一种抑制肝癌细胞增殖的smart silencer及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉一种抑制肝癌细胞增殖的smart silencer及其应用。

背景技术

根据2020年世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的全球癌症最新数据统计，虽然肝癌新发病例数是全球第六，中国第五，但是死亡病例数分别为全球第三，中国第二。相对其他常见癌症，肝癌的新发病例数占比虽低，而死亡例数占比则偏高。因此，研究其发生机制对于发现新型诊断和治疗靶标至关重要。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌最常见的病理类型，越来越多的研究发现，在肝细胞癌发生发展过程中存在人内源性逆转录病毒(HERVs)异常激活现象，提示其可能在肝细胞癌的发生过程中发挥重要作用。

siRNA也称沉默RNA,是一类长度为20～25bp的非编码双链RNA。siRNA既可在体外合成后直接导入细胞,也可通过胞内Dicer酶切割外源双链RNA形成。siRNA首先在细胞内与AGO(Argonaute)蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。随后siRNA双链的有义链被切割并降解,反义链被激活。siRNA基于碱基互补配对原则驱动RISC识别并剪切mRNA中的靶标序列,促进mRNA降解,下调特定蛋白翻译水平进而产生治疗效果。

ASO也称反义寡核苷酸，是一类长度为13～25nt的非编码单链寡核苷酸分子,其调控机制分为核糖核酸酶H(ribonuclease H,RNase H)依赖型和非RNase H依赖型。前者通过ASO与mRNA互补结合,募集RNase H剪切mRNA阻断靶基因翻译。后者主要利用ASO的空间位阻效应调控转录,使pre-mRNA发生特异性剪切,抑制蛋白质翻译；此外,ASO也可通过抑制mRNA与关键酶之间的相互作用阻止mRNA翻译。自1978年ASO的作用被发现以来,已有多个ASO药物上市并展现出良好的治疗效果。Etepliren作为第一个获批用于治疗杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy,DMD)的药物,是一种磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(phosphoramidite morpholino oligonucleotides,PMO)，通过靶向结合pre-mRNA的外显子并促进其发生跳跃剪接,将高致病性的移框缺失转变为低致病性的同框缺失,让细胞得以产生整体结构缩短但仍保存部分功能的抗肌萎缩蛋白来发挥治疗作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制肝癌细胞增殖的smart silencer及其应用。

第一方面，本发明提供了沉默或抑制LncMER52D表达的物质在制备如下任一种功能的产品中的应用：

1)治疗肝癌；

2)抑制肝癌细胞增殖；

3)抑制肝癌细胞迁移；

4)抑制肝癌细胞侵袭；

所述LncMER52D的核苷酸序列为序列1。

上文所述应用中，所述沉默或抑制LncMER52D表达的物质为Smart silencer，其包括序列2-序列7所示的核酸分子。

第二方面，本发明提供了一种产品，其活性成分为第一方面中所述沉默或抑制LncMER52D表达的物质。

上文所述产品的功能为如下至少一种：

1)治疗肝癌；

2)抑制肝癌细胞增殖；

3)抑制肝癌细胞迁移；

4)抑制肝癌细胞侵袭。

第三方面，本发明提供了LncMER52D作为靶点在开发治疗肝癌药物中的应用。

第四方面，本发明提供了一种Smart silencer，其包括序列2-序列7所示的核酸分子。

第五方面，本发明提供了第四方面所述的Smart silencer在抑制LncMER52D表达中的应用。

上文中，Smart silencer由三条siRNA(核苷酸序列分别为序列2-4)和三条ASO(核苷酸序列分别为序列5-7)按照摩尔比为1:1:1:1:1:1的混合，溶解到RNase-free H

本发明针对于LncMER52D，通过体外设计合成三条siRNA和三条ASO形成Smartsilencer的混合物，并通过转染的方式递送到细胞中，以达到降低靶标基因LncMER52D表达的目的，发现其能够抑制肝癌细胞增殖、迁移和/或侵袭，可以作为治疗肝癌的候选药物。

附图说明

图1为干扰后细胞系荧光定量PCR验证。

图2为细胞划痕实验验证Smart silencer干扰肝癌细胞中LncMER52D的功能。

图3为Transwell迁移实验验证Smart silencer干扰肝癌细胞中LncMER52D的功能。

图4为Transwell侵袭实验验证Smart silencer干扰肝癌细胞中LncMER52D的功能。

图5为集落形成实验验证Smart silencer干扰肝癌细胞中LncMER52D的功能。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、LncMER52D的发现

发明人经过大量的研究，发现LncMER52D，其核苷酸序列为序列1。

序列1

TCAGCCAGCAGTACAGCCATGGTGCCCACCCCACGAGGGCTCTGGGTTTCTATGCCTCTGGAGGTGGCTCTGCACGTGGTCACTCATGGCTGGGTCCCCAGTTCCACCCTGCATCAGGGTAATGCTGAACCTGAAACTCCCAGTGGCTGGGCCCGGGGCCCGTGATCCACTCCTGGAGGTGCCCCATGGGTAGGACCTTGAGCCAGGTGAGGGTGAGCCCCAGGATGGAGATCACAGTGATGTCGCCCCTGCCCTGGATGCCAGCCTGGGCCCAGCGAGGACTTGGAGCCCTCGGCCCAGGTTGCGAGGGTGTGCGGCCGGGGTTGCATGCTCCATGGAGCCGGCAGGAGCTGGGAGCAGGCAGCAGTCCAAGCTGGGGCTGTGGACCCAGGCCTCCCTCTGCTCTTGGGGGTTGGGAGCGGGCAGGAGCCCTGCCCATCCCCAGGCACAGCTGCAACTGCCCAAGTCAGTGCTGTGGACCTAGGCATCTCTGTACTCTTTGGGACCTGGGAAGGGCCCCCACCCCGGGCCTGCAGGCTCAGAAGTGCCTGCTCCCACTGCCTGGTTTCTCCTCACTGTTAGTGCCTGCTCCTATCTTGGAGCAATGTGGGGCAGAGCCCAGGTGCTGTCACAGCCTGGCCAGAGGTGCACATGCTTGGGACAGCACTGACACAACAGCCCCCTGTCGCCTTGATCCCCTCTGGATTTTGGGCACCAAGAAGCACAAGAGGGAGCCAAAGAGGGTGCTGAGGACAGCCTGGCACTGGCCTGCAGTTGCCACTTGGTGCAAGCAGCCTGGGTACCATGGACTGCTACACGGACTGCTGCAGGATCCTGGGTGGAAGGGGGCAGGTCCCTGGTGAGGCCCCACCTTCAGGCCAGGGAGGGCCTGAAGGCTGAGGGCTGGGCTTCCAGTCCCATTGACTGAAGTGGGAGCTTGTGGTGCCTTTTCCAGGCCTACCCATGGCTGCCCATGGACCAATCAGCACATGTTTCCTCCCTTTGAGTCCCATAAAAGCCCCAGGATCAGCCAGAACAGAACAGACCATGGGACAACCAGCTGCAGAGAGGAGCTACTCTCTGTGCTAGGAGCTGAACACATGATGGGACACCCTGGCTGCAGAAAGGAGCTGCCCCCTGCAGGATACTGAGCTGTTCTATGACTCACTAAAGCTTCTCTTCATCTTGCTCACCCTTCACTTGTCTGCATATCTCATTCTTCCTAGTTGCAGGACAAGAACTTGGGGCCTGCCGAATGGCAAGGCTAAAAGAACAGTAACACAAACAGGGCTGAAACATGCCCCTTGCTTGCCACATTGTGGGTGAAGGGAAGGAGAGAGGAGCTGTGGCCCTTTGAGGAGCCTAGACCTGGGAACTCCCTGAGCCAGAGCTGTGACTCCCTCTTTGGGGCCCTATGGTTCCTGATGTCTCCGAGCTCCTGGACATCAATGCATTCCCTGGTGATAGCCAGGGAAGCTGCTGTGATGCACCTGGTCCAGCTACACCCTTGCAGAGAGCTGGTGCCCATGCTGCACCTGGAGCTGCCCGTGCCACAGCAGCAGCTGGTGTGTCTGACTGCTCAGTGGCCAGGCCCCACACTTGCTCACACACCCCTCGCTGCTCCACGTATGACTGACAGTCTCCCTTGGAGGCGTGGGATCCAGGTCACTAGCTGAGCGCAGCCTGCCAGTCTGAGTGGGTGGAACAAGCCCAGTGGGCCCTAGCAAAACTTGGGGCAAGGGCACCACTGGCCACAAATTTCCAGCCAGAAAAGCGACACCCCAAAGATCCCATAGCATTATTACATCTTTTTGCCCCTACAATGGGTAAAAGACTATGTTCAAAATTTTCATCATGTTTTGAAATATATTGGTTCTCTTTTGTGCAG

实施例2、Smart silencer的设计合成及功能验证

一、Smart silencer的设计合成

根据LncMER52D设计合成Smart silencer(锐博生物，Inc3CM001)和NC(锐博生物，Inc3N0000001-1-5)。

上述Smart silencer由三条siRNA和三条ASO按照摩尔比为1:1:1:1:1:1的混合，溶解到RNase-free H

三条siRNA和三条ASO的核苷酸序列分别如下表1所示：

表1为三条siRNA和三条ASO的核苷酸序列

二、Smart silencer转染

1)使用含10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific，26010074)并且不含双抗的完全培养基(Thermo Fisher Scientific，2186870)将Huh-7细胞(普诺赛，CL-0120)调整至1.5*10^5接种至12孔板中，每孔1mL。

2)放置24h使得细胞汇合度约为40-60％。

3)分别用50μL Opti-MEI(Thermo Fisher Scientific，2085152)低血清培养基稀释Smart silencer(锐博生物，Inc3CM001，浓度为20μM)和NC(锐博生物，Inc3N0000001-1-5，浓度为20μM)，轻轻混匀。

4)使用前轻轻摇匀Lipofectamine 2000(Invitrogen，200011668-019)，然后取3μl Lipofectamine 2000在50μl Opti-MEI培养基中稀释，室温孵育5分钟。注意：请在25分钟内进行下一步操作。

5)将50μL步骤3)得到的稀释的Smart silencer或NC和50μl步骤4)得到的稀释的Lipofectamine 2000混合(使每孔总体积为100μl)，轻轻混匀，室温放置5分钟即可(溶液可出现浑浊)，得到转染液。

注意：转染复合物常温下可在6小时内保持稳定。

6)在上述2)得到的孔板的每孔细胞中加入上述5)得到的100μl转染液，轻轻摇匀。

7)转染6小时后可更换培养基，可以根据细胞状态延长换液时间。

8)转染后24小时后，得到Smart silencer干扰后细胞和NC干扰后细胞，进行后续实验。

三、干扰后细胞系荧光定量PCR验证

将上述转染24小时后的细胞(Smart silencer干扰后细胞和NC干扰后细胞)进行荧光定量PCR，以检测LncMER52D表达水平。具体步骤如下：

1、总RNA提取

采用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TAKARA，9767)进行RNA提取，具体步骤如下：

1)将12孔板上待测的细胞吸出培养液，使用1×PBS清洗一次。然后向培养细胞中加入350μL的裂解Buffer RL(已加入50×DTT Solution)，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，再使用移液枪吹打细胞使其脱落。最后将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，裂解液室温静置2min。

2)将gDNA Eraser Spin Column安放到2mL的收集管上。将裂解液转移入到gDNAEraser Spin Column中。12000rpm离心1min。

3)移除gDNA Eraser Spin Column。保留2mL的收集管中的滤液。加入350μL70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。

4)立即将混合液全部转入到RNA Spin Column(含2mL的收集管)中。12000rpm离心1min，弃滤液。将RNA Spin Column放回到2mL的收集管中。

5)将500μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。将600μL的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。再次加入600μL的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。

6)将RNA Spin Column重新安置于2mL的收集管上，12000rpm离心2min。将RNASpin Column置于1.5mL离心管上，在RNA Spin Column膜中央处加入70μL的RNase FreedH2O，室温静置5min。12000rpm离心2min洗脱RNA。将收集的RNA保存于-80℃冰箱中。

2、cDNA合成

采用PrimeScript

1)去除基因组DNA反应

按如下成分于冰上配制反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2μL、gDNA Eraser1μL、Total RNA 5μL、RNase Free water补足至10μL。将反应体系置于PCR仪中42℃，2min；4℃保存。

2)反转录反应

按如下成分于冰上配制反应体系：上述反应液10μL、PrimeScript RT Enzyme MixI 1μL、RT primer Mix 1μL、5×PrimeScript Buffer 2 4μL、RNase Free dH2O4μL。反应条件如下：42℃，15min；85℃，5s；4℃保存。

3、荧光定量PCR检测

将获得的不同单克隆细胞合成的cDNA用RNase Free H

MER52D-F：TCTTCATCTTGCTCACCCTTCAC；

MER52D-R：GCTCGGAGACATCAGGAACCAT；

β-actin-F：CCACGAAACTACGTTCAACTCC；

β-actin-R：GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT。

反应体系如下：TB Green Premix Ex Taq(2×)10μL、引物F(10μM)0.4μL、引物R(10μM)0.4μL、cDNA模板2μL、RNase Free Water7.2μL。反应条件如下：加热至95℃，30s预变性；95℃解链5s；60℃退火20s；共40个循环；72℃延伸3min，4℃保存。

4、数据处理

每组样品3个复孔重复，分别进行3次独立的检测，以β-actin作为内参基因，通过2-ΔΔCT的计算方法得到每个样本的相对表达量。各组标准化后的数据利用GraphPadPrism 8.0进行单因素方差分析并作图。P<0.05有显著性差异。

LncMER52D表达量的光定量PCR检测结果如图1所示，可以看出，与NC干扰后细胞(图中记作阴性对照组NC)相比，Smart silencer干扰后细胞(图中记作Smart silencer)能够有效沉默肝癌细胞系中的LncMER52D的表达，差异有统计学意义(P<0.01)。

四、干扰后细胞表型实验

1、划痕实验

1)将上述二转染24h后得到的Smart silencer干扰后细胞和NC干扰后细胞进行实验。

2)用marker笔在12孔板中均匀的划横线，共3条线，横穿过孔。

3)等细胞覆盖率达到99％的时候，用200uL枪头的枪尖在12孔板底部进行划线，使用的力道尽量一致，一次性划出宽度比较一致的直线；

4)使用PBS对划痕后的每孔清洗3遍，清洗后加入新鲜的培养基，随后在0h、24h时间点在显微镜下进行拍照。

迁移率＝(初始划痕面积-24h划痕面积)/初始划痕面积

迁移面积比例＝实验组的迁移率/对照组的迁移率

实验组为Smart silencer干扰后细胞，对照组为NC干扰后细胞。

划痕实验结果如图2所示，左图为拍照图，右图为迁移面积比例统计图，结果表明：与NC干扰后细胞(图中记作NC)相比，划痕后24h后Smart silencer干扰后细胞(图中记作Smart silencer)迁移率明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明Smart silencer抑制细胞迁移。

2、Transwell迁移实验

1)将上述二转染24h后得到的Smart silencer干扰后细胞和NC干扰后细胞进行实验。

2)消化后以1500rpm的转速离心收集已处理的细胞，弃去上清，用1ml PBS重悬细胞，再次离心弃去上清，用500μL不含血清不含双抗的培养基将细胞轻轻吹打均匀，吸取50μL以检测细胞密度，将细胞调整密度为2*10^5。

3)在24孔板(Corning,3422)孔中加入600μL含10％血清的培养基。

4)将Transwell小室放入孔中，注意Transwell小室底部的膜与培养基之间不能存在气泡。

5)将调整好细胞密度的细胞悬液每孔200μL加入Transwell小室中，将板子放入细胞培养箱培养24h。

6)培养24h后取出小室，用棉签擦去小室内部的细胞，使用PBS冲洗3次。

7)将小室置于4％组织细胞固定液(索莱宝，P110)中，固定30min。

8)固定后取出小室，用1％结晶紫染色液(索莱宝，G1062)染色20min。

9)用双蒸水清洗Transwell上室3次，洗掉结晶紫的背景染色，晾干后在显微镜下观察。随机选取5个视野拍照，计数染色的穿膜细胞数(即为迁移细胞数)。

结果如图3所示，左图为拍照图，右图为迁移细胞数统计图，可以看出，与NC干扰后细胞(图中记作NC)相比，Smart silencer干扰后细胞(图中记作Smart silencer)穿过基底膜的细胞数显著减少，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明Smart silencer抑制细胞迁移。

3、Transwell侵袭实验

1)包被基底膜：将50mg/L的基质胶与无血清的DMEM/F按照1:99稀释包被transwell小室底部膜的上室面(整个过程注意冰上操作，否则Matrigel在10℃以上即会凝固)，细胞培养箱中孵育1h，吸弃上清。

2)将上述二转染24h后得到的Smart silencer干扰后细胞和NC干扰后细胞进行实验。

3)消化后以1500rpm的转速离心收集已处理的细胞，弃去上清，用1ml PBS重悬细胞，再次离心弃去上清，用500μL不含血清不含双抗的的培养基将细胞轻轻吹打均匀，吸取50μL以检测细胞密度，将细胞调整密度为2*10^5。

4)在24孔板(Corning,3422)孔中加入600μL含10％血清的培养基。

5)将Transell小室放入孔中，注意Transell小室底部的膜与培养基之间不能存在气泡。

6)将调整好细胞密度的细胞悬液每孔200μL加入Transwell小室中，将板子放入细胞培养箱培养24h。

7)培养24h后取出小室，用棉签擦去小室内部的细胞，使用PBS冲洗3次。

8)将小室置于4％组织细胞固定液(索莱宝，P110)中，固定30min。

9)固定后取出小室，用1％结晶紫染色液(索莱宝，G1062)染色20min。

10)用双蒸水清洗Transwell上室3次，洗掉结晶紫的背景染色，晾干后在显微镜下观察。随机选取5个视野拍照，计数染色的穿膜细胞数(即为侵袭细胞数)。

结果如图4所示，左图为拍照图，右图为侵袭细胞数统计图，可以看出，与NC干扰后细胞(图中记作NC)比较，Smart silencer干扰后细胞(图中记作Smart silencer)穿过基质胶和基底膜的细胞数显著减少，差异具有统计学意义。

4、集落形成实验

1)将上述二转染24h后得到的Smart silencer干扰后细胞和NC干扰后细胞进行实验。

2)转染后，将Huh-7细胞以每孔5000个细胞的密度种植到6孔板中，并培养7天。

3)7天后，弃去培养基用PBS清洗2遍，用4％组织细胞固定液(索莱宝，P110)固定细胞20min，在1％结晶紫溶液(索莱宝，G1062)中染色。

4)人工计数菌落数。

集落形成实验结果如图5所示，左图为拍照图，右图为菌落细胞数统计图，结果表明：与NC干扰后细胞(图中记作NC)相比，Smart silencer干扰后细胞(图中记作Smartsilencer)的数显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。表明，Smart silencer沉默LncMER52D显著抑制了肝癌细胞的增殖。