ET-1促进真皮干细胞生发的用途

技术领域

本发明属于细胞培养及毛发再生技术领域，具体涉及ET-1促进真皮干细胞生发的用途。

背景技术

随着生活节奏的加快以及年龄的增长，越来越多的人受到脱发问题的困扰。脱发不仅会影响美观，而且会对患者造成心理问题。目前，药物治疗、植发手术是临床上常采取的脱发治疗手段，但都面临着诸多的局限性。

皮肤干细胞具有多种类型，能够通过增殖、分化及调控机制来治疗各种器官的缺损，是组织修复中最重要的一类“种子细胞”。其中，真皮干细胞(DSCs)作为一种多能性的前体干细胞，在毛囊及其它皮肤附属结构再生领域有着巨大的应用潜力。毛发的再生，离不开真皮与表皮的相互作用，研究表明，使用DSCs，混同表皮干细胞移植到脱发部位，可再生毛发，而使用终末分化的真皮成纤维细胞，则不能再生毛发。

截止到目前为止，临床研究报道能够有效治疗脱发的依然是“原代”DSCs的自体移植。即从自体皮肤中分离DSCs，不经过扩培，通过注射直接移植到脱发部位。动物实验表明，要想达到比较理想的毛发再生效果，至少每厘米伤口需要100,000个DSCs细胞；而人的皮肤比小鼠更厚，预计需要的DSCs密度是小鼠的10倍以上。但DSCs的体外扩增面临着两个难题，一是增殖缓慢，难以在短期内获得大量细胞；二是体外培养无法维持DSCs的干性，从而使其失去毛囊再生能力。同时，难以体外扩培，就意味着要采集更大的患者皮肤才能获得足量的DSCs，这给干细胞治疗脱发带来了很大的限制。因此，亟需开发一种提高DSCs的增殖速率及干性的方法，以促进干细胞治疗在毛发再生领域中的应用，有着重要的研究意义与应用价值。

内皮素家族(Endothelins，ETs)成员主要包括ET-1、ET-2和ET-3，它们都是由21个氨基酸组成的小肽，最早发现其由血管内皮细胞合成，具有非常强烈的收缩血管的生物活性，且能够诱导血管生成、促分化、促细胞有丝分裂和类细胞生长因子的性质，调节机体各个器官的发育及功能。然而，目前尚未有将ETs应用于生发或防脱发的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明经研究发现，ET-1能够提高DSCs的增殖速率及干性，促进DSCs生发，可以解决目前DSCs在现有体外培养方法下存在的增殖缓慢和无法维持干性的难题，进而满足脱发患者的移植应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明第一方面提供了ET-1在制备生发产品中的应用。

本发明经研究发现，ET-1可对DSCs在体外培养时进行干性调节，从而在维持毛发再生能力的同时实现DSCs在体外的长期培养，对于干细胞治疗脱发症具有重要的研究意义和实际应用价值。推测其原因为，表皮细胞也是合成ET-1的主要场所，通过自分泌和旁分泌作用，ET-1能够引起细胞外基质的重塑，引起内皮向间充质的转移，促进真皮成纤维细胞和黑色素细胞的增殖。正因为如此，ET-1能促进DSCs的增殖以及对DSCs在体外培养时进行干性调节，从而在维持毛发再生能力的同时实现DSCs在体外的长期培养，对于干细胞治疗脱发症具有重要的研究意义和实际应用价值。

优选地，所述生发产品包括生发液、生发干粉、生发微针。

本发明第二方面提供了一种生发剂，所述生发剂以ET-1作为主要活性成分。

经研究发现，将ET-1直接在体内注射到受试者(小鼠)头皮中，能促进毛发的再生。

本发明第三方面提供了一种提高DSCs生发能力的体外培养方法，具体为：用含ET-1的体外无血清3D培养体系培养DSCs。

所述ET-1(NCBI Gene ID:1906)为内皮素家族(Endothelins，ETs)成员，通过在DSCs的体外无血清3D培养体系中加入ET-1，可以促进毛囊DSCs的增殖。该方法培养所得细胞可用于移植，应用于毛发再生。比如，从受试者自体皮肤中分离DSCs，在体外经过ET-1的培养，通过注射直接移植到脱发部位。

优选地，所述无血清3D培养体系包括DMEM培养基和Ham's F12培养液，所述DMEM培养基和Ham's F12培养液的体积比为2-4:1。

优选地，培养时，将细胞按照3-10×10

优选地，所述ET-1的浓度为0.1-1000nM。

更优选地，所述ET-1的浓度为100nM。本发明经研究发现，所加入的ET-1的浓度为100nM时，促进DSCs增殖和干性的效果最佳。

优选地，培养的第3天和第6天补充细胞因子，每次补充1-3％ B27，18-22ng/mLEGF，35-45ng/mL bFGF，第7天进行传代。

本发明第四方面提供了一种非治疗目的的激活毛发生发的方法，具体为：将ET-1皮内注射入皮肤内，激活真皮细胞进而促进毛囊的再生。

同样的，所述ET-1的最佳浓度为100nM。此时促进DSCs增殖和干性的效果最佳。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明通过体外试验发现，通过在DSCs的体外无血清3D培养体系中加入ET-1，能够有效提高DSCs的增殖。并且，经ET-1培养过的DSCs，其再生毛囊的数量显著提高。另外，在体内采用ET-1直接注射休止期皮肤，可直接在体内激活毛发生长。说明ET-1可对DSCs在体外培养时进行干性调节，从而在维持毛发再生能力，实现DSCs在体外的长期培养，还可以在体内直接激活毛发生发，对于采用干细胞治疗脱发症具有重要的研究意义和实际应用价值，同时为研究新的生发或防脱发药物提供了新的思路，具有广阔的应用前景。

(2)本发明通过ET-1对DSCs进行处理，不仅可在短期内获得大量细胞，而且可在体外培养时维持其干性。同时，ET-1可促进休止期毛囊进入生长期，可有效改善脱发问题。表明ET-1在促进DSCs增殖和维持干性方面均具有优异的效果，且具有较好的促生发作用，可以解决目前DSCs在现有体外培养方法的难题，同时可满足脱发患者的移植需求。

附图说明

图1为不同浓度的ET-1对真皮干细胞增殖的影响结果；

图2为ET-1对真皮干细胞再生毛囊能力的影响结果；

图3为ET-1处理直接激活静止期毛囊的试验结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

下述实施例中的涉及实验动物为C57BL/6小鼠和裸鼠，购自于广东省医学实验动物中心；ET-1购自Sigma-Aldrich公司(货号：E3889)。低生长因子Matrigel购自Sigma-Aldrich公司(货号：E6909)。上皮细胞培养基KSFM购自Gibco公司(货号：10744019)。DMEM：F12(3：1)培养基购自Gibco公司(货号：11965092)。B27购自Gibco公司(货号：12587010)。bFGF购自PeproTech公司(货号：100-18B)。EGF购自PeproTech公司(货号：AF-100-15)。TrypLE Express购自ThermoFisher公司(货号：12604021)。DispaseII购自Gibco公司(货号：17105041)。胶原酶I购自Gibco公司(货号：17018029)。3M Tegaderm透明伤口敷料购自3M公司(货号：70-2007-4888-0)。

实施例1 ET-1促进真皮干细胞增殖能力的验证

具体步骤如下：

(1)从出生后0-2天的C57BL/6新生小鼠背部分离小鼠细胞。首先将样品(小鼠背部)浸入碘伏半分钟，随后用75％乙醇彻底清洗5次。将小鼠背部组织切成2-3mm

(2)用浓度为0.35％的胶原酶I消化上一步得到的真皮，所得细胞与组织的混合液通过80目的筛子进行过滤。对滤出的细胞悬液进行两次离心(1300rpm，5min，25℃)。收集细胞并重悬，得到P0代DSCs。按照3-10×10

(3)从P3代DSCs接种开始，实验组添加不同浓度的ET-1连续处理一周，浓度分别为10nM、50nM、100nM和1000nM，对照组则不添加ET-1，一周后使用血细胞计数板计数。

(3)结果发现ET-1对DSCs的增殖呈剂量依赖效应，浓度为100nM时对DSCs的促进作用最强(图1)。

实施例2 ET-1促进真皮干细胞再生毛囊能力的验证

具体步骤如下：

(1)将P0代DSCs用100nM ET-1连续处理，传代直至P5代；对照组的DSCs则不加ET-1正常培养。

(2)采用实施例1中步骤(1)的方法分离表皮和真皮，取表皮部分用小剪刀剪碎，并在37℃条件下用浓度为0.035％的胶原酶消化40分钟。用80目的筛子过滤细胞组织混合液，对滤出的细胞悬液进行离心(1300rpm，5min，25℃)，用KSFM培养基重悬，计数细胞。按照3×10

(3)通过腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉裸鼠(5周)，然后用组织打孔器在小鼠背部皮肤取两个对称且直径为2.5mm的伤口。将Matrigel于碎冰上解冻成水相。然后各取2×10

(4)移植后，用3M Tegaderm膜覆盖伤口防止感染，而且外面用自粘弹力绷带包扎。3周后，将小鼠处死，计算长出的毛发数量。

(5)结果发现，对照组的P5代真皮干细胞毛发再生能力有限，仅能观察到数根；而使用ET-1处理的毛发数量显著增多。表明ET-1对DSCs干性的促进作用不仅仅只体现在体外的干性指标上，而是确实提高了其在体内的再生修复能力(图2)。

实施例3 ET-1在体激活毛发生长能力的验证

(1)碎冰上溶解Matrigel成水相，利用水相的Matrigel配置ET-1至终浓度为100nM，对照组为不含药物的Matrigel。7周龄位于毛囊休止期的C57BL/6小鼠不剃毛，戊巴比妥钠麻醉后，对照组和ET-1组各取50uL，用预冷的微量注射器小心打入小鼠皮内，待Matrigel凝固再拔出针头，此时小鼠皮肤下可见凸起。

(2)皮内注射后14天，剃毛后用脱毛膏去毛，可以观察到ET-1皮内注射可激活附近静止期的毛囊提前进入生长期(皮肤变黑)，而对照注射处的毛囊仍处于休止期(皮肤为白色或粉红色)(图3)。

综上可见，本发明通过往体外无血清3D培养体系中加入ET-1培养DSCs，促进了DSCs的增殖以，增强了DSCs再生毛囊的能力，经ET-1培养后的细胞可移植至脱发部位，用于促进毛发的再生。此外，在体内直接注射ET-1也可以激活毛发生发，有望将其用于研发新的生发或防脱发药物，具有重要的应用价值。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。