还原响应性抗胰腺癌前体药物及其自组装纳米递药系统及制备方法和应用

本申请要求于2023年01月11日提交申请号为CN202310051450.2、发明名称为“一种还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及还原响应性抗胰腺癌前体药物及其制备方法和应用、还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统及其制备方法和应用。

背景技术

数十年来，科研人员一直致力于研制更有效、毒性更低的抗肿瘤药物。多年来的临床实践表明，小分子化学药物通过剂型改造可提高生物利用度、降低毒性，特别是纳米技术的应用，提高了部分临床患者治疗的有效性和安全性，但是对于“癌中之王”胰腺癌的治疗，一直尚未取得预期进展，死亡率居高不下。

化疗是临床抗肿瘤治疗的重要手段之一，拓扑异构酶抑制剂伊立替康(CPT-11)是晚期大肠癌(结直肠癌)的一线用药，也可用于术后的辅助化疗。然而，CPT-11最终未被批准作为晚期或转移性胰腺癌的二线治疗药物(Milano G,et al.Liposomal irinotecan(Onivyde):Exemplifying the benefits of nanotherapeutic drugs[J].CancerSci.2022；113(7):2224-31.)。这主要是由于CPT-11在体内通过羧酸酯酶代谢为活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的效率太低(2～8％)(Innocenti F,etal.Comprehensive pharmacogenetic analysis of irinotecan neutropenia andpharmacokinetics[J].JClin Oncol.2009；27(16):2604-14.)。尽管SN38的药效是CPT-11的100～1000倍，但因其水溶性差(11～38μg/mL)、稳定性差(pH值>6时无活性)和毒副作用(骨髓抑制和腹泻)，SN38作为抗癌药物的临床应用受到很大局限。因此，开发安全、有效的SN38递药系统具有重要的临床意义。

纳米递药系统具有缓释、被动靶向、提高生物利用度、延长体内循环时间、改善药动学行为以及减少药物毒副作用等优点。因此，近年来开发合适的抗肿瘤纳米递药送系统已经成为国内外的研究热点。目前上市的一些抗肿瘤纳米递药系统，如伊立替康脂质体注射液

发明内容

本发明克服现有技术的不足，公开了一种还原响应性抗胰腺癌前体药物及其制备方法和应用、还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统及其制备方法和应用。本发明一方面增加了SN38在水中的溶解度以及在正常组织中的稳定性，赋予了前药肿瘤细胞靶向的还原响应性药物释放特性；另一方面通过纳米技术，实现了药物的肿瘤靶向分布、改善了药动学行为，达到增效减毒的效果。

本发明提供了一种还原响应性抗胰腺癌前体药物，结构式如下：

本发明提供了上述技术方案所述还原响应性抗胰腺癌前体药物的制备方法，通过两步反应合成得到，包括以下步骤：将β-巯基乙醇和正丁硫醇进行合成反应，得到含有还原响应性二硫键的醇；通过碳酸酯键，将一分子7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)与两分子含有还原响应性二硫键的醇进行酯化反应，得到所述还原响应性抗胰腺癌前体药物。

本发明将β-巯基乙醇和正丁硫醇进行合成反应，得到含有还原响应性二硫键的醇。

在本发明中，所述β-巯基乙醇和正丁硫醇的摩尔比优选为1：0.5～2，更优选为1：1～1.5。

在本发明中，所述合成反应采用的有机溶剂优选包括四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷和1,4-二氧六环中的一种或几种；所述β-巯基乙醇的物质的量与有机溶剂总量的体积之比优选为1mol：1～10L，更优选为1mol：2.5～7.5L。

在本发明中，所述合成反应的温度优选为-50～0℃，更优选为-30～-20℃；所述合成反应的时间优选为5～60min，更优选为10～15min。

在本发明中，所述合成反应优选在还原剂和三氯乙腈尿酸存在条件下进行。在本发明中，所述还原剂优选包括氢化钠、氢化钾和氢化锂中的一种或几种，所述β-巯基乙醇和还原剂的摩尔比优选为1：0.5～2，更优选为1：1～1.5。在本发明中，所述β-巯基乙醇和三氯乙腈尿酸的摩尔比优选为1～6：1，更优选为2～4：1；所述三氯乙腈尿酸优选以三氯乙腈尿酸溶液形式使用，所述三氯乙腈尿酸溶液中的溶剂的可选种类优选与所述合成反应用有机溶剂的可选种类相同，所述三氯乙腈尿酸溶液的浓度优选为0.1～1mol/L，更优选为0.25～0.75mol/L。

在本发明中，所述将β-巯基乙醇和正丁硫醇进行合成反应具体优选包括：将还原剂与有机溶剂混合，降温至-50～0℃(更优选为-20℃)，在保护气氛下，加入正丁硫醇第一合成反应，然后加入三氯乙腈尿酸溶液进行第二合成反应。在本发明中，所述保护气氛优选包括氮气、氩气或氦气。在本发明中，所述第一合成反应的时间优选为1～10min，更优选为2～5min；所述第二合成反应的时间优选为4～50min，更优选为5～30min，进一步优选为10～15min，两次合成反应的总时间优选为5～60min，更优选为10～20min；所述第一合成反应和第二合成反应的温度独立地优选为-50～0℃，更优选为-30～-20℃。

完成所述合成反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理优选包括：将所述合成反应得到的反应液浓缩，利用酸溶液将所得浓缩物的pH值调节至5～8(更优选为6.5～7.5)，有机溶剂萃取，将所得有机相进行干燥剂干燥后硅胶柱层析分离，得到含有还原响应性二硫键的醇。在本发明中，所述酸溶液优选包括盐酸溶液，本发明对于所述盐酸溶液的浓度没有特殊限定，能够将反应液的pH值调节至5～8即可。在本发明中，所述萃取用有机溶剂优选包括二氯甲烷和/或乙酸乙酯。在本发明中，所述干燥剂优选包括无水硫酸镁和/或无水硫酸钠。在本发明中，所述硅胶柱层析分离采用的洗脱剂优选包括乙酸乙酯-石油醚混合溶剂，所述乙酸乙酯-石油醚混合溶剂中乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1：1～8，更优选为1：2～6；所述硅胶柱层析分离的洗脱方式优选为梯度洗脱。

得到含有还原响应性二硫键的醇后，本发明通过碳酸酯键，将一分子7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)与两分子含有还原响应性二硫键的醇进行酯化反应，得到所述还原响应性抗胰腺癌前体药物。

在本发明中，所述7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)与含有还原响应性二硫键的醇的投料摩尔比优选为1：5～20，更优选为1：10～15。

在本发明中，所述酯化反应采用的有机溶剂优选包括四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷和1,4-二氧六环中的一种或几种，所述有机溶剂优选为无水有机溶剂；所述7-乙基-10-羟基喜树碱的物质的量与有机溶剂总量的体积之比优选为1mol：1～10L，更优选为1mol：2.5～7.5L。

在本发明中，所述酯化反应的温度优选为15～45℃，更优选为25～35℃；所述酯化反应的时间优选为0.5～6h，更优选为2～2.5h。

在本发明中，所述酯化反应优选在有机碱和三光气存在条件下进行。在本发明中，所述有机碱优选包括4-二甲氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶和9-氮杂久洛尼定的一种或几种；所述7-乙基-10-羟基喜树碱与含有还原响应性二硫键的醇的摩尔比优选为1：10～50，更优选为1：15～22.5。在本发明中，所述7-乙基-10-羟基喜树碱与三光气的摩尔比优选为1：1～5，更优选为1：2～3.3。

在本发明中，所述将一分子7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)与两分子含有还原响应性二硫键的醇进行酯化反应优选包括：在保护气氛下，将化合物1、4-二甲氨基吡啶和有机溶剂混合，在冰浴条件下加入三光气，进行第一酯化反应，然后在冰浴条件下加入7-乙基-10-羟基喜树碱溶液进行第二酯化反应。在本发明中，所述7-乙基-10-羟基喜树碱溶液中溶剂的可选种类优选与所述酯化反应用有机溶剂的可选种类相同，所述7-乙基-10-羟基喜树碱溶液的浓度优选为0.1～1mol/L，更优选为0.25～0.75mol/L。在本发明中，所述第一酯化反应的时间优选为5～30min，更优选为10～15min；所述第二酯化反应的时间优选为25min～5.5h，更优选为0.5～4h，进一步优选为1～2h，两次反应的酯化总时间优选为0.5～6h，更优选为1.5～2.5h；所述第一酯化反应和第二酯化反应的温度独立地为15～45℃，更优选为25～35℃。

完成所述酯化反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理优选包括：将所述酯化反应得到的反应液的pH值调节至pH5.0～8.0(更优选为6.5～7.5)，有机溶剂萃取，将所得将所得有机相进行干燥剂干燥后硅胶柱层析分离，将所得含产物洗脱液浓缩至恒重，进行重结晶，将所得结晶产物进行洗涤后干燥，得到含有还原响应性二硫键的醇。在本发明中，所述pH值调节采用的酸液优选包括盐酸，本发明对于所述盐酸的浓度没有特殊限定，能够将反应液的pH值调节至5～8即可。在本发明中，所述萃取用有机溶剂优选包括二氯甲烷和/或乙酸乙酯。在本发明中，所述干燥剂优选包括无水硫酸镁和/或无水硫酸钠。在本发明中，所述硅胶柱层析分离采用的洗脱剂优选包括甲醇-二氯甲烷混合溶剂，所述甲醇-二氯甲烷混合溶剂中甲醇和二氯甲烷的体积比优选为1：1～8，更优选为1：2～4。在本发明中，所述重结晶优选为加入有机溶剂进行重结晶；所述有机溶剂优选包括甲醇、乙酸乙酯和乙腈中的一种或几种，在本发明中，所述洗涤用溶剂可选种类优选包括所述用于重结晶的有机溶剂的可选种类相同。在本发明中，所述干燥的温度优选为35～60℃，更优选为40～50℃，本发明对于所述干燥的时间没有特殊限定，干燥至恒重即可。

本发明提供了一种还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统，包含：(a)还原响应性抗胰腺癌前体药物；(b)液体溶剂；(c)两亲性高分子材料。

在本发明中，所述还原响应性抗胰腺癌前体药物为上述技术方案所述的还原响应性抗胰腺癌前体药物或上述技术方案所述制备方法制得的还原响应性抗胰腺癌前体药物。

在本发明中，所述液体溶剂优选为生理盐水或磷酸盐缓冲液或注射用水；所述两亲性高分子材料优选包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)。

在本发明中，所述前体药物与两亲性高分子材料的质量比优选为10:0～10:5，更优选10:0.5～2，具体优选为10:0、10:0.5、10:1、10:2、10:3、10:4或10:5。

本发明提供了上述技术方案所述还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的制备方法，包括如下步骤：

1)将还原响应性抗胰腺癌前体药物与一定质量的两亲性高分子材料溶于一定体积与水互溶的助溶有机溶剂中形成溶液；

2)移取上述溶液逐滴滴入液体溶剂中，并不断搅拌；

3)用去离子水透析除去助溶有机溶剂，得到还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统。

如无特殊说明，本发明采用的原料均为市售商品。

在本发明中，所述助溶有机溶剂优选为与水混溶的二甲基亚砜、乙醇、乙腈和N-甲基吡咯烷酮中的任意一种，更优选二甲基亚砜；所述助溶有机溶剂与液体溶剂的体积比优选为1:1～1:100，更优选1:15～35；所述搅拌的速度优选为50～1500rpm，更优选为600～1200rpm；所述去离子水透析时间优选为12～72h，更优选为36～60h；所述超滤离心所使用的超滤离心管截留分子量优选为5000～100000道尔顿，更优选为10000～100000道尔顿；所述透析的目的是除去助溶有机溶剂和游离的还原响应性抗胰腺癌前体药物。

在本发明中，所述制备方法优选还包括：将所述还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统通过超滤离心得到制剂浓缩液，再用葡聚糖凝胶柱层析进行分离，得到除去游离还原响应性抗胰腺癌前体药物与两亲性高分子材料的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统浓缩液。在本发明中，所述超滤离心的离心转速优选为5000～10000rpm，更优选为6000～8000rpm；所述葡聚糖凝胶的型号优选为G25～G200，更优选为G50。

本发明还提供了上述技术方案所述还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为胰腺癌。在本番中，所述还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的给药方式优选为注射给药。在本发明中，所述还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统制备成合适的注射剂，所述注射剂优选为静脉注射剂。

SN38是天然抗肿瘤药物喜树碱(CPT)的衍生物之一，抗肿瘤活性显著，是临床上市药CPT-11的100～1000倍。但因其水溶性差(11～38μg/mL)、稳定性差(pH值>6时无活性)、毒副作用强，极大地限制了临床应用，因此需要对其进行结构修饰。尽管SN38前药CPT-11在结肠癌的治疗上取得了较好的效果，但其体内代谢转化出SN38的效率依旧太低(2～8％)。因此，SN38进一步结构修饰和剂型改进的目标是在改善水溶性、增加药物稳定性的同时提高药物对肿瘤组织的靶向性和有效性。相比之下，本发明提供的还原响应性抗胰腺癌前体药物进步在于通过引入二硫键，赋予了小分子前药还原响应性药物释放特性，使前药能够在肿瘤细胞内迅速降解出活性抗肿瘤药物SN38，避免了在其他正常组织细胞内的降解，安全性提高。

本发明提供的肿瘤组织还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统，不仅解决了原形药物SN38的水溶性差、稳定性差的缺点，还通过纳米技术实现了药物对肿瘤组织的高渗透高滞留效应实现被动靶向。相较于游离小分子药物CPT-11，纳米递药系统延长了药物的体内循环时间，改善了药动学行为，提高了生物利用度，降低了毒副作用。此外，该还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统还具备肿瘤还原性微环境响应的药物释放特性，提高了原形药物在靶部位的转化率，增强了药效；同时降低了SN38对正常组织细胞的毒性，在安全的前提下提高了体内给药剂量，达到增效减毒的效果。

综上，相比于现有的技术，本发明提供的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统取得了长足的进步。在制备工艺过程中考察了多个因素和水平，得到了优化的制备工艺；进一步从体外、体内两个角度深入评价并比较了本发明制备的纳米递药系统和对照药物的药效。因此，对于同领域的研究人员而言，这不是显而易见的。

附图说明

图1为还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的透射电子显微镜图；

图2为还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的稳定性考察结果图，其中，(A)为储存稳定性；(B)为稀释稳定性；

图3为还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统在不同释放介质中的药物释放曲线；

图4为还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统在胰腺癌细胞中的细胞摄取量和降解量，其中，(A)为Panc-1细胞中；(B)为BxPC-3细胞中；

图5为还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统在胰腺癌细胞(Panc-1)裸鼠皮下移植瘤模型的体内抗肿瘤药效，其中，(A)为肿瘤体积变化曲线；(B)为小鼠体重变化曲线；

图6为还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统治疗胰腺癌的体内安全性考察结果图，其中，(A)为各组织器官的苏木精-伊红(H&E)染色图；(B)为肝脏和肾脏功能指标数值图；

图7为荧光标记的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的体内组织分布图；其中，(A)为荧光标记的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统随时间变化的体内荧光强度分布图；(B)为实验终点时离体的心(H)、肝(Li)、脾(S)、肺(Lu)、肾(K)及肿瘤(T)的荧光强度图；

图8化合物1的氢谱图；

图9为还原响应性抗胰腺癌前体药物的氢谱图；

图10为还原响应性抗胰腺癌前体药物的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

还原响应性抗胰腺癌前体药物的制备，反应路线如下：

含有还原响应性二硫键的醇(化合物1)的反应条件(a)：的反应条件氢化钠/正丁硫醇/三氯乙腈尿酸/β-巯基乙醇/四氢呋喃/乙腈/-20℃/氮气；还原响应性抗胰腺癌前体药物(化合物2)的反应条件(b)：4-二甲氨基吡啶/三光气/无水二氯甲烷/无水N,N-二甲基甲酰胺/室温/氮气。

将氢化钠和四氢呋喃置于-20℃条件下搅拌混合，在氮气保护下，加入正丁硫醇反应1min，再加入三氯乙腈尿酸乙腈溶液(浓度为0.1mol/L)，立即加入β-巯基乙醇继续反应10min，将所得反应液直接旋干，以稀盐酸(33wt％)洗涤至中性，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，加无水硫酸镁干燥，过滤，将所得滤液浓缩，硅胶柱层析分离，收集产物组分洗脱液浓缩至恒重，得到含有还原响应性二硫键的醇(化合物1)。其中，β-巯基乙醇、正丁硫醇、氢化钠和三氯乙腈尿酸的摩尔比为1：1：1：1/3；β-巯基乙醇与四氢呋喃的用量比为1mol：10L；硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为6:1、4:1和2:1。

在保护气氛下，将化合物1、4-二甲氨基吡啶、新制的无水二氯甲烷搅拌混合，在冰浴条件下加入三光气，在室温条件下反应15min，继续在冰浴条件下加入7-乙基-10-羟基喜树碱的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液(浓度为0.1mol/L)，在室温条件下反应2h，反应液以稀盐酸调至中性，油泵旋干，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤，将所得浓缩浓缩至恒重，硅胶柱层析分离，收集产物组分洗脱液旋干，使用甲醇重结晶并淋洗3次，在45℃条件下真空干燥至恒重，得到具有式I所示结构的还原响应性抗胰腺癌前体药物(化合物2)。7-乙基-10-羟基喜树碱：中间体：4-二甲氨基吡啶：三光气摩尔比为1：10：22.5：3.3；7-乙基-10-羟基喜树碱与无水二氯甲烷的用量比为1mol：10L；硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的体积比依次为4:1、2:1和1:1。

通过核磁共振氢谱(400MHz,CDCl

以高相液相色谱法测定还原响应性抗胰腺癌前体药物(化合物2)的纯度。色谱条件为：色谱柱Agilent E clipse XDB-C18(5μm，4.6×250mm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.2v/v％甲酸-水＝60:40，洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～12min，流动相A体积分数为60％；12～12.01min，流动相A体积分数由60％增加至100％；12.01～25min，流动相A体积分数为100％，25～25.01min，流动相A体积分数由100％降低至60％2；5.01～40min，流动相A体积分数为60％；流动相流速为1mL/min；柱温为30℃；检测波长为372nm；进样量为20μL。图10为原响应性抗胰腺癌前体药物(化合物2)的高效液相色谱图。扣除甲醇溶剂峰后，以峰面积归一化法计算还原响应性抗胰腺癌前体药物(化合物2)(t＝14.295min)的含量为91.14％。

实施例2

还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的制备：将还原响应性抗胰腺癌前体药物溶于适量的二甲基亚砜中得到10mg/mL还原响应性抗胰腺癌前体药物溶液，移取200μL逐滴滴入5mL生理盐水中，并不断搅拌，搅拌速度为1000rpm，即得还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统分散液，随后转入透析袋中，利用去离子水透析48h，即得还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统。

实施例3

含有DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的的制备：将还原响应性抗胰腺癌前体药物和两亲性高分子材料DSPE-PEG2000溶于适量的二甲基亚砜中得到还原响应性抗胰腺癌前体药物溶液，移取200μL逐滴滴入5mL超纯水中，并不断搅拌，搅拌速度为1000rpm，即得含5％DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统分散液，随后转入透析袋中，利用去离子水透析48h，得到含5％DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统。其中，还原响应性抗胰腺癌前体药物溶液中还原响应性抗胰腺癌前体药物的浓度为10mg/mL，DSPE-PEG2000的质量占还原响应性抗胰腺癌前体药物质量的5％。

实施例4

含有DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的制备：将还原响应性抗胰腺癌前体药物和两亲性高分子材料DSPE-PEG2000溶于适量的二甲基亚砜中得到含10％(w/w)DSPE-PEG2000的10mg/mL还原响应性抗胰腺癌前体药物溶液，移取200μL逐滴滴入0.2-20mL超纯水中，优选5mL，并不断搅拌，搅拌速度为500-1500rpm，优选1000rpm，即得含10％DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统分散液，随后转入透析袋中，利用去离子水透析48h，得到含10％DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统。

实施例5

含有DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的制备：将还原响应性抗胰腺癌前体药物和两亲性高分子材料DSPE-PEG2000溶于适量的二甲基亚砜中得到含20％(w/w)DSPE-PEG2000的10mg/mL还原响应性抗胰腺癌前体药物溶液，移取200μL逐滴滴入5mL超纯水中，并不断搅拌，搅拌速度为1000rpm，即得含20％DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统分散液，随后转入透析袋中，利用去离子水透析48h，即得含20％DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统。

实施例6

通过实施例4制备的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的在体外对胰腺癌细胞有一定的抑制作用。

采用SRB法评价还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统(SNSS NAs)及对照药物CPT-11、SN38对胰腺癌细胞的生长抑制作用。结果如表1所示，表1伊立替康(CPT-11)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)和还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统(SNSS NAs)对胰腺癌细胞增殖的半数抑制浓度(IC

注：

表1中实验数据表明本发明提供的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统在体外对胰腺癌细胞有一定的抑制作用。

实施例7

实施例4制备的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的表征。

利用马尔文粒度仪通过动态光散射测定通过实施例1-4制备得到自组装纳米载药系统的粒径分布(表2)，测定样品体积：1mL；测定温度25℃；分散介质：超纯水。

表2结果显示，实施例1-4中制备得到的含有不同比例DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统，随着DSPE-PEG2000的比例增大，其粒径略有增大，多分散系数略有增大，但均在100nm以下，且粒径分布较为集中(多分散系数小于0.2)。

表2含有不同比例DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的粒径(n＝3,均值±标准差)

利用HT7700透射电子显微镜观察通过实施例3制备得到还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的形态(见图1)。实施例3中制备得到含有10％DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统在透射电子显微镜下观察为粒径分布均一的球形纳米颗粒。

实施例8

实施例4制备的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的稳定性考察。

1)储存稳定性

通过实施例3制备得到还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统储存于4℃条件下，分别在第0、2、4、6、8、10、12、14天吸取1mL置于样品池中利用马尔文粒度仪测定粒径及多分散系数，见图2中(A)，结果显示，本发明提供的自组装纳米递药系统的具有良好的储存稳定性，利于产业化。

2)稀释稳定性

通过实施例3制备得到还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统，配制为浓度1mg/mL的储备液，用生理盐水依次稀释5、10、20、50、100、200倍。分别取1mL储备液及稀释不同倍数后的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统分散液于样品池中，利用马尔文粒度仪测定粒径及多分散系数，见图2中(B)，结果显示，本发明提供的自组装纳米递药系统的具有良好的稀释稳定性，静脉给药进入体循环被稀释后依旧具有良好的粒径及粒径分布。

3)溶血实验

取0.2mL 2％新鲜的红细胞悬液，加入0.2mL蒸馏水稀释，作为阳性对照；另取0.2mL 2％新鲜的红细胞悬液，加入0.2mL生理盐水稀释，作为阴性对照；取0.2mL通过实施例3制备得到的不同浓度还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统(25μg/mL，125μg/mL，250μg/mL，500μg/mL)溶液与0.2mL新鲜的2％红细胞悬液混匀，37℃气浴恒温振荡器中孵育3h后，放入离心机1500rpm，室温离心10min。用微量移液器分别吸取上清200μL转移至96孔板，使用酶标仪在545nm处测定吸光度值。溶血率(％)按照下述公式进行计算：

溶血率(％)＝(A1-A2)/(A3-A2)×100％；

其中，A1：样品在545nm处的吸光度值；

A2：阴性对照在545nm处的吸光度值；

A3：阳性对照在545nm处的吸光度值。

表3不同浓度的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的溶血率(％)(n＝3,均值±标准差)

表3结果显示，本发明提供的自组装纳米递药系统具有良好的生物相容性，溶血率小于1.5％，适用于体内静脉注射给药。

综上所述，本发明提供的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统，引入很少量的DSPE-PEG2000(如实施例3)，即可具备优良的稀释稳定性、储存稳定性和生物相容性。这与传统的依赖载体材料的纳米递药系统(通常载体材料的含量＞90％)明显不同，因而还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统具有更高的载药量。

实施例9

实施例4制备的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的体外释放。

取三个50mL离心管，分别加入40mL含0.5％吐温80的磷酸盐缓冲液，作为对照组；另取三个50mL离心管，分别加入40mL含10mM谷胱甘肽和0.5wt％吐温80的磷酸盐外液，作为实验组。将装有1mL浓度为216.7μg/mL还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统分散液的透析袋(截留分子量＝7000Da)分别放入离心管并浸没在释放介质中，拧紧管盖。将离心管置于37℃恒温振荡器中，分别于1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120h取出400μL对照组及实验组外液置于4mL离心管中，并分别补加400μL相应的释放介质于离心管中，保证透析液的总体积不发生变化。将装有外液的离心管开盖放入真空干燥箱，干燥12h。然后用200μL色谱甲醇复溶，涡旋、超声分散，配平后放入离心机13000rpm，室温离心15min，取170μL上清以高效液相色谱法测定含量。

释放度按照下述公式计算：SN38累计释放量(％)＝某一时间点释放介质中SN38的质量/无穷时间点释放介质中SN38的质量×100％。

本发明提供的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的体外释放结果如图3所示，图3表明本发明所述的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统具有还原响应性药物释放行为。

实施例10

实施例4制备的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的体外细胞摄取。

取生长状态良好且处于对数生长期的Panc-1及BxPC-3细胞，以3×10

待24h后细胞完全贴壁，弃去旧培基，更换为2mL含20μM还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统(SNSS NAs)分散液的高糖DMEM培基，三块孔板分别作用2、4、6h，不同时间点取出孔板，弃去旧培基，用预冷的磷酸盐缓冲液清洗三遍，每孔加入100μL1wt％十二烷基硫酸钠水溶液，放在冰上裂解10min，用细胞刮将细胞刮下，两个孔合并收集至一个1.5mL离心管中，每块孔板共三组。

利用手持超声探超仪超声破碎收集的细胞，而后放入离心机12000rpm，4℃，离心15min，取5μL上清于96孔板，加入200μLBCA工作液(试剂A:试剂B＝1:50(v:v))，在37℃孵育30min，使用多功能酶标仪在562nm处测吸光度值，带入蛋白浓度标准曲线计算蛋白浓度。剩余样品加入800μL冰乙腈，-20℃沉淀40min，放入离心机12000rpm，4℃，离心15min，收集上清至4mL离心管中，用氮吹仪(40℃)吹干溶剂。再加入400μL色谱甲醇复溶，超声、涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，以高效液相色谱法测定药物含量。单位蛋白细胞摄取量的计算如下：

单位蛋白摄取量(μg/mg)＝细胞内药物含量(μg)/细胞总蛋白质量(mg)。

本发明提供的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的体外细胞摄取结果如图4所示，其中，(A)为Panc-1细胞中，(B)为BxPC-3细胞中。图4表明本发明所述的SNSS NAs是通过内吞作用进入肿瘤细胞，且前药能够在细胞内降解为原形药物SN38。

实施例11

通过实施例4制备的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的体内组织分布。

采用裸鼠胰腺癌移植瘤模型评价自组装纳米递药系统的体内组织分布，具体分为如下几步：

称取Cy7-NHS粉末1mg溶于100μL DMSO中，配制成为10mg/mL的Cy7-NHS溶液，备用；

称取两亲性高分子材料DSPE-PEG2000-NH

吸取1当量的Cy7-NHS溶液与1.2当量的DSPE-PEG2000-NH

按照实施例4中所述的制备方法，将还原响应性抗胰腺癌前体药物与Cy7-DSPE-PEG2000混合，制备成为含10％Cy7-DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统，备用。

选用周龄为6-8周的Balb/c雌鼠作为动物模型，收集生长状态良好的Panc-1细胞，调整细胞密度为1×10

将荷瘤的Balb/c雌鼠分为两组，一组尾静脉注射200μL游离Cy7染料溶液(1mg/kg)，另一组尾静脉注射含10％Cy7-DSPE-PEG2000的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统，分别于2h、4h、6h、8h、10h、24h定点对小鼠进行活体成像观察，成像所选的最大激发波长为773nm。24h后，将Balb/c小鼠颈椎脱臼致死，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器及肿瘤，再次进行成像观察。

图7为荧光标记的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的体内组织分布图；其中，(A)为荧光标记的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统随时间变化的体内荧光强度分布图；(B)为实验终点时离体的心(H)、肝(Li)、脾(S)、肺(Lu)、肾(K)及肿瘤(T)的荧光强度图。如图7中(A)所示，游离Cy7染料在注射2h后荧光强度达到最高，但随着时间的推移，Cy7染料在体内被快速清除，6h时荧光强度微弱，几乎被完全清除；荧光标记的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统在注射2h后逐步蓄积于肿瘤和肝脏部位，4h时在肿瘤部位的蓄积达到了最大，10h后其在肿瘤组织及肝脏仍有大量蓄积，在24h后体内仍有部分残留。图7中(B)显示了注射24h后，离体器官和肿瘤组织的荧光强度，可以观察到注射荧光标记的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的裸鼠肿瘤组织中仍有高强度的荧光信号，表明还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统可以在体循环中维持较长的时间，并且通过高渗透高滞留效应效应被动靶向蓄积于肿瘤组织处。

实施例12

通过实施例4制备的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统的体内抗肿瘤药效。

采用裸鼠胰腺癌移植瘤模型评价自组装纳米递药系统的体内抗肿瘤药效，具体分为如下几步：

(1)以Panc-1细胞构建裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型：将购买来的Balb/c小鼠饲养于SPF环境中，25℃，先常规性饲养一周(12h光照12h黑暗交替)后使用。同时扩增Panc-1细胞，将细胞状态良好且处于对数生长期的Panc-1细胞用0.25％胰蛋白酶消化，高糖DMEM培基终止消化，轻轻吹散混匀，取10μL细胞悬液进行细胞计数。将剩余细胞悬液收集至离心管，转速1000rpm/min，室温离心3min，弃去上清。用含有1％双抗的高糖DMEM培基重悬，调整细胞密度为5×10

(2)分组给药：每天观察Balb/c小鼠接种Panc-1后的成瘤情况，测量Balb/c小鼠的瘤体积在约30-50mm

(3)称重量瘤：小鼠在接种Panc-1细胞后，观察成瘤情况，待有明显瘤块突起，对小鼠进行称重；第二天，用游标卡尺对成长的瘤块进行测量，测量时对瘤块的长与宽分别记录。同时第二天开始给药，在给药期间每隔两天对小鼠进行称重、量瘤并记录，并且观察各组小鼠状态，将瘤块的长、宽进行计算，得到瘤体积大小，采用下述计算公式：肿瘤体积＝长边×短边

(4)收集组织：第16天颈椎脱臼法处死小鼠，解剖小鼠，并剥离出瘤块及心、肝、脾、肺、肾等主要脏器。瘤体称重后，用PBS涮洗干净，平铺于黑卡纸上，拍照记录。

(5)组织的苏木精-伊红(H&E)染色：将从小鼠身上剥离的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，用生理盐水冲洗干净，浸泡于10倍体积的4％多聚甲醛组织固定液中，采用石蜡包埋，制备病理组织切片并进行H&E染色。

苏木精染料为碱性染料，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体呈蓝紫色。伊红染料为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分呈红色。

具体操作步骤如下：

(5.1)石蜡包埋：将心、肝、脾、肺、肾等脏器从组织固定液中取出，装入包埋盒中，放入烧杯，流水冲洗30min；控水后，放入75％乙醇中浸泡30min，转移至85％乙醇中浸泡30min，再转移至95％乙醇-1中浸泡30min，而后放入95％乙醇-2中浸泡过夜，再转移至无水乙醇中浸泡1h；放入二甲苯-1中浸泡15min，转移至二甲苯-2中浸泡15min，再转移至二甲苯-3中浸泡15min；放入蜡缸-1浸蜡2h，再转移至蜡缸-2浸蜡12h。将完成石蜡包埋的组织，放入4℃保存；

(5.2)将包埋有组织的石蜡块放于石蜡切片机上，厚度5μm进行切片，而后将切片置于水浴锅(45℃)中展片至表面平整后，用黏附载玻片捞片，晾干水分后放于切片盒中室温保存备用；

(5.3)进行H&E染色前，在通风橱中进行脱蜡，将切片依次放入二甲苯-1、二甲苯-2、二甲苯-3中浸泡5min；转移至无水乙醇-1、无水乙醇-2、无水乙醇-3中分别浸泡5min；再转移至95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇中分别浸泡5min；最后，用双蒸水(ddH2O)-1、ddH2O-2分别清洗5min；

(5.4)使用苏木精染液染色5min，自来水冲洗；

(5.5)分化液孵育30s；

(5.6)自来水浸泡15min；

(5.7)使用伊红染液染色1min，自来水冲洗；

(5.8)自来水浸泡5min；

(5.9)脱水，封片，注意操作应在通风橱内进行；

(5.10)每个组织圈外滴加一滴中性树脂，使用盖玻片盖住，避免气泡。待中性树脂固化后完成封片。

(5.11)制备完成的组织切片放于正置显微镜下观察，采集图像。

(6)血液生化指标分析

对给予还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统(20mg/kg)的实验组小鼠取全血，置于含有促凝剂和分离胶的采血管中，将采血管静置2h后，放入离心机3500rpm/min，离心15min，用微量移液器吸取上层的血清，以全自动生化分析仪进行肝肾功能指标的检测。

结果如图5所示，其中，(A)为肿瘤体积变化曲线，(B)为小鼠体重变化曲线。图5中(A)结果表明本发明提供的还原响应性抗胰腺癌前体药物自组装纳米递药系统(SNSS NAs)具有显著的抗胰腺癌作用；其体内给药剂量能够在安全的前提下提高三倍，抗肿瘤药效显著提高，优于对照药物CPT-11。图5中(B)的结果表明，本发明提供的SNSS NAs对小鼠的体重几乎没有影响，说明无明显毒副作用。苏木精-伊红(H&E)染色结果和血液生化分析结果见图6，其中，(A)为各组织器官的苏木精-伊红(H&E)染色图，(B)为肝脏和肾脏功能指标数值图。图6表明本发明提供的SNSS NAs对小鼠各组织器官及肝脏、肾脏功能无明显损伤，具有良好的体内安全性和生物相容性，能够达到增效减毒的效果，本发明提供的SN38新制剂具有重要的临床应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。