列：

在一些方面，CBP包含来自血管性假血友病因子(vWF)的肽或多肽，例如来自vWF的胶原蛋白结合肽。人类vWF的序列包含：

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在一些方面，肽来自vWF A3结构域，并具有以下氨基酸序列(或其片段)：

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CBP肽或多肽可以是与如上所述的CBD肽或肽片段具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导的任何范围)的肽，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:44至SEQ ID NO:46。

C.接头

在一些方面，多肽包含或还包含接头。接头可以在多肽的任何两个结构域之间。在一些方面，多肽包含CBP和细胞因子之间的接头。在一些方面，多肽包含位于CBP和血清多肽之间的接头。在一些方面，多肽包含位于掩蔽剂和细胞因子之间的接头。在一些方面，多肽包含白蛋白和细胞因子之间的接头。在一些方面，多肽包含治疗剂和掩蔽剂之间的接头。在一些方面，多肽包含位于治疗剂和CBP之间的接头。在一些方面，接头包含一个或多于一个肿瘤相关蛋白酶切割位点。肿瘤相关蛋白酶切割位点是指由在肿瘤微环境中高度上调或富集的蛋白酶识别的切割位点。虽然肿瘤相关蛋白酶切割位点可能不是肿瘤特异性的，这意味着该蛋白酶仅在肿瘤中表达，但它是肿瘤富集的，这意味着该蛋白酶在肿瘤微环境中的表达水平高于正常组织或大多数正常组织。在一些方面，肿瘤相关蛋白酶切割位点包含被基质金属蛋白酶识别和切割的氨基酸序列。例如，肿瘤相关蛋白酶切割位点可以是被MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP18、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28或其组合切割的位点。在一些方面，肿瘤相关蛋白酶切割位点包含SEQ ID NO:13的MMP-反应序列：GLLSGRSDNH。在一些方面，肿瘤相关蛋白酶切割位点可以是被凝血酶切割的位点。在一些方面，凝血酶反应性序列包含SEQ ID NO:14:LVPRGS。

在一些方面，两种多肽如CBP、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂和细胞因子中的两种可以通过双功能接头连接。可以在肽和/或抗体序列之间插入接头，例如氨基酸或肽模拟序列。在一个方面，在重(H)链或轻(L)链的氨基(NH

在一些方面，接头包含一种或多于一种多肽，与健康组织或器官相比，多肽可被在癌症或肿瘤微环境中独特表达或过表达的酶(蛋白酶)切割，即作为该酶的底物。优选地，该酶存在于肿瘤的细胞外环境中。这种蛋白酶的实例包括：天冬氨酸蛋白酶(如肾素)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、天冬氨酸组织蛋白酶(如组织蛋白酶D、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2等)、半胱氨酸组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B)、半胱氨酸蛋白酶(例如，豆荚蛋白)、去整合素/金属蛋白酶(ADAM，例如，ADAM8、ADAM9)、具有凝血酶敏感蛋白基序的去整合素/金属蛋白酶(ADAMTS，例如ADAMTSl)、整合膜丝氨酸蛋白酶(例如，基质酶2、MT-SPl/基质酶、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4)、激肽释放酶相关的肽酶(KLK，例如KLK4、KLK5)、基质金属蛋白酶(如MMP-1、MMP-2、MMP-9)和丝氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶A、凝血因子蛋白酶如弹性蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、PSA、uPA、Vila因子、Xa因子和HCV NS3/4)。优选地，蛋白酶是成纤维细胞激活蛋白(FAP)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA、尿激酶)、MT-SPl/基质蛋白酶、豆荚蛋白或基质金属蛋白酶(尤其是MMP-1、MMP-2和MMP-9)。本领域技术人员将理解，酶和相应的可切割肽的选择将取决于待治疗的疾病和受影响的组织或器官表达的蛋白酶。

肿瘤相关蛋白酶位点的其他实例包括被尿激酶、基质酶或豆荚蛋白切割的LSGRSDNH(SEQ ID NO:49)；VPLSLYS(SEQ ID NO:50)，被MMP2或MMP9切割；PLGLAG(SEQ IDNO:51)，被MMP2切割；VLVPMAMMAS(SEQ ID NO:52)，被MMP1切割；XXQARAX(SEQ ID NO:53)，其中X是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸，由基质酶切割；和XXQARVX(SEQ ID NO:249)，其中X是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸，由基质酶切割；AGPR(SEQID NO:54)，由基质酶切割；AANL(SEQ ID NO:55)和PTNL(SEQ ID NO:56)，由豆荚蛋白切割；和TSGRSANP(SEQ ID NO:57)。

接头序列可以包含在本发明的多肽中。例如，至少具有、至多或恰好3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或多于100个氨基酸(或其中可推导的任何范围)的接头可以分开或位于CBP、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂和细胞因子中的任何两个之间。

接头可包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:57的序列或与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:57至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导的任何范围)的肽。

肿瘤相关蛋白酶位点的其他实例包括下表中的那些：

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D.血清蛋白质

在一些方面，本公开的多肽还与血清蛋白连接。血清蛋白包括例如白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原。球蛋白包括α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。白蛋白可以是小鼠、人、牛或任何其他同源白蛋白。在一些方面，白蛋白包括人血清白蛋白，其由ALB基因编码，并由以下氨基酸序列举例说明：

在一些方面，白蛋白包括具有以下序列的小鼠白蛋白：

在一些方面，血清蛋白包含SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的多肽或其片段，或与SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导的任何范围)的多肽或其片段。

E.多肽方面

具体的多肽方面举例如下：

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在一些方面，该多肽与本公开的多肽例如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:15至SEQ ID NO:18或其片段至少具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导的任何范围)的同一性。

F.蛋白质标签

在一些方面，多肽还包含蛋白质标签。例如，蛋白质标签可用于蛋白质纯化和/或免疫测定。示例性的蛋白质标签包括Avi标签，允许通过酶BirA进行生物素化的肽，因此该蛋白质可以通过链霉亲和素(GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:82))；钙调蛋白标签，由蛋白质钙调蛋白(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL(SEQ ID NO:83))结合的肽；聚谷氨酸盐标签，有效结合到阴离子交换树脂的肽，例如Mono-Q(EEEEEE(SEQ ID NO:84))；E-标签，被抗体(GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:102))识别的肽；FLAG标签，被抗体(DYKDDDDK(SEQ ID NO:85))识别的肽；HA标签是血凝素中的肽，可被抗体(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:86))识别；His标签，5个至10个组氨酸(HHHHHH-SEQ ID NO:193)结合镍或钴螯合物(HHHHHH(SEQ ID NO:87))；Myc标签，由抗体(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:88))识别的来自c-myc的肽；NE标签，由单克隆IgG1抗体识别的新的18-氨基酸合成肽(TKENPRSNQEESYDDNES(SEQ ID NO:89))，其可用于广泛的应用，包括蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术、免疫细胞化学、免疫沉淀和重组蛋白的亲和纯化；S标签，衍生自核糖核酸酶A的肽(KETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO:90))；SBP标签，结合链霉抗生物素蛋白的肽(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP(SEQ ID NO:91))；Sof标签1，用于哺乳动物表达(SLAELLNAGLGGS(SEQ ID NO:92))；Sof标签3，用于原核表达(TQDPSRVG(SEQ ID NO:93))；Strep标签，与链霉亲和素或被称为链霉素的改性链霉亲和素结合的肽(Strep标签II:WSHPQFEK(SEQ ID NO:94))；TC标签，被FlAsH和ReAsH双砷化合物识别的四半胱氨酸标签(CCPGCC(SEQ ID NO:95))；V5标签，被抗体(GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:96))识别的肽；VSV标签，被抗体(YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:97))识别的肽；Xpress标签(DLYDDDDK(SEQ ID NO:98))；共价肽标签；Isopep标签，与pilin-C蛋白(TDKDMTITFTNKKDAE(SEQ ID NO:99))共价结合的肽；Spy标签，与SpyCatcher蛋白(AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:100))共价结合的肽，Snoop标签，与SnoopCatcher蛋白(KLGDIEFIKVNK(SEQ ID NO:101))共价结合的肽；BCCP(生物素羧基载体蛋白)，被BirA生物素化的蛋白结构域，能够被链霉亲和素识别；谷胱甘肽-S-转移酶-标签，与固定的谷胱甘肽结合的蛋白；绿色荧光蛋白-标签，自发荧光并可被纳米抗体结合的蛋白；Halo标签，突变的细菌卤代烷脱卤酶，其共价附着在活性卤代烷底物上，这使得它可以附着在各种各样的底物上；麦芽糖结合蛋白-标签，与直链淀粉琼脂糖结合的蛋白质；Nus-标签；硫氧还蛋白-标签；Fc-标签，源自免疫球蛋白Fc结构域，允许二聚化和增溶。可用于在蛋白-A琼脂糖凝胶上纯化，设计含有促进紊乱氨基酸(P、E、S、T、A、Q、G)的固有紊乱标签和Ty标签。在一些方面，多肽包含SEQ ID NO:87的6H标签。

Ⅱ.蛋白质的组合物

本公开的多肽或多核苷酸，例如CBD、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂、接头或细胞因子多肽，可以包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个或多于50个变体氨基酸或核酸取代，或者与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249的至少或至多3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、300个、400个、500个、550个、1000个或多于1000个或其中可推导的任何范围的连续氨基酸或核酸具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似性、同一性或同源性。

本公开的多肽，例如CBD、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂、接头或细胞因子多肽，可以包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、300个、400个、500个、550个、1000个或多于1000个或其中可推导的任何范围的连续氨基酸。

在一些方面，本公开的多肽可包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249的1个至2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个、400个、401个、402个、403个、404个、405个、406个、407个、408个、409个、410个、411个、412个、413个、414个、415个、416个、417个、418个、419个、420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、453个、454个、455个、456个、457个、458个、459个、460个、461个、462个、463个、464个、465个、466个、467个、468个、469个、470个、471个、472个、473个、474个、475个、476个、477个、478个、479个、480个、481个、482个、483个、484个、485个、486个、487个、488个、489个、490个、491个、492个、493个、494个、495个、496个、497个、498个、499个、500个、501个、502个、503个、504个、505个、506个、507个、508个、509个、510个、511个、512个、513个、514个、515个、516个、517个、518个、519个、520个、521个、522个、523个、524个、525个、526个、527个、528个、529个、530个、531个、532个、533个、534个、535个、536个、537个、538个、539个、540个、541个、542个、543个、544个、545个、546个、547个、548个、549个、550个、551个、552个、553个、554个、555个、556个、557个、558个、559个、560个、561个、562个、563个、564个、565个、566个、567个、568个、569个、570个、571个、572个、573个、574个、575个、576个、577个、578个、579个、580个、581个、582个、583个、584个、585个、586个、587个、588个、589个、590个、591个、592个、593个、594个、595个、596个、597个、598个、599个、600个、601个、602个、603个、604个、605个、606个、607个、608个、609个、610个、611个、612个、613个、614个或615个(或其中可推导的任何范围)氨基酸。

在一些方面，本公开的多肽，例如CBD、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂、接头或细胞因子多肽，可以包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249的至少、至多、约或恰好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个、400个、401个、402个、403个、404个、405个、406个、407个、408个、409个、410个、411个、412个、413个、414个、415个、416个、417个、418个、419个、420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、453个、454个、455个、456个、457个、458个、459个、460个、461个、462个、463个、464个、465个、466个、467个、468个、469个、470个、471个、472个、473个、474个、475个、476个、477个、478个、479个、480个、481个、482个、483个、484个、485个、486个、487个、488个、489个、490个、491个、492个、493个、494个、495个、496个、497个、498个、499个、500个、501个、502个、503个、504个、505个、506个、507个、508个、509个、510个、511个、512个、513个、514个、515个、516个、517个、518个、519个、520个、521个、522个、523个、524个、525个、526个、527个、528个、529个、530个、531个、532个、533个、534个、535个、536个、537个、538个、539个、540个、541个、542个、543个、544个、545个、546个、547个、548个、549个、550个、551个、552个、553个、554个、555个、556个、557个、558个、559个、560个、561个、562个、563个、564个、565个、566个、567个、568个、569个、570个、571个、572个、573个、574个、575个、576个、577个、578个、579个、580个、581个、582个、583个、584个、585个、586个、587个、588个、589个、590个、591个、592个、593个、594个、595个、596个、597个、598个、599个、600个、601个、602个、603个、604个、605个、606个、607个、608个、609个、610个、611个、612个、613个、614个或615个(或其中可推导的任何范围)连续氨基酸。

在一些方面，多肽，例如CBD、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂、接头或细胞因子多肽，可以包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249的至少、至多、约或恰好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个、400个、401个、402个、403个、404个、405个、406个、407个、408个、409个、410个、411个、412个、413个、414个、415个、416个、417个、418个、419个、420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、453个、454个、455个、456个、457个、458个、459个、460个、461个、462个、463个、464个、465个、466个、467个、468个、469个、470个、471个、472个、473个、474个、475个、476个、477个、478个、479个、480个、481个、482个、483个、484个、485个、486个、487个、488个、489个、490个、491个、492个、493个、494个、495个、496个、497个、498个、499个、500个、501个、502个、503个、504个、505个、506个、507个、508个、509个、510个、511个、512个、513个、514个、515个、516个、517个、518个、519个、520个、521个、522个、523个、524个、525个、526个、527个、528个、529个、530个、531个、532个、533个、534个、535个、536个、537个、538个、539个、540个、541个、542个、543个、544个、545个、546个、547个、548个、549个、550个、551个、552个、553个、554个、555个、556个、557个、558个、559个、560个、561个、562个、563个、564个、565个、566个、567个、568个、569个、570个、571个、572个、573个、574个、575个、576个、577个、578个、579个、580个、581个、582个、583个、584个、585个、586个、587个、588个、589个、590个、591个、592个、593个、594个、595个、596个、597个、598个、599个、600个、601个、602个、603个、604个、605个、606个、607个、608个、609个、610个、611个、612个、613个、614个或615个(或其中可推导的任何范围)连续氨基酸，其与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249之一至少、至多或约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％，、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似、相同或同源。

本公开的多肽，例如CBD、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂、接头或细胞因子多肽，可以与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249之一至少、至多或约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％，、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导的任何范围)相似、相同或同源。

本公开的多肽和核酸可以包含至少、至多、约或恰好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个、400个、401个、402个、403个、404个、405个、406个、407个、408个、409个、410个、411个、412个、413个、414个、415个、416个、417个、418个、419个、420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、453个、454个、455个、456个、457个、458个、459个、460个、461个、462个、463个、464个、465个、466个、467个、468个、469个、470个、471个、472个、473个、474个、475个、476个、477个、478个、479个、480个、481个、482个、483个、484个、485个、486个、487个、488个、489个、490个、491个、492个、493个、494个、495个、496个、497个、498个、499个、500个、501个、502个、503个、504个、505个、506个、507个、508个、509个、510个、511个、512个、513个、514个、515个、516个、517个、518个、519个、520个、521个、522个、523个、524个、525个、526个、527个、528个、529个、530个、531个、532个、533个、534个、535个、536个、537个、538个、539个、540个、541个、542个、543个、544个、545个、546个、547个、548个、549个、550个、551个、552个、553个、554个、555个、556个、557个、558个、559个、560个、561个、562个、563个、564个、565个、566个、567个、568个、569个、570个、571个、572个、573个、574个、575个、576个、577个、578个、579个、580个、581个、582个、583个、584个、585个、586个、587个、588个、589个、590个、591个、592个、593个、594个、595个、596个、597个、598个、599个、600个、601个、602个、603个、604个、605个、606个、607个、608个、609个、610个、611个、612个、613个、614个或615个置换(或其中可推导的任何范围)。

该置换可以在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249之一的氨基酸第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615位。这些置换中的一个或多于一个可能被明确排除在方面之外。

本公开的肽、多肽和蛋白质，例如CBD、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂、接头或细胞因子多肽，与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249中的任何一个至少具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同一性，包含起始于氨基酸第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200(或其中可推导的任何范围)位并终止于氨基酸第10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205(或其中可推导的任何范围)位的部分的片段。

在一些方面，SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:249之一的肽或多肽第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399或400位的氨基酸被丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸置换。

置换的变体一般含有在蛋白质内一个或多于一个位点处一个氨基酸与另一个的交换，并可以设计为调整多肽的一种或多于一种性质，具有或没有其他功能或性质的损失。置换可以是保守性的，即一个氨基酸用一个相似形状和电荷的氨基酸取代。保守性置换在本领域是众所周知的，包括例如以下的变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸盐到谷氨酸盐；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸盐到天冬氨酸盐；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬氨酸或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；蛋氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。或者，置换可以是非保守性的，使得影响多肽的功能或活性。非保守性的改变一般涉及用化学上不同的残基来置换残基，例如用极性或带电荷的氨基酸置换非极性的或不带电荷的氨基酸，反之亦然。这些置换中的一个或多于一个可以被明确排除在方面之外。

蛋白质可以是重组的，也可以是体外合成的。或者，可以从细菌中分离出非重组蛋白或重组蛋白。还预期含有这种变体的细菌可以在组合物和方法中实现。因此，蛋白质不需要进行分离。

术语“功能等价的密码子”在本文中用来指对相同氨基酸编码的密码子，例如用于精氨酸或丝氨酸的六个密码子，还指对生物等价的氨基酸编码的密码子。

还应理解氨基酸和核酸序列可以包含额外的残基，例如分别包含额外的N端或C端氨基酸，或5'或3'序列，但仍基本上如前所述在本文所公开的序列之一中，只要序列符合上述标准，当涉及蛋白表达时包括生物蛋白活性的维持。末端序列的添加特别地应用于例如可以包含在编码区的5'部分或3'部分的侧翼的各种非编码序列的核酸序列。

以下是基于改变蛋白质的氨基酸以创造等价的或甚至改善的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可以取置换蛋白质结构中的其他氨基酸，而不会明显丧失相互结合能力。诸如酶催化结构域或相互作用组分的结构可以使氨基酸被置换以保持这种功能。因为正是蛋白质的相互作用的能力和本性限定蛋白质的生物功能活性，所以一些氨基酸置换可以在蛋白质序列中和在其底层的DNA编码序列中完成，仍然产生具有相似性质的蛋白质。因此本发明人预期，各种变化可以在基因的DNA序列中完成，而没有可观察到的其生物功效或活性的损失。

在其他方面，通过引入一个或多于一个置换来改变多肽的功能。例如，某些氨基酸可以置换蛋白质结构中的其他氨基酸，以修饰相互作用组分的相互作用结合能力。诸如蛋白质相互作用结构域、核酸相互作用结构域和催化位点的结构可以使氨基酸被置换以改变这种功能。因为正是蛋白质的相互作用的能力和本性限定蛋白质的生物功能活性，所以一些氨基酸置换可以在蛋白质序列中和在其底层的DNA编码序列中完成，仍然产生具有相似性质的蛋白质。因此本发明人预期在基因的DNA序列中可以进行各种变化，从而明显改变其生物效用或活性。

在进行这类变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数。在本领域中普遍地理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。接受氨基酸的相对亲水特性对生成的蛋白质的二级结构起作用，二级结构反过来限定蛋白质与其他分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。

在本领域中还理解相似氨基酸的置换以基于亲水性有效地完成。通过引用并入本文的美国专利4554101说明蛋白质的最大局部平均亲水性，如由其邻近的氨基酸的亲水性决定的，与蛋白质的生物学性质相关。应理解氨基酸可以置换为具有相似亲水性值的另一个氨基酸，并仍生产生物学上等价且免疫学上等价的蛋白质。

如以上所概述的，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链置换基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特性的示例性置换是众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

在特定方面，本文所述的全部或部分蛋白质也可以按照常规技术在溶液中或在固体载体上合成。各种自动的合成器是市场上可购得的，并可以根据已知的方案来使用。参见例如Stewart和Young，(1984)；Tam等人，(1983)；Merrifield，(1986)；以及Barany和Merrifield(1979)，每一个都通过引用并入本文。或者，可以采用重组DNA技术，其中对肽或多肽编码的核苷酸序列插入到表达载体中，转化或转染为合适的宿主细胞，并在适合于表达的条件下培养。

一个方面包括使用基因转移到细胞，包括微生物，以生产和/或呈现蛋白质。感兴趣的蛋白质的基因可以转移到合适的宿主细胞中，然后在合适的条件下培养细胞。可以采用实际上对任何多肽编码的核酸。在本文中讨论重组表达载体的产生和其中包含的元件。或者，待生产的蛋白质可以是通常由细胞合成用于蛋白质生产的内源性蛋白质。

Ⅲ.核酸

在某些方面，本公开涉及编码本发明的蛋白质、多肽和肽的重组多核苷酸，例如CBD、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂、接头或细胞因子多肽和/或其他分子。因此，某些方面涉及编码CBD、血清蛋白、治疗剂、掩蔽剂、接头或细胞因子多肽及其片段的核苷酸。

如在本申请中所使用的，术语“多核苷酸”指的是重组的或已经从总的基因组核酸中分离的核酸分子。包括在术语“多核苷酸”内的是寡核苷酸(在长度上具有100个或少于100个的残基的核酸)，重组的载体，包括例如质粒、黏粒、噬菌体、病毒等。在特定方面，多核苷酸包括基本上从其天然存在的基因或蛋白编码序列中分离出来的调控序列。多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，并可以是RNA、DNA(基因组DNA、cDNA或合成DNA)、其类似物或其组合。其他编码或非编码序列可以但是不必存在于多核苷酸内。

在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用来指编码蛋白质、多肽或肽(包括适当转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)的核酸。如本领域技术人员所理解的，该术语包括基因组序列、表达盒、cDNA序列和较小的工程化核酸区段，其表达或可以适合于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体。对多肽的全部或部分编码的核酸可以含有以下连续核酸序列：编码本文描述或引用的一个或多于一个氨基酸序列的多核苷酸的10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、441个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个、1010个、1020个、1030个、1040个、1050个、1060个、1070个、1080个、1090个、1095个、1100个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、5500个、6000个、6500个、7000个、7500个、8000个、9000个、10000个或多于10000个核苷酸、核苷或碱基对(或其中可推导的任何范围)，包括其间的所有值和范围。还考虑了特定多肽可由含有变体的核酸编码，变体具有略微不同的核酸序列，但编码相同或基本相似的蛋白质。

在特定方面，本发明涉及分离的核酸片段和重组载体，其整合了编码本公开多肽或肽的核酸序列。术语“重组的”可以与多核苷酸或多肽一起使用，这通常指的是在体外生产和/或操纵的多肽或多核苷酸，或者为这种分子的复制产物。

在其他方面，本发明涉及分离的核酸区段和重组载体，其整合了编码本发明多肽或肽的核酸序列。

本公开中使用的核酸片段可以与其他核酸序列组合，例如启动子、聚腺苷酸化信号、额外的限制性酶位点、多克隆位点、其他编码片段等，使得其总长度可以有相当大的变化。因此，预期可以采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地由制备以及在计划的重组核酸方案中的使用的简便性来限制。在一些情况下，核酸序列可以利用其他异源编码序列来编码多肽序列，例如以提供多肽的纯化、运输、分泌、转译后修饰，或提供治疗获益，例如靶向或功效。如以上所讨论的，可以将标签或其他异源的多肽添加到经修饰的多肽编码序列，其中“异源的”指的是与经修饰的多肽不相同的多肽。

在某些方面，本公开提供了与本文公开的序列具有基本同一性的多核苷酸变体；与使用本文所述方法(例如，使用标准参数的BLAST分析)的本公开的多核苷酸序列相比，其包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或高于99％序列同一性，包括其间的所有值和范围。

本公开还考虑使用与所有上述多核苷酸互补的多核苷酸。

A.载体

本公开的多肽可以由包含在载体中的核酸分子编码。术语“载体”用来指运载体核酸分子，异源的核酸序列可以插入到运载体核酸分子中用于引入到细胞中，在细胞中其可以被复制和表达。核酸序列可以是“异源的”，这表示该核酸序列处于对于其中引入载体的细胞而言或者对于被并入的核酸而言非原有的环境中，其包含与细胞或核酸中的序列同源的序列，但在宿主细胞或核酸内的位置中，通常找不到该核酸序列。载体包括DNA、RNA、质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员能够通过标准重组技术构建载体(例如Sambrook等人，2001；Ausubel等人，1996年，两者均以引用方式并入本文)。除了编码本公开的多肽之外，载体可以编码其他多肽序列，例如一种或多于一种其他细菌肽、标签或免疫原性增强肽。编码这种融合蛋白有用的载体包括pIN载体(INOuye等人，1985)、编码一段组氨酸的载体、和pGEX载体，其用于产生谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶解的融合蛋白以用于之后的纯化和分离或切割。

术语“表达载体”指的是含有对能够被转录的基因产物的至少部分编码的核酸序列的载体。在一些情况下，然后RNA分子转译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可以含有各种“控制序列”，“控制序列”指的是在特定宿主生物中可操作地连接的编码序列的转录和可能的转译所需要的核酸序列。除了管理转录和转译的控制序列之外，载体和表达载体还可以含有具有其他功能的核酸序列，并且在本文中进行描述。

B.启动子和增强子

“启动子”是控制序列。启动子一般是控制转录的启动和速度的核酸序列的区域。其可以含有遗传因子，在遗传因子处调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。短语“可操作地放置”、“可操作地连接”、“处于控制之下”和“处于转录控制之下”表示启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向，以控制转录启动和该序列的表达。启动子可以或不可以与“增强子”一起使用，“增强子”指的是涉及核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。

因此，在选择用于表达的细胞类型或生物体中采用有效地指挥DNA节段的表达的启动子和/或增强子可以是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达的用途(参见Sambrook等人，2001，通过引用并入本文)。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的或诱导型的，并且在某些方面可以在特定条件下指导导入的DNA片段的高水平表达，例如重组蛋白或肽的大规模生产。

认为编码本发明的多核苷酸的用于控制肽或蛋白质表达的特别的启动子不是决定性的，只要其能够在靶细胞，优选细菌细胞中表达多核苷酸。当靶向人类细胞时，优选将多核苷酸编码区与启动子相邻放置，并处于启动子的控制之下，启动子能够在人类细胞中被表达。一般而言，这种启动子可以包括细菌、人类或病毒的启动子。

C.起始信号和内部核糖体结合位点(IRES)

编码序列的有效转译还可以需要特定的启动信号。这些信号包括ATG启动密码子或相邻的序列。可以必须提供外源转录控制信号，包括ATG启动密码子。本领域普通技术人员应当容易地能够确定这点，并提供必需的信号。

在本发明的某些方面，内部核糖体结合位点(IRES)元件的用途被用来产生多基因或多顺反子的信息。IRES元件能够绕开核糖体扫描模型的依赖5'甲基化Cap的转译而在内部位点开始转译(Pelletier和Sonenberg，1988；Macejak和SarNOw，1991)。IRES元件也可以被连接至异源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，每一个被IRES分开，产生多顺反子的信息。利用单个启动子/增强子以转录单一信息可以有效地表达多个基因(参见美国专利5925565和5935819，在此通过引用并入)。

D.可选择的和可筛选的标记

在本发明的某些方面，通过在表达载体中编码可筛选的或可选择的标记可以在体外或体内鉴别含有当前公开的核酸构建体的细胞。当被转录并转译时，标记对细胞提供可辨认的变化，这允许含有表达载体的细胞的简单鉴别。一般地，可选择标记是提供允许选择的性质的标记。正选择标记是其中标记的存在允许其选择的标记，而负选择标记是其中标记的存在防止其选择的标记。正选择标记的实例是耐药性标记。

E.宿主细胞

如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换地使用。所有这些术语还包括其后代，后代是任何及全部后代。应理解全部后代由于有意或无意的突变可以不相同。在表达异源核酸序列的情况下，“宿主细胞”指的是原核细胞或真核细胞，且其包括能够复制载体或表达由载体编码的异源基因的任何可转化的生物体。宿主细胞可以并且已经用作载体或病毒的受体。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，这指的是通过其将外源核酸，例如重组蛋白编码序列转移或引入到宿主细胞的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。

宿主细胞可以来源于原核生物或真核生物，包括用于载体的复制或核酸序列的部分或全部的表达的细菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。许多细胞系和培养物可用作宿主细胞，并且它们可通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，该保藏中心是用作活培养物和遗传物质的档案库的组织(www.atcc.org)。

F.表达系统

存在包含上述组合物的至少部分或全部的许多表达系统。可以采用基于原核的和/或真核的系统用于本发明以生产核酸序列或其同源的多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统在商业上是广泛可用的。

昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生异源核酸区段的高水平的蛋白表达，例如在美国专利5871986、4879236中所述的，两者都通过引用并入本文，且系统可以例如从

除了本发明公开的表达系统之外，表达系统的其他实例包括

Ⅳ.其他疗法

A.免疫疗法

在一些方面，该方法包括施用癌症免疫疗法。癌症免疫疗法(有时称为免疫肿瘤学，缩写为IO)是利用免疫系统来治疗癌症。免疫疗法可分为主动、被动或混合(主动和被动)。这些方法利用了这样的事实，即癌细胞表面经常有可以被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤相关抗原(TAA)；它们通常是蛋白质或其他大分子(如碳水化合物)。主动免疫疗法通过靶向TAA来指导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤反应，包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。下文描述了在本公开的方法中有用的免疫疗法。

3.检查点抑制剂和联合治疗

本公开的方面可以包括免疫检查点抑制剂的施用(也称为检查点抑制剂疗法)，这将在下文中进一步描述。

b.PD-1、PD-L1和PD-L2抑制剂

PD-1可以在T细胞遇到感染或肿瘤的肿瘤微环境中发挥作用。激活的T细胞上调PD-1并继续在外周组织中表达。细胞因子如IFN-γ诱导上皮细胞和肿瘤细胞上PD-L1的表达。PD-L2在巨噬细胞和树突细胞上表达。PD-1的主要作用是限制外周效应T细胞的活性，并防止免疫反应期间对组织的过度损伤。本发明的抑制剂可以阻断PD-1和/或PD-L1活性的一种或多于一种功能。

“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PD-L1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-h。“PD-L2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些方面，PD-1、PD-L1和PD-L2是人PD-1、PD-L1和PD-L2。

在一些方面，PD-1抑制剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体的方面，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。另一方面，PD-L1抑制剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在具体的方面，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。另一方面，PD-L2抑制剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在具体的方面，PD-L2结合配偶体是PD-1。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性的抗体在美国专利第8735553号、第8354509号和第8008449号中有所描述，这些专利均通过引用并入本文。用于本文提供的方法和组合物的其他PD-1抑制剂是本领域已知的，例如美国专利申请US2014/0294898、US2014/022021和US2011/0008369中所述，所有这些文献通过引用并入本文。

在一些方面，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些方面，抗PD-1抗体选自纳武利尤单抗、帕博利珠单抗和匹地利珠单抗。在一些方面，PD-1抑制剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些方面，PD-L1抑制剂包括AMP-224。纳武利尤单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

在一些方面，免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂，例如德瓦鲁单抗(也称为MEDI4736)、阿特珠单抗，也称为MPDL3280A、阿维单抗，也称为MSB00010118C、MDX-1105、BMS-936559或其组合。在某些方面，免疫检查点抑制剂是PD-L2抑制剂，例如rHIgM12B7。

在一些方面，抑制剂包括纳武利尤单抗、帕博利珠单抗或匹地利珠单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个方面，抑制剂包含纳武利尤单抗、帕博利珠单抗或匹地利珠单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及纳武利尤单抗、帕博利珠单抗或匹地利珠单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。另一方面，抗体与上述抗体竞争结合和/或结合PD-1、PD-L1或PD-L2上的相同表位。在另一方面，抗体与上述抗体至少具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中可推导的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。

c.CTLA-4、B7-1和B7-2

本文提供的方法中可以靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列在Genbank的检索号为L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，当与抗原呈递细胞表面的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合时，它充当“关闭”开关。CTLA-4是免疫球蛋白超家族的一员，表达于辅助性T细胞表面，并向T细胞传递抑制信号。CTLA-4类似于T细胞共刺激蛋白CD28，这两种分子都与抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。在调节性T细胞中也发现了细胞内CTLA-4，并且可能对它们的功能很重要。通过T细胞受体和CD28激活T细胞导致CTLA-4表达增加，这是B7分子的抑制性受体。本发明的抑制剂可以阻断CTLA-4、B7-1和/或B7-2活性的一种或多于一种功能。在一些方面，抑制剂阻断了CTLA-4和B7-1的相互作用。在一些方面，抑制剂阻断了CTLA-4和B7-2的相互作用。

在一些方面，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。

适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或由其可推导的VH和/或VL结构域)可以用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，描述于以下公开中的抗CTLA-4抗体可用于本文公开的方法中：美国专利8119129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为替西木单抗(ticilimumab))、美国专利号6207156；Hurwitz等人，1998年。上述出版物中每一个的教导通过引用并入本文。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，在国际专利申请号WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利号8017114中描述了人源化CTLA-4抗体；所有这些都通过引用并入本文。

在本公开的方法和组合物中用作检查点抑制剂的另一种抗CTLA-4抗体是易普利姆玛(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和

在一些方面，抑制剂包括曲美木单抗或易普利姆玛的重链和轻链CDR或VR。因此，一方面，抑制剂包含曲美木单抗或易普利姆玛的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及曲美木单抗或易普利姆玛的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。另一方面，抗体与上述抗体竞争结合和/或结合PD-1、B7-1或B7-2上的相同表位。在另一方面，抗体与上述抗体至少具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中可推导的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。

4.共刺激分子的抑制

在一些方面，免疫疗法包含共刺激分子的抑制剂。在一些方面，抑制剂包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、ICOS、OX40(TNFRSF4)、4-1BB(CD 137；TNFRSF9)、CD40L(CD40LG)、GITR(TNFRSF18)及其组合。抑制剂包括抑制性抗体、多肽、化合物和核酸。

5.树突细胞疗法

树突细胞疗法通过使树突细胞向淋巴细胞呈递肿瘤抗原来激发抗肿瘤反应，淋巴细胞激活树突细胞，引发树突细胞杀死呈递抗原的其他细胞。树突细胞是哺乳动物免疫系统中的抗原呈递细胞(APC)。在癌症治疗中，它们有助于癌症抗原靶向。基于树突细胞的细胞癌症治疗的一个实例是西普鲁塞-T。

诱导树突细胞呈递肿瘤抗原的一种方法是通过用自体肿瘤裂解物或短肽(对应于癌细胞上蛋白抗原的小部分蛋白)接种。这些肽通常与佐剂(高免疫原性物质)结合使用，以增强免疫和抗肿瘤反应。其他佐剂包括吸引和/或激活树突细胞的蛋白质或其他化学物质，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

树突细胞也可以通过使肿瘤细胞表达GM-CSF而在体内被激活。这可以通过基因工程改造肿瘤细胞以产生GM-CSF或通过用表达GM-CSF的溶瘤病毒感染肿瘤细胞来实现。

另一种策略是从患者血液中取出树突细胞，并在体外激活它们。树突细胞在肿瘤抗原的存在下被激活，肿瘤抗原可以是单一的肿瘤特异性肽/蛋白或肿瘤细胞裂解物(分解的肿瘤细胞的溶液)。这些细胞(以及可选的佐剂)被注入并激发免疫反应。

树突细胞疗法包括使用与树突细胞表面受体结合的抗体。可以将抗原添加到抗体中，并且可以诱导树突细胞成熟并为肿瘤提供免疫力。

6.CAR-T细胞疗法

嵌合抗原受体(CAR，也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是工程受体，它将新的特异性与免疫细胞结合起来，靶向癌细胞。通常，这些受体将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。这些受体被称为嵌合体，因为它们是由不同来源的部分融合而成的。CAR-T细胞疗法是指使用这种转化细胞进行癌症治疗的疗法。

CAR-T细胞设计的基本原理包括结合抗原结合和T细胞激活功能的重组受体。CAR-T细胞的一般前提是人工产生针对癌细胞上发现的标志物的T细胞。科学家们可以从人身上取出T细胞，对它们进行基因改造，然后把它们放回病人体内，让它们攻击癌细胞。一旦T细胞被改造成CAR-T细胞，它就成了“活药物”。CAR-T细胞在细胞外配体识别结构域和细胞内信号分子之间建立了联系，细胞内信号分子反过来激活T细胞。胞外配体识别结构域通常是单链可变片段(scFv)。CAR-T细胞治疗安全性的重要方面是如何确保只靶向癌性肿瘤细胞，而不靶向正常细胞。CAR-T细胞的特异性由靶向分子的选择决定。

示例性的CAR-T疗法包括Tisagelecleucel(Kymriah)和Axicabtagene ciloleucel(Yescarta)。在某些方面，CAR-T疗法靶向CD19。

7.细胞因子疗法

细胞因子是由肿瘤内存在的多种类型细胞产生的蛋白质。它们可以调节免疫反应。肿瘤经常利用它们来生长并降低免疫反应。这些免疫调节作用允许它们被用作激发免疫反应的药物。两种常用的细胞因子是干扰素和白细胞介素。

干扰素是由免疫系统产生的。通常参与抗病毒反应，但也用于癌症。它们分为三类：I型(IFNα和IFNβ)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)。

白细胞介素具有一系列免疫系统效应。IL-2是示例性的白介素细胞因子疗法。

8.过继性T细胞疗法

过继T细胞疗法是通过输注T细胞(过继细胞转移)进行被动免疫的形式。它们存在于血液和组织中，通常在发现外来病原体时被激活。具体来说，当T细胞的表面受体遇到在其表面抗原上展示部分外源蛋白的细胞时，它们就会激活。这些细胞可以是受感染的细胞，也可以是抗原呈递细胞(APC)。它们在正常组织和肿瘤组织中被发现，在肿瘤组织中被称为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。它们被呈递肿瘤抗原的树突细胞等APC激活。虽然这些细胞可以攻击肿瘤，但肿瘤内的环境是高度免疫抑制的，防止了免疫介导的肿瘤死亡。

已经开发了多种产生和获得肿瘤靶向T细胞的方法。可以从肿瘤样品(TIL)中取出或从血液中过滤出对肿瘤抗原特异的T细胞。随后的激活和培养是在体外进行的，结果是再次输注。激活可以通过基因治疗或通过将T细胞暴露于肿瘤抗原来实现。

预期癌症治疗可以排除本文所述的任何癌症治疗。此外，本公开的方面包括之前已经接受了本文所述疗法的治疗、当前正在接受本文所述疗法的治疗或尚未接受本文所述疗法的治疗的患者。在一些方面，患者是已经被确定对本文所述的疗法有抗性的患者。在一些方面，患者是已被确定对本文所述疗法敏感的患者。

B.溶瘤病毒

在一些方面，额外的疗法包括溶瘤病毒。溶瘤病毒是优先感染和杀死癌细胞的病毒。随着受感染的癌细胞被溶瘤作用破坏，它们释放新的传染性病毒颗粒或病毒体来帮助破坏剩余的肿瘤。溶瘤病毒被认为不仅能直接破坏肿瘤细胞，还能刺激宿主的抗肿瘤免疫反应，用于长期免疫治疗。

C.多糖

在一些方面，额外的治疗包括多糖。蘑菇中发现的某些化合物，主要是多糖，可以上调免疫系统，并可能具有抗癌特性。例如，β-葡聚糖如香菇多糖在实验室研究中显示出刺激巨噬细胞、NK细胞、T细胞和免疫系统细胞因子，并在临床试验中作为免疫佐剂进行了研究。

D.新抗原

在一些方面，额外的治疗包括施用新抗原。许多肿瘤表达突变。这些突变可能产生新的靶向抗原(新抗原)用于T细胞免疫疗法。使用RNA测序数据确定的癌症病变中CD8+T细胞的存在，在具有高突变负荷的肿瘤中较高。在许多人类肿瘤中，与自然杀伤细胞和T细胞的溶细胞活性相关的转录物水平与突变负荷呈正相关。

E.化学疗法

在一些方面，额外的治疗包括化学疗法。合适的化学疗法药物别包括：(a)烷化剂，例如氮芥(例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥)、亚乙基亚胺和甲基三聚氰胺(例如六甲基三聚氰胺、塞替派)、烷基磺酸盐(例如白消安)、亚硝基脲(例如卡莫斯汀、洛莫斯汀、氯脲菌素、链脲菌素)和三嗪(例如二卡巴嗪)，(b)抗代谢药，例如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、氮尿苷)以及嘌呤类似物和相关物质(例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁)，(c)天然产物，例如长春花碱(例如长春碱、长春新碱)、表鬼臼毒素(例如依托泊苷、替尼泊苷)、抗生素(例如放线菌素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素和米托蒽醌)、酶(例如L-天冬酰胺酶)和生物反应调节剂(例如干扰素-α)和(d)其他试剂，例如铂类配合物(例如顺铂、卡铂)、经取代的尿素(例如羟基脲)、甲基肼衍生物(例如甲基苄肼)和肾上腺皮质激素抑制剂(例如紫杉醇和米托坦)。在一些方面，顺铂是特别合适的化学疗法剂。

顺铂已广泛用于治疗癌症，例如转移性睾丸癌或卵巢癌、晚期膀胱癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌或其他肿瘤。顺铂不能口服吸收，因此必须通过其他途径施用，例如静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射。顺铂可以单独使用或与其他药物组合使用，在某些方面，临床应用中使用的有效剂量包括约15mg/m

其他合适的化学疗法剂包括抗微管剂，例如紫杉醇(“紫杉醇”)和盐酸多柔比星(“多柔比星”)。通过腺病毒载体递送的Egr-1启动子/TNFα构建体和多柔比星的组合被确定为在克服对化学疗法和/或TNF-α的耐药性方面是有效的，这表明用该构建体和多柔比星的组合治疗克服了对多柔比星和TNF-α的耐药性。

多柔比星吸收差，优选静脉施用。在某些方面，成人的合适静脉内剂量包括约21天间隔的约60mg/m

氮芥是在本公开的方法中有用的另一种合适的化学治疗剂。氮芥可包括但不限于二氯甲基二乙胺(HN

其他合适的化学治疗剂包括嘧啶类似物，例如阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶；5-FU)和氟尿苷(氟脱氧尿苷；FudR)。5-FU可以以约7.5mg/m

推荐另一种合适的化学治疗剂吉西他滨二磷酸盐(

递送给患者的化学治疗剂的量可以是可变的。在一个合适的方面，当用该构建体施用化学疗法时，化学治疗剂可以以有效的量施用以引起宿主中癌症的抑制或消退。在其他方面，化学治疗剂可以以化学治疗剂的化学治疗有效剂量的1/2至1/10000的量施用。例如，可以以化学治疗剂的化学治疗有效剂量的约1/20、约1/500或甚至约1/5000的量来施用化学治疗剂。可以在体内与构建体一起测试本公开的化学治疗剂的所需治疗活性，以及确定有效剂量。例如，这些化合物可以在人体试验之前在合适的动物模型系统中进行试验，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。如实施例中所述，体外试验也可用于确定合适的组合和剂量。

F.放射治疗

在某些方面，额外的治疗或先前治疗包括辐射，例如电离辐射。如本文所用，“电离辐射”是指包括具有足够能量或可通过核相互作用产生足够能量以产生电离(电子的获得或损失)的粒子或光子的辐射。示例性和优选的电离辐射是x辐射。用于向靶组织或细胞递送x射线的手段是本领域众所周知的。

在一些方面，电离辐射量大于20Gy并且以一剂施用。在一些方面，电离辐射量为18Gy并且以三剂施用。在一些方面，电离辐射的量至少、至多或恰好为2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy、15Gy、16Gy、17Gy、18Gy、19Gy、20Gy、21Gy、22Gy、23Gy、24Gy、25Gy、26Gy、27Gy、18Gy、19Gy、30Gy、31Gy、32Gy、33Gy、34Gy、35Gy、36Gy、37Gy、38Gy、39Gy、40Gy、41Gy、42Gy、43Gy、44Gy、45Gy、46Gy、47Gy、48Gy、49Gy或40Gy(或其中可推导的任何范围)。在一些方面，以至少、至多或恰好1剂、2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂、8剂、9剂或10剂(或其中可推导的任何范围)施用电离辐射。如果施用多于一剂，则施用间隔可以约为1小时、4小时、8小时、12小时或24小时、或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7或8天、或1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周、14或16周、或其中可推导的任何范围。

在一些方面，IR的量可以表示为IR的总剂量，然后以分次剂量施用。例如，在一些方面，总剂量是50Gy，分10次施用，每次5Gy。在一些方面，总剂量为50Gy至90Gy，分20次至60次施用，每次2Gy至3Gy。在一些方面，IR的总剂量为至少、至多或约20Gy、21Gy、22Gy、23Gy、24Gy、25Gy、26Gy、27Gy、28Gy、29Gy、30Gy、31Gy、32Gy、33Gy、34Gy、35Gy、36Gy、37Gy、38Gy、39Gy、40Gy、41Gy、42Gy、43Gy、44Gy、45Gy、46Gy、47Gy、48Gy、49Gy、50Gy、51Gy、52Gy、53Gy、54Gy、55Gy、56Gy、57Gy、58Gy、59Gy、60Gy、61Gy、62Gy、63Gy、64Gy、65Gy、66Gy、67Gy、68Gy、69Gy、70Gy、71Gy、72Gy、73Gy、74Gy、75Gy、76Gy、77Gy、78Gy、79Gy、80Gy、81Gy、82Gy、83Gy、84Gy、85Gy、86Gy、87Gy、88Gy、89Gy、90Gy、91Gy、92Gy、93Gy、94Gy、95Gy、96Gy、97Gy、98Gy、99Gy、100Gy、101Gy、102Gy、103Gy、104Gy、105Gy、106Gy、107Gy、108Gy、109Gy、110Gy、111Gy、112Gy、113Gy、114Gy、115Gy、116Gy、117Gy、118Gy、119Gy、120Gy、125Gy、130Gy、135Gy、140Gy、或150Gy(或其中可推导的任何范围)。在一些方面，总剂量以每次至少、至多或约1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy、6Gy、7Gy、8Gy、9Gy、10Gy、12Gy、14Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy或50Gy(或其中可推导的任何范围)的剂量施用。在一些方面，分至少、至多或约2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次、25次、26次、27次、28次、29次、30次、31次、32次、33次、34次、35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次、45次、46次、47次、48次、49次、50次、51次、52次、53次、54次、55次、56次、57次、58次、59次、60次、61次、62次、63次、64次、65次、66次、67次、68次、69次、70次、71次、72次、73次、74次、75次、76次、77次、78次、79次、80次、81次、82次、83次、84次、85次、86次、87次、88次、89次、90次、91次、92次、93次、94次、95次、96次、97次、98次、99次、或100次(或其中可推导的任何范围)施用剂量。在一些方面，每天分至少、至多或约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次或12次(或其中可推导的任何范围)施用剂量。在一些方面，每周分至少、至多或约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次、25次、26次、27次、28次、29次或30次(或其中可推导的任何范围)施用剂量。

G.外科手术

大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期性、治疗性和姑息性手术。治疗性手术包括切除，其中全部或部分癌组织被物理地移除、切除和/或破坏，并且可以与其他疗法结合使用，例如本方面的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指物理切除肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微镜控制手术(莫氏手术)。

在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或局部应用额外的抗癌疗法来完成。这种治疗可以重复，例如，每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或每1周、2周、3周、4周和5周，或每1月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月或12月。这些治疗也可以是不同的剂量。

H.其他药剂

预期其它药剂可与本发明的某些方面结合使用，以提高治疗的疗效。这些额外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂或其他生物药剂。通过增加GAP连接的数量来增加细胞间信号传导将增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他方面，细胞抑制剂或分化剂可以与本发明的某些方面联合使用，以提高治疗的抗过度增殖功效。细胞黏附抑制剂被认为可以提高本发明的功效。细胞黏附抑制剂的实例是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还考虑了增加过度增殖细胞对凋亡敏感性的其它药剂，例如抗体c225，可以与本发明的某些方面联合使用，以提高治疗效果。

Ⅴ.组合疗法

本公开的组合物和相关方法，特别是本公开的掩蔽治疗剂的施用，也可以与诸如本文所述的附加治疗剂的施用结合使用，或与本领域已知的用于治疗癌症的其他传统治疗剂结合使用。

本文公开的治疗性组合物和疗法可以在另一种疗法或药物之前、与之并行和/或之后进行，间隔为数分钟至数周。在将药物单独施用于细胞、组织或生物体的方面，人们通常会确保每次递送时间之间的一段重要时间不会过期，这样治疗剂仍然能够发挥对细胞、组织或生物体的有利的组合作用。例如，在这样的情况下，设想可以基本上同时(即，在不到一分钟的时间内)用两种、三种、四种或多于四种药物或治疗方法接触细胞、组织或生物体。在其他方面，可以在施用另一治疗药物或治疗手段之前和/或之后的1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或长于8周以及其中可推导的任何范围内施用或提供一种或多于一种治疗剂或治疗。

可以采用治疗剂和疗法的各种组合方案。这类组合的非限制性实例如下所示，其中治疗剂如本文公开的组合物是“A”，第二种药物如本文描述的或本领域已知的另外的药物或疗法是“B”：

在一些方面，可以采用一个以上的疗程。预期可以实施多个疗程。

Ⅵ.治疗方法

当前的方法和组合物涉及用于治疗癌症的方法。在一些方面，癌症包括实体瘤。在某些方面，癌症是非淋巴性的。在一些方面，癌症是乳腺癌或结肠癌。

本公开的组合物可用于体内、体外或离体施用。组合物的施用途径可以是例如肿瘤内、皮内、皮下、静脉内、淋巴内和腹膜内施用。在一些方面，施用是肿瘤内或淋巴内或肿瘤周围。在一些方面，将组合物直接施用到癌组织或淋巴结中。

如本文所用，“肿瘤”是指所有赘生性细胞的生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌”、“细胞增殖性疾病”、“增殖性疾病”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。

适于治疗的癌症包括但不限于所有类型、位置、大小和特征的肿瘤。本公开的方法和组合物适用于治疗例如胰腺癌、结肠癌、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌症、AIDS相关的淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童小脑或脑基底细胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑瘤、小脑星形细胞瘤脑瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤脑瘤、室管膜上皮瘤脑瘤、髓母细胞瘤脑肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、脑肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、特定的乳腺癌如原位导管癌、浸润性导管癌、乳腺管状癌、乳腺髓样癌、乳腺黏液性癌、乳腺乳头状癌、乳腺筛状癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、原位小叶癌、男性乳腺癌、乳头佩吉特病、乳腺叶状肿瘤、复发和/或转移性乳腺癌、癌症、A型或B型管腔型乳腺癌、三阴性/基底样乳腺癌和富含HER2的乳腺癌、淋巴癌、支气管腺瘤/类癌、气管癌、伯基特淋巴瘤、类癌、童年类癌、未知原发性胃肠道癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、儿童宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆形细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏病、儿童性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤：颅外、性腺外或卵巢、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干神经胶质瘤、神经胶质瘤、儿童期脑星形细胞瘤、儿童视力通路和下丘脑胶质瘤、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞)癌症)、喉癌、白血病、急性淋巴细胞白血病(也称为急性淋巴细胞性白血病)、急性髓样白血病(也称为急性骨髓性白血病)、慢性淋巴细胞白血病(也称为慢性淋巴细胞性白血病)、慢性髓细胞性白血病(也称为慢性粒细胞性白血病)、毛细胞唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、与艾滋病相关的淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(除霍奇金氏以外的所有淋巴瘤的旧分类)淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、骨/骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤、儿童成年髓母细胞瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克尔细胞癌、成人恶性间皮瘤、儿童间皮瘤、转移性鳞状上皮癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样霉菌病、骨髓增生异常综合症、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性骨髓性白血病、成人急性骨髓性白血病、儿童急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽喉癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖瘤、成纤维细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、儿童唾液腺癌肉瘤、尤因家族肿瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫塞扎综合征肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌、默克尔细胞小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状上皮癌伴隐匿性原发性、转移性胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、儿童胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌症、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、儿童期外阴癌和肾母细胞瘤(肾脏癌)。

Ⅶ.药物组合物和方法

在一些方面，向对象施用药物组合物。不同的方面包括给对象施用有效量的组合物。在一些方面，可以向对象或患者施用包含抑制剂的组合物，以治疗癌症或减小肿瘤的大小。此外，这些化合物可以与其他癌症疗法组合施用。

可以将组合物配制成用于肠胃外施用，例如，配制成用于通过静脉内、经导管注射、动脉内注射、肌内、皮下或甚至腹膜内途径。一般地，这种组合物可以制备为液体溶液或为悬浮液的注射剂；也可以制备为适用于在注射前靠添加液体来制备溶液或悬浮液的固体形式；并且制剂还可以是乳化的。根据本公开内容，这种制剂的制备对于本领域技术人员来说是已知的。其他施用途径包括肿瘤内、肿瘤周围、淋巴内、进入癌组织的注射和进入淋巴结的注射。在一些方面，施用是全身性的。

适合于可注射使用的药物形式包括无菌的水溶液或分散剂；包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌散剂。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是一定程度上可以溶液地注射的流体。其还应是在制造和储存的条件下稳定的，并且必须在防微生物，例如细菌和真菌的污染作用的条件下保存。

载体也可以是含有以下的溶剂或分散介质，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以通过以下方式来保持适当的流动性：例如通过使用包衣，例如卵磷脂，通过在分散剂的情况下保持需要的粒径，和通过使用表面活性剂。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等来实现。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的持久的吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌的可注射溶液通过以下方法来制备：在适当溶剂中将活性化合物以所需量与以上列举的各种其他成分合并，如果需要的话然后进行过滤除菌。通常，分散剂通过将各种无菌的活性成分并入到无菌载剂中来制备，无菌载剂含有基本的分散介质和来自以上列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌散剂的情况下，制备的优选方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分和任何额外的所需成分的粉末，额外的所需成分来自其预先无菌过滤的溶液。

如本文中使用的，术语“药学上可接受的”指的是在可靠的医学判断的范围内，适合与人类和动物的组织接触而没有与合理的受益/风险比相称的过多毒性、刺激性、过敏反应或其他问题并发症的那些化合物、物质、组合物、和/或剂型。术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或载剂，例如液态或固态填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物质，其涉及运载或运输化学剂。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。

剂量的一些变化将根据对象的病情有必要地发生。负责施用的人将在任何情况下确定对于个体对象合适的剂量。基于预期的目标来确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用在对象中使用的物理不连续的单位，各单位含有计算以产生与其施用、即适当途径和方案相关的上述期望应答的预定量的组合物。待施用的量，根据治疗的次数和单位剂量两者，取决于期望的效果。组合物的精确量还取决于医师的判断，并且对每一个体都是独特的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用的途径、治疗的预期目标(症状的缓和与治愈)和特定组合物的效力、稳定性以及毒性。

在配制后，溶液会以与剂型相容的方式和在治疗或预防上有效的量来施用。以各种剂型，例如上述可注射溶液的类型容易地施用制剂。

通常，对于成人(重约70公斤)，施用约0.1mg至约3000mg(包括其间的所有值和范围)、或约5mg至约1000mg(包括其间的所有值和范围)、或约10mg至约100mg(包括其间的所有值和范围)的化合物。应当理解的是，这些剂量范围仅作为实例，并且可以根据技术人员已知的因素来调节施用。

在某些方面，向对象施用约、至少约、或者至多约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000毫克(mg)或微克(mcg)或微克/千克或微克/千克/分钟或毫克/千克/分钟或微克/千克/小时或毫克/千克/小时，或其中可推导的任何范围。

剂量可以根据需要或每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时或24小时(或其中可推导的任何范围)施用，或每天施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次或9次(或其中可推导的任何范围)。可以在病症迹象之前或之后首先施用剂量。在一些方面，在患者经历或表现出病症迹象或症状后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时(或其中可推导的任何范围)或1天、2天、3天、4天或5天(或其中可推导的任何范围)，向患者施用第一剂量的方案。患者可接受1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或多于10天时间(或其中可推导的任何范围)的治疗，或直至症状消失或减轻的治疗，或在感染症状消失或减轻后6小时、12小时、18小时或24小时或1天、2天、3天、4天或5天的治疗。

Ⅷ.实施例

包括以下实施例以说明本公开的优选实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中所公开的技术能代表本发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此能够认为其构成用于其实践的优选实施方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例1-将细胞因子受体与细胞因子融合，作为细胞因子活性的掩蔽，以降低其毒性并增加其肿瘤特异性激活。

根据美国国家癌症研究所，癌症是美国第二大死亡原因。癌症免疫疗法彻底改变了肿瘤学的临床实践方式，这要归功于检查点封闭抗体(针对实体瘤)和过继T细胞疗法(针对液态癌)。在患有实体恶性肿瘤的患者中，检查点抑制剂(CPI)治疗在一部分患者(截至2018年为12.46％)中诱导了持久的反应(1)。人们已经做了大量的工作，并在继续研究为什么只有一小部分患者对CPI疗法有反应(2)。这些研究表明CPI治疗的成功取决于预先存在的肿瘤内炎症(3)，特别是激活T细胞的基线证据(4)，IFNg相关基因表达特征(5、6)和主要组织相容性复合体(MHC)分子的表达(7)。为了进一步提高反应率，需要将专注于诱导炎症的新治疗策略引入临床。促炎细胞因子是强大的分子，能够驱动肿瘤反应性CD8+T细胞的分化，激活IFNg通路并增加MHC I类和II类分子的表达。尽管如此，由于这些细胞因子引起的剂量限制性免疫相关不良事件(irAE)，它们在临床上的使用受到了限制。克服这一挑战是成功翻译细胞因子并将其广泛用于临床的重要一步，也是设计新的联合免疫治疗策略的重要一步。

IL-12是60kDa的异二聚体细胞因子，由通过二硫键连接的p35和p40亚基组成。它与由IL-12Rb1和IL-12Rb2组成的IL-12受体复合物结合，诱导信号转导子和转录激活子4(STAT4)的磷酸化并导致T细胞和自然杀伤(NK)细胞分泌IFNg。IL-12在连接先天免疫和适应性免疫方面起着至关重要的作用(8)，因为它激活CD4/8T细胞并驱动辅助性T细胞1-(Th1)-偏向性反应(9)，充当NK细胞的生长因子(10)，并通过增加MHC的表达启动髓样细胞(11，12)。IFNg本身可以直接作用于肿瘤细胞，因为IFNg受体复合物(IFNGR1和IFNGR2)是由癌细胞表达的。IFNg对癌细胞发挥有效的抗血管生成、抗增殖和促凋亡作用(13)。IL-12的大多数抗肿瘤活性与IFNg有关(14)，irAE也是如此(15)。在临床试验中，IL-12和IFNg疗法的主要毒性是“流感样”症状(16，17)和肝酶升高(18)。因此，成功的IL-12治疗必须将循环IFNg水平降至最低，同时维持其在肿瘤中的水平(19)。

I型IFN(IFNa/b)被发现是有效的抗病毒细胞因子(20)，并且也被广泛认为是抗肿瘤免疫的关键组分(21)。有许多I型IFN成员，它们都与I型IFN特异性异二聚体受体复合物IFNAR1和IFNAR2结合。尽管IFNa/b和IFNg在结构上彼此相似，并引发部分重叠的基因特征，但I型IFN刺激的反应似乎更广泛(22)。I型IFN主要激活STAT1、STAT2，但也能激活STAT3和STAT5(23-25)，而IFNg主要磷酸化STAT1。IFNa可以诱导癌细胞的凋亡、树突细胞(DC)的成熟和DC产生IL-15(26)。IFNa被批准用于治疗毛细胞白血病(27)、获得性免疫缺陷综合征患者的卡波西氏肉瘤(28)和晚期黑色素瘤(21)，然而30％至50％的患者出现了剂量限制性irAE(29)。为了延长其血清半衰期并减少施用次数，聚乙二醇(PEG)与IFNa-2b(PEG内含子)结合(30)。虽然这种策略提供了更具血清持久性的IFNa形式，但仍有严重副作用的报道，这可能是由于与循环细胞和健康组织中表达的IFNAR结合所致(31)。工程I型干扰素可以在肿瘤中被特异性激活，这将减轻irAE并增加从治疗中受益的患者比例。

这里，本发明人试图开发IL-12和IFN的结合位点掩蔽方法，以改善其毒性。他们使用了IL-12受体β1(IL-12Rb1)纤连蛋白I和II结构域作为IL-12结合位点的掩蔽(图1)，结构域是该受体蛋白的细胞因子结合结构域。本发明人提出了用于工程掩蔽的IL-12和IFN(I型和II型)的创新平台，其在循环和在健康器官中停留期间保持潜伏，但进入肿瘤后被激活。它们通过利用细胞因子和其受体亚基之间的高亲和力相互作用来实现这一目的。当通过肿瘤蛋白酶敏感接头融合在一起时，细胞因子-受体融合蛋白作为前药，在外周保持无活性。通过肿瘤相关的蛋白酶，在肿瘤部位，在肿瘤细胞外基质(ECM)中或在肿瘤细胞表面发生暴露。该方法将大大降低与细胞因子免疫治疗相关的irAE发生率，增强肿瘤内炎症，使肿瘤对CPI治疗更加敏感，从而提高治疗耐受性和疗效。

B.结果

通过与IL-12Rb1融合设计“proIL12”分子：本发明人设计了与IL-12蛋白重组融合的IL-12Rb1纤连蛋白I和II结构域。蛋白质由HEK293细胞表达，然后通过组氨酸标签亲和纯化和尺寸排阻柱纯化。抑制细胞因子-受体相互作用的结构域融合后，可赋予细胞因子潜伏期(49，50)。假设部分小鼠IL-12Rb1(Q20-A261，将被称为“M”)与IL-12的融合将使其失活。该片段高度糖基化，分子量为27kDa。通过利用IL-12的异二聚体结构，发明人将M融合到小鼠p35亚基的N-末端，并与小鼠p40、p40-CBD(增加肿瘤滞留)或p40-MSA(小鼠血清白蛋白；以增加血清半衰期)质粒共转染(图2A)。p35亚基和IL-12Rb1结构域之间的最佳接头长度通过改变(G3S)n的重复次数来确定，n＝11次重复产生最纯和最稳定的融合蛋白(M-L1-IL12，L1指的是(G3S)11接头)。比这更短的接头(n＝2和n＝5)导致蛋白质折叠不良(数据未显示)。发明人还能够表达M-L1-IL12-CBD和M-L1-IL12-MSA蛋白。然后，他们测试了这些构建体磷酸化STAT4的能力，并将半最大有效浓度(EC50)与未修饰的IL-12进行了比较(图2B)。IL-12的掩蔽提供了约1/100的活性降低，支持选择IL12Rb1作为掩蔽剂。然后，我们通过用报道的MMPs和丝氨酸蛋白酶的底物取代(G3S)11接头，表达了几个被掩蔽的IL-12的可切割变体。M-L2-IL12含有3个重复的MMP2-敏感性和MMP9-敏感性VPLSLYSG(SEQ ID NO:134)(VP)底物，M-L3-IL12含有3个重复的uPA-、基质酶-和豆荚蛋白-敏感性LSGRSDNH(SEQ IDNO:49)(LS)底物。将蛋白酶敏感的掩蔽的IL-12变体与相应的蛋白酶温育后，活性完全恢复(图2C)。这还通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察到(图2D)。proIL12的分子量从约100kDa下降到IL-12的MW，这表明掩蔽剂的完全切割。这些结果表明，由于与IL12Rb1部分融合，proIL12分子的生物活性大大降低，但在用蛋白酶处理掩蔽的构建体后，与天然IL12R复合物的结合完全恢复，因此显示出有利的掩蔽和去掩蔽。

接头工程：考虑到许多不同的接头设计是可能的，本发明人探索了是否有可能在体外增加针对MMP2的接头效率(图3)。含有3个重复的HPVGLLAR(SEQ ID NO:138-“HP”)的接头，称为L4，在74ng/mL MMP2的浓度下几乎被完全切割，而L2接头在该MMP2浓度下仅被部分切割。此外，接头L5(含有1个重复的VPLSLYSG-SEQ ID NO:134)对MMP2切割较不敏感，表明增加底物的重复改善了切割动力学。本发明人设计了接头，该接头具有HPVGLLAR(SEQ IDNO:138)和VPLSLYSG(SEQ ID NO:134)各2个重复，并添加了一个丝氨酸蛋白酶敏感的LSGRSDNH(SEQ ID NO:49)-称为L6，以进一步使蛋白酶的种类多样化。所得的L6接头与L4接头一样对MMP2敏感(图4)。为了确定敏感性的提高是否转化为抗肿瘤疗效的提高而不加重毒性，我们用PBS、IL-12、M-L5-IL12-CBD(低敏感性接头)或M-L6-IL12-CBD(高敏感性接头)治疗B16F10黑色素瘤小鼠，并定量血清和肿瘤内炎性细胞因子水平(图6)。ProIL12分子诱导非常少的血清IFNg，这是毒性的关键介质(图5A)。然而，接受高敏感性接头的小鼠的肿瘤内IFNg水平是接受低敏感性接头的小鼠的13倍(图5B)。与IL-12相比，proIL12治疗大大降低了其他促炎性趋化因子如CCL2和CCL4的血清水平(图5C，图5E)。M-L6-IL12-CBD治疗诱导了与IL-12治疗的小鼠相似水平的CXCL9，对效应T细胞募集重要的趋化因子(图5D)。累积起来，这些数据证明携带高敏感性接头的proIL12分子能够诱导相当大的肿瘤内炎症而不引起毒性。此外，这些研究指出，接头敏感性对于产生足够的肿瘤内炎症是至关重要的。

proIL12在健康小鼠中的毒性评估：在B16F10-黑色素瘤小鼠中的研究表明，掩蔽剂的融合能够显著减少循环促炎生物标志物。本发明人试图在健康的C3H/HeJ小鼠中研究每日proIL12治疗的效果，这些小鼠对低剂量的IL-12治疗有高度反应(15、53)。这些小鼠在每天施用IL-12后表现出身体变化，例如体重减轻和嗜睡。我们每天用0.5毫克IL-12、1毫克M-L6-IL12-CBD或5毫克M-L6-IL12-CBD(基于IL-12)治疗C3H/HeJ小鼠8天，并在最后一次施用后第二天测量它们的体重(图6)。这些结果说明，即使以10倍摩尔过量施用，proIL12的毒性仍然低于未修饰的IL-12。还预期本实施例的接头将提供更有利的毒理学读数，如全身性肝转氨酶水平、胰腺损伤水平和全血细胞计数。

proIL12在同系小鼠癌症模型中的抗肿瘤功效：为了证明施用proIL12可以导致肿瘤消退或肿瘤控制，发明人在快速生长的表达MMP的MC38结肠腺癌模型中测试了工程分子(图7A)。从肿瘤接种后的第7天开始，每3天用PBS、5mg IL-12或15mg M-L6-IL12-CBD(3倍摩尔过量)治疗具有确定肿瘤的小鼠3次。IL-12和M-L6-IL12-CBD导致所有治疗小鼠完全存活，而所有PBS治疗小鼠在第13天死亡。这些结果证实了proIL12作为单一药物是有效的，并且其功效与免疫浸润肿瘤模型中的IL-12相似。我们还在B16F10黑色素瘤模型中评估了proIL12与检查点封闭抗体aPD-1联合的抗肿瘤作用(图7B)。虽然proIL12和aPD-1都表现出了一定的肿瘤控制作用，但两种药物的联合使用显著延长了小鼠的存活时间。总之，这些数据表明，proIL12诱导抗肿瘤作用，并能与同系肿瘤模型中的检查点封闭抗体协同作用。

人肿瘤匀浆对proIL12的切割：本发明人试图研究proIL12是否可以被肿瘤裂解物切割，以及切割的产物是否可以结合至IL12R复合物并激活细胞信号传导。为了测试这一点，他们获得了快速冷冻的人类乳腺癌活检组织，以及来自同一患者的ANT(非恶性组织)的活检组织。将肿瘤和ANT在通常用于MMP激活分析的分析缓冲液中匀浆，并将裂解物的总蛋白浓度标准化。发明人将proIL12单独与肿瘤裂解物、ANT裂解物或分析缓冲液一起温育。我们还将未修饰的IL-12与肿瘤裂解物一起温育(图8)。将proIL12与人肿瘤裂解物，而不是ANT裂解物，温育，导致proIL12激活，并诱导与未修饰的IL-12水平相同的STAT4磷酸化。尽管与仅用缓冲液温育的proIL12相比，用ANT温育proIL12导致了较小的激活，但这可能是由于细胞内蛋白酶对接头/掩蔽剂的非特异性降解。然而，这些结果表明，人肿瘤匀浆能够切割proIL12，并且激活产物能够激动IL12R复合物。

工程IFNg部分激动剂通过上调MHC-I而不上调PD-L1，降低STAT1磷酸化水平并偏向抗癌活性：IFNγ是高度多效性的细胞因子，通过其对多种免疫细胞类型包括巨噬细胞、DC和T细胞的作用，成为先天免疫和适应性免疫的中枢协调者(54)。IFNγ是同二聚体(55)，涉及两种IFNγR1受体和两种IFNγR2受体，它们在所有有核细胞上组成性表达。Mendoza教授最近的工作描述了六聚体IFNγ-受体复合物的第一个完整结构，这为打破IFNγ的多效性提供了蓝图(56)。基于结构的IFNγ变体设计改变了与细胞受体结合的数量和强度，从而降低了细胞信号的强度。部分激动剂降低磷酸-STAT1信号导致肿瘤上抗原呈递所必需的MHC-1的完全上调，但限制了程序性死亡配体1(PD-L1)的表达，从而限制了免疫细胞的活性。因此，部分激动剂偏向于沿着MHC-I:PD-L1轴的抗癌性质。这些效应被证明对所有测试的细胞都有广泛的作用，包括七种癌细胞系和三种免疫细胞群(图9)。因为这些发现是基于不与小鼠受体交叉反应的人IFNγ蛋白，发明人必须首先设计部分激动剂的小鼠版本。小鼠部分激动剂的人类类似物的设计是挑战，因为没有小鼠IFNγ配体或受体的结构。此外，两个物种之间的序列同一性低至39％。他们的第一个方法是使用人类受体复合体的同源模型，我们预测并筛选了13种小鼠变体。小鼠黑色素瘤细胞系B16F10被施用2.5nM或62.5nM的野生型或突变体，但是通过表面染色没有检测到MHC-I或PD-L1的减少(数据未显示)。这项实验表明，使用同源方法进行工程设计将是挑战，应该采用新的方法。

C.结论

总之，这些研究证明了通过与细胞因子特异性受体的结构选择结构域融合实现的掩蔽细胞因子的价值。掩蔽细胞因子可以通过静脉输注施用，并优先在肿瘤中被激活。CBD延长了在肿瘤中的停留时间。我们的研究显示，在施用掩蔽细胞因子后，irAE的发生率显著降低，而抗癌效果得以保持。这为进一步详细分析被掩蔽的促炎细胞因子奠定了基础，与治疗常规免疫疗法难以治愈的肿瘤的最终目标相一致。总之，我们已经开发了通过融合细胞因子受体和细胞因子来降低细胞因子毒性的技术。肿瘤特异性蛋白酶反应位点融合激活肿瘤内的细胞因子。为了进一步改善CBD-IL-12疗法，将IL-12受体IL-12Rb1的结构域融合到IL-12上，形成IL-12Rb1-IL-12。这种融合是无活性的，但是在受体掩蔽剂和细胞因子之间包含MMP或uPA切割位点产生了前细胞因子，其可以在肿瘤微环境中被激活。我们已经证明，IL-12的免疫毒性因此降低，并且具有蛋白酶敏感接头的IL-12Rb1-IL-12融合体保留了治疗效用。

D.材料和方法

VWF A3结构域、IL-12Rb1和IL-12的重组融合蛋白的生产和纯化：如前所述进行蛋白质的生产和纯化(57)。合成编码人VWF A3结构域残基Cys1670至Gly1874(成熟VWF的907至1111)、小鼠/人IL-12、小鼠/人IL-12Rb1 FNI-II结构域、融合蛋白的序列，并通过Genscript亚克隆到哺乳动物表达载剂pcDNA3.1(+)中。编码6His的序列(SEQ ID NO:87)被添加到N-末端用于重组蛋白的进一步纯化。悬浮液适应的HEK-293F细胞通常保留在无血清的FreeStyle 293表达培养基(Gibco)中。转染当天，将细胞以1x10

体外切割的方法：重组小鼠基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9和重组人尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)购自研发中心。由于MMP2和MMP9是以酶原形式提供的，所以首先使用1mM对氨基苯汞乙酸盐(APMA，Sigma)在37℃下激活MMPs 2小时。激活后，在pH＝7.5的含有150mMNaCl、50mM Tris、10mM CaCl

小鼠和细胞系：如前所述制备小鼠和细胞系(58)。8周至12周龄的C57BL/6和C3H/HeJ从Charles River实验室获得。实验是在芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准下进行的。B16F10细胞获自美国典型培养物保藏中心，并根据说明进行培养。通过病原体测试IMPACT I(IDEXX BioResearch)检查所有细胞系的支原体污染情况。

pSTAT4评估方法：使用EasySep小鼠CD8+T细胞分离试剂盒(干细胞)从C57BL/6小鼠的脾脏中纯化小鼠CD8+T细胞。纯化的CD8+T细胞(106细胞/mL)在预包被有2μg/mLα-CD3(克隆17A2，Bioxcell)并补充有可溶性5μg/mLα-CD28(克隆37.51，BioLegend)和30ng/mL小鼠IL-2(Peprotech)的六孔板中激活3天。培养基是IMDM(Gibco)，含有10％热灭活的FBS，1％青霉素/链霉素和50μM 2-巯基乙醇(Sigma Aldrich)。培养3天后，激活的CD8+T细胞在新鲜培养基中静置6小时，并转移到96孔板中(50000个细胞/孔)。将指示量的IL-12或proIL12变体在37℃下应用于CD8+T细胞20分钟，以诱导STAT4磷酸化。立即使用BDPhosflow Lyse/Fix缓冲液在37℃下固定细胞10分钟，然后在冰上用BD Phosflow Perm缓冲液III透化30分钟。细胞用识别Tyr693磷酸化的抗pSTAT4(克隆38，BD)的Alexa Fluor(AF)647缀合抗体染色。染色在室温(RT)下在黑暗中进行1小时。在BD LSR上采集细胞，使用FlowJo(Treestar)分析数据。pSTAT4+群体的平均荧光强度(MFI)对细胞因子浓度作图。使用Prism(v8，GraphPad)拟合剂量反应曲线。

血浆细胞因子浓度分析：如前所述执行测量(58)。在每只8周的C57BL/6小鼠的背部左侧皮内注射5×10

IL-12Rb1-IL-12对B16F10肿瘤的抗肿瘤作用：如前所述执行测量(58)。在每只C57BL/6小鼠背部左侧的皮内接种重悬于30μLPBS中的总计5×10

实施例2-添加血清蛋白以延长循环。

前细胞因子可以通过CBD融合来改善，以延长在肿瘤中的停留时间，和/或通过白蛋白融合来延长循环时间。细胞因子通常在血液中的半衰期非常短(9)。因为前细胞因子技术依赖于体内(即肿瘤)的蛋白酶，所以增加注射的前细胞因子在肿瘤内的停留时间是重要的。本发明人采用了两种方法来改善CBD-细胞因子平台。第一步是将胶原蛋白结合结构域融合到前细胞因子上。如实施例1中所述，由于肿瘤脉管系统的性质，CBD可以靶向并保留肿瘤内的融合蛋白。因此，CBD-前细胞因子的活性在肿瘤内更具特异性，从而提高了疗效和安全性。这是双重肿瘤靶向系统形式。

另一个步骤是延长前细胞因子血液半衰期。因为注射的细胞因子的延长的血液半衰期将允许更多的机会接触肿瘤组织，所以假设CBD-前细胞因子的功效将进一步增强。这可以通过将白蛋白融合到CBD-细胞因子或细胞因子上来实现。因此，还预期具有延长的血液半衰期的肿瘤靶向细胞因子的这些额外方面，其仅在肿瘤微环境中有活性。

实施例3:不可切割的掩蔽细胞因子

A.背景

细胞因子生物活性的减弱可以提供毒性方面的杠杆作用，从而增加耐受性和治疗指数。通过融合抑制细胞因子-受体相互作用的结构域来实现细胞因子掩蔽。我们的策略是将受体亚基结构域(称为“M”)与感兴趣的细胞因子融合，以降低生物活性。掩蔽结构域和细胞因子通过柔性接头连接(在我们的情况下，(G

B.结果

为了评估不可切割的减毒掩蔽的IL-12的全身毒性的降低，我们用盐水(PBS)、5μgIL-12(野生型)或15μg M-(G

小鼠和人不可切割的掩蔽IL-12变体的氨基酸序列。功能性IL-12异二聚体通过编码野生型p35(或掩蔽p35)和p40的亚基的共转染获得。

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尽管上面已经在某种程度上特别地或参考一个或多于一个单独的实施方案描述了某些实施方案，但是本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下对所公开的实施方案进行多种改变。此外，在适当的情况下，上述任何实施例的方面可以与所描述的任何其他实施例的方面相结合，以形成具有相当的或不同属性并解决相同或不同问题的其它实施例。类似地，应该理解的是，上述优点和优点可以涉及一个实施方案，或者可以涉及多个实施方案。对专利出版物或其他出版物的任何引用在本文中都是通过引用该出版物的公开内容而进行的特定合并。权利要求不应被解释为包括装置加功能或步骤加功能的限制，除非这样的限制在给定的权利要求中分别使用短语“装置”或“步骤”来明确陈述。

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