一种提高力学强度的干态羊膜及其制备方法

技术领域

本发明是一种提高力学强度的干态羊膜及其制备方法，具体涉及一种能够提高临床使用中材料力学强度的干态羊膜及其制备方法，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

羊膜为胎盘的最内层，含有上皮细胞，光滑，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚约0.02～0.5mm。羊膜在伤口护理方面具有广阔的临床应用，包括眼科、骨科、神经外科、皮肤科、口腔科的伤口管理及术后修复，同时，由于羊膜中含有胶原蛋白、糖胺多糖及多种细胞生长因子，因此，具有在促进组织再生方面的显著效果。现有膜片状羊膜产品按照保存形态主要包括湿态羊膜及冷冻干燥羊膜。湿态羊膜的优点是柔软性较好，缺点是需要低温保存。冷冻干燥羊膜的优点是可以常温保存，缺点是材料较脆，力学强度不足，特别是缝合强度较差，容易在临床使用中出现破裂。

现有技术中，申请号为CN201610303279.X的发明专利公开了一种易保存生物羊膜的制备方法，该方法将羊膜清洗酶解，过滤后加入甘油浸泡，并用生理盐水冲洗，得粗生物羊膜，之后取壳聚糖和无菌水，混合加入磷酸溶液，茶多酚、酪蛋白以及过硫酸铵，再次混合加热并加入甲壳素，得混合液，随后将得到的粗生物羊膜浸泡混合液中，通过微波反应，冲洗过滤，置于无菌净化间自然晾干，从而得到易保存生物羊膜。该方法为了提高干态羊膜的力学强度，在制备过程中，添加了很多外源性物质，如：茶多酚、酪蛋白、甲壳素，虽然可以在一定程度上提升羊膜的缝合强度，但是这些添加的外源性物质可能带来安全性方面的技术风险，不利于其临床推广应用。此外，该方法仅是将这些外源性物质通过物理方式填充，仍然无法高效的提高耐受蛋白酶的降解性能。

申请号为CN202011621441.5的发明专利公开了抗折痕的脱水交联生物材料及其制备方法和应用，该方法通过对生物材料进行氧化处理、第一交联处理、第二交联处理以及脱水处理而获得抗折痕的脱水生物材料， 首先利用生物材料中的粘多糖的邻羟基氧化成醛基，多糖类化合物连接到胶原蛋白纤维上，再通过多胺类化合物交联，使得多糖与多糖之间以及多糖与蛋白纤维之间形成一体的交联网状结构，由此来改善生物材料的抗折痕问题。但该方法仅在猪心包膜的实验中证明了其干膜在释放浸水后，未出现明显折痕，对于该方法在羊膜实验中是否能够提升其干膜在临床使用时的缝合强度，还有待验证。

基于上述情况，为更大程度的满足羊膜生物材料的临床需求，克服现有技术在临床使用时力学强度的不足和不确定性，亟需开发一种具有良好力学强度的干态羊膜及其制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高力学强度的干态羊膜的制备方法，该制备方法是利用新鲜羊膜在羊膜提取物的混悬液中进行过氧乙酸处理，继而干燥制得干态羊膜的过程，利用过氧乙酸可以将羊膜提取物以及膜片状羊膜中的糖胺多糖上的羟基氧化为醛基，随后与羊膜提取物以及膜片状羊膜中的胶原蛋白上的氨基反应，形成酰胺类化合物，从而提高了膜片状羊膜内部组分之间的结合力，显著提升了其力学强度，同时提高了抗蛋白酶降解性能。相比于现有干态羊膜制备技术，本发明进行多次清洗直至无过氧乙酸残留物检出，没有额外添加外源性物质，不会增加羊膜产品成分的复杂性，降低了羊膜医用材料的安全风险。

本发明还提供了由上述制备方法制得的干态羊膜，可实现其在眼科、骨科、神经外科、皮肤科、口腔科的伤口管理及术后修复方面具有广阔的临床应用。

本发明通过下述技术方案实现：一种提高力学强度的干态羊膜的制备方法，包括以下步骤：

S1.取新鲜羊膜洗净、晾干、冰浴粉碎、冷冻干燥后，获得羊膜提取物；

S2.将新鲜羊膜加入羊膜提取物的混悬液中，再加入过氧乙酸进行处理；

S3.对处理后的羊膜进行干燥和辐照灭菌处理，即得。

所述S1的步骤中，对新鲜羊膜进行消毒、杀菌，再放入纯化水中除去其表面杂质，即完成洗净工序。

所述S1的步骤中，将洗净后的羊膜铺平并晾干，晾干时，每15min对羊膜进行一次翻面，共晾干0.5～24h，即完成晾干工序。

所述S1的步骤中，将冰块与羊膜按质量比为1∶1～5∶1的比例混合后静置5min再进行粉碎，控制粉碎过程中料液温度＜8℃，粉碎时，每10～60S停止粉碎1min，重复粉碎30～90次，即完成冰浴粉碎工序。

所述S2的步骤中，羊膜提取物的混悬液的浓度为0.1～1wt%。

所述S2的步骤中，加入过氧乙酸进行处理时，控制过氧乙酸的浓度为0.5～2wt%，反应温度为4～37℃，反应时间为2～48h。

所述S3的步骤中，干燥处理包括自然晾干、冷冻干燥、真空干燥或吸水纸吸干。

进一步的，所述冷冻干燥时，控制冷冻温度为-40℃，干燥时间为24～96h。

所述S3的步骤中，辐照灭菌处理时，采用伽马射线辐照或高能电子束辐照，辐射剂量控制在20～30kGy。

一种提高力学强度的干态羊膜，采用上述制备方法制得。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明方法首次在膜片状羊膜材料中引入羊膜提取物，首先，利用过氧乙酸将羊膜提取物以及膜片状羊膜中的糖胺多糖上的羟基氧化为醛基，然后，再使其与羊膜提取物以及膜片状羊膜中的胶原蛋白上的氨基反应，形成酰胺类化合物，由此可以提高膜片状羊膜内部组分之间的结合力，并显著提升其力学强度。

（2）本发明方法在提升其力学强度的同时，还提高了干态羊膜的抗蛋白酶降解性能，进而可以延长其体内植入之后在位时间，而现有技术仅仅是将外源性物质通过物理方式进行填充，其无法高效提高耐受蛋白酶降解性能。

（3）本发明方法在采用过氧乙酸处理之后，只需生理盐水多次清洗，直至无法检出到残留物即可，没有额外添加外源性物质，不会增加羊膜产品成分的复杂性，因此，可降低羊膜医用材料的安全风险。

（4）本发明中方法制备的干态羊膜，由于具有更高的力学强度和耐受蛋白酶降解性能，可将其应用于包括眼科手术、脊柱手术中抑制感染和炎性反应，减少瘢痕形成和保护暴露的神经根、肌腱修复及防黏连、皮肤缺损修复的手术中作为生物医用材料进行使用，且干态羊膜还可以在室温下实现长期保存，便于临床使用。

附图说明

图1为本发明中过氧乙酸处理的原理示意图。

具体实施方式

下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明旨在提供一种提高力学强度的干态羊膜及其制备方法， 尤其是一种能提高其在临床使用时的缝合强度的新型干态羊膜以及制备该新型干态羊膜的方法，具体而言，是采用膜片状羊膜和羊膜提取物的组合使用，在过氧乙酸处理过程中，利用过氧乙酸可以将羊膜提取物以及膜片状羊膜中的糖胺多糖上的羟基氧化为醛基，随后与羊膜提取物以及膜片状羊膜中的胶原蛋白上的氨基反应，形成酰胺类化合物（参见图1的原理示意图），由此来提高膜片状羊膜内部组分之间的结合力，使之在力学强度及抗蛋白酶降解性能方面均有所提升，尤其可以提升力学强度中的缝合强度。

现有技术中，CN201610303279.X虽然可以提高干态羊膜的力学强度，但其采用物理方式进行填充，并引入大量外源性物质，并不利于临床推广；CN202011621441.5虽然提升生物材料的力学性能，但仅提供其在心包膜中具有提升抗折横的效果，对于羊膜材料及其缝合强度的提升，还需要通过大量实验进行验证。因此，本发明通过显著提升羊膜生物材料的缝合强度和抗蛋白酶降解性能，能够更好的在临床应用中，实现在眼科、骨科、神经外科、皮肤科、口腔科的伤口管理及术后修复中的推广使用。

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施方式中，所述羊膜包括人源羊膜及其他哺乳动物，包括但不限于猪、牛、羊来源羊膜，其中人源羊膜经过伦理审查和捐赠者的知情同意等程序后，从合法、正规医院取得，获取途径合法、合规。过氧乙酸购自Sigma-Aldrich公司。

实施例1：

本实施例涉及干态羊膜的制备，其制备步骤如下：

（1）制备羊膜提取物，具体包括以下步骤：

步骤（a）：清洗：将预先冷冻（-20℃）的新鲜羊膜从冰箱取出，将其包材喷洒75%酒精进行消毒，放入车间传递窗进料口进行紫外杀菌30min。将羊膜取出进行拆袋，用镊子将羊膜取出放入304托盘或烧杯中，加入纯化水没过羊膜大于2cm。5min后初步解冻用手将羊膜分散，避免团缩。每隔30min换水一次，每次将羊膜进行翻面且进行轻轻搅拌，去除其表面残留杂质。重复此步骤至少3次，直至加入纯化水后溶液依旧保持澄清。

步骤（b）：晾干：清洗干净的羊膜用手将其取出，放在筛网上晾干，底部放上托盘接住其脱离的水分。羊膜需进行铺平，如无法进行铺平将其裁剪分割，羊膜不能叠加放置。晾干时羊膜需15min进行一次翻面，共晾干1h。

步骤（c）：冰浴粉碎并冷冻干燥：用准备好的烧杯放入电子天平进行归零，用烧杯将羊膜盛装好后进行称量，记录其湿重。将准备好的纯化水冰块（1cm×1cm×1cm）进行称量，与羊膜的质量比为1∶1，随后将冰块倒入烧杯中。将冰水羊膜混合液放入实验粉碎机静置5分钟后进行粉碎（等待部分冰块融化），同时用冰袋包裹物料杯控制粉碎过程中料液温度＜8℃，每次粉碎10S设备休息1min，重复此过程共30次即粉碎完成。随后冷冻干燥。得到冻干粉末。

（2）过氧乙酸处理：

将步骤（1）制备的羊膜提取物重新配制为水溶液，将新鲜羊膜浸泡在羊膜提取物的悬浊液中，随后加入过氧乙酸水溶液，实现将羊膜提取物以及膜片状羊膜中的糖胺多糖上的羟基氧化为醛基；随后其与羊膜提取物以及膜片状羊膜中的胶原蛋白上的氨基反应，醛基和氨基之间通过消去反应形成酰胺类化合物。随后采用生理盐水多次清洗，直至对使用的过氧乙酸无法检出到残留物。

羊膜提取物的悬浊液的浓度为0.1 wt%。

过氧乙酸处理水溶液浓度为0.5wt%，反应温度为4℃，反应时间为2h。

（3）干燥和辐照灭菌处理：

将步骤（2）过氧乙酸处理后的羊膜展平后铺在绷板上，进行干燥处理，干燥处理为自然晾干。然后对干燥处理后的干态羊膜采用辐照灭菌处理，电离辐射为伽马射线辐照，剂量为20KGy，获得干态羊膜。

实施例2：

本实施例涉及干态羊膜的制备，其制备步骤如下：

（1）制备羊膜提取物，具体包括以下步骤：

步骤（a）：清洗：将预先冷冻（-20℃）的新鲜羊膜从冰箱取出，将其包材喷洒75%酒精进行消毒，放入车间传递窗进料口进行紫外杀菌30min。将羊膜取出进行拆袋，用镊子将羊膜取出放入304托盘或烧杯中，加入纯化水没过羊膜大于2cm。5min后初步解冻用手将羊膜分散，避免团缩。每隔30min换水一次，每次将羊膜进行翻面且进行轻轻搅拌，去除其表面残留杂质。重复此步骤至少3次，直至加入纯化水后溶液依旧保持澄清。

步骤（b）：晾干：清洗干净的羊膜用手将其取出，放在筛网上晾干，底部放上托盘接住其脱离的水分。羊膜需进行铺平，如无法进行铺平将其裁剪分割，羊膜不能叠加放置。晾干时羊膜需15min进行一次翻面，共晾干1h。

步骤（c）：冰浴粉碎并冷冻干燥：用准备好的烧杯放入电子天平进行归零，用烧杯将羊膜盛装好后进行称量，记录其湿重。将准备好的纯化水冰块（1cm×1cm×1cm）进行称量，与羊膜的质量比为1∶5，随后将冰块倒入烧杯中。将冰水羊膜混合液放入实验粉碎机静置5分钟后进行粉碎（等待部分冰块融化），同时用冰袋包裹物料杯控制粉碎过程中料液温度＜8℃，每次粉碎60S设备休息1min，重复此过程共90次即粉碎完成。随后冷冻干燥。得到冻干粉末。

（2）过氧乙酸处理：

将步骤（1）制备的羊膜提取物重新配制为水溶液，将新鲜羊膜浸泡在羊膜提取物的悬浊液中，随后加入过氧乙酸水溶液，实现将羊膜提取物以及膜片状羊膜中的糖胺多糖上的羟基氧化为醛基；随后其与羊膜提取物以及膜片状羊膜中的胶原蛋白上的氨基反应，醛基和氨基之间通过消去反应形成酰胺类化合物。随后采用生理盐水多次清洗，直至对使用的过氧乙酸无法检出到残留物。

羊膜提取物的悬浊液的浓度为1 wt%。

过氧乙酸处理水溶液浓度为1wt%，反应温度为37℃，反应时间为48h。

（3）干燥和辐照灭菌处理：

将步骤（2）过氧乙酸处理后的羊膜展平后铺在绷板上，进行干燥处理，干燥处理为冷冻干燥，控制冷冻温度为-40℃，干燥时间为72h。然后对干燥处理后的干态羊膜采用辐照灭菌处理，电离辐射为伽马射线辐照，剂量为20KGy，获得干态羊膜。

实施例3：

本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤（2）的过氧乙酸处理中，采用较高浓度的过氧乙酸处理水溶液，其使用浓度为2wt%，干燥方式为真空干燥，真空度控制在10

对比例1：

本对比例采用现有常规的冷冻干燥方法制备干态羊膜，步骤如下：

将新鲜人体羊膜进行冷冻干燥，冷冻温度﹣40℃，干燥时间为72h，得到干态人体羊膜。之后采用辐照灭菌处理，电离辐射为高能电子束辐照，剂量为 30KGy，即得。

对比例2：

本对比例采用过高浓度过氧乙酸处理后制备干态羊膜。

采用的过氧乙酸处理水溶液浓度为3wt%。本对比例中的其余操作步骤及工艺条件均与实施例1保持一致。

对比例3：

本对比例采用过低浓度过氧乙酸处理后制备干态羊膜。

采用的过氧乙酸处理水溶液浓度为0.1wt%，本对比例中的其余操作步骤及工艺条件均与实施例1保持一致。

对比例4：

本对比例未采用羊膜提取物来制备干态羊膜，其余操作步骤及工艺条件均与实施例1保持一致。

具体制备过程如下：

（1）过氧乙酸处理：将新鲜羊膜浸泡在过氧乙酸水溶液中，随后采用生理盐水多次清洗，直至对使用的过氧乙酸无法检出到残留物。

过氧乙酸处理水溶液浓度为1wt%，反应温度为4℃，反应时间为2h。

（2）干燥和辐照灭菌处理：将过氧乙酸处理后的羊膜展平后铺在绷板上，进行干燥处理，干燥处理为自然晾干。然后对干燥处理后的干态羊膜采用辐照灭菌处理，电离辐射为伽马射线辐照，剂量为20KGy，即得。

对比例5：

本对比例采用高碘酸钠处理后制备干态羊膜。

具体制备过程如下：

（1）高碘酸钠处理：将新鲜羊膜浸泡在高碘酸钠水溶液中，高碘酸钠处理水溶液浓度为1wt%，反应温度为25℃，反应时间为2h。

（2）干燥和辐照灭菌处理：将高碘酸钠处理后的羊膜展平后铺在绷板上，进行干燥处理，干燥处理为冷冻干燥，控制冷冻温度为-40℃，干燥时间为72h。然后对干燥处理后的干态羊膜采用辐照灭菌处理，电离辐射为高能电子束辐照，剂量为 25KGy，即得。

试验例1：缝合强度测试

本测试包含以下材料：实施例1至实施例3、对比例1至对比例5的干态羊膜。

测试方法：将样品裁成22mm×3mm的矩形用于缝合强度测试。用测厚仪测量每个样品的厚度。将每个组织样品的一侧固定于拉力试验机（BioTester, 10 N负载；CellScale，加拿大）的一个夹具上，用针将缝线（聚丙烯单丝4-0）穿过距离另一端边缘0.5 cm左右的位置，并将缝线固定于其对面的夹具上。对样品施加恒定的速率10 mm/min拉伸直至缝线被拉出，得到将缝线拉出所需要的力，用样品的厚度和宽度计算出横截面积，最后算得峰值时的应力。

实验结果参见下表1。

表1

由表1的结果可知，相比于对比例1至对比例5，实施例1至实施例3中的干态羊膜缝合强度具有大幅提高。本发明方法中过氧乙酸处理的浓度为重要技术参数，过高（对比例2）或者过低（对比例3）的过氧乙酸浓度均无法实现干态羊膜缝合强度的提高，可能的原因是：过高浓度的过氧乙酸会导致对新鲜羊膜的过度氧化进而破坏羊膜的结构完整性，而过低浓度的过氧乙酸无法高效实现对羊膜中的糖胺多糖上的羟基氧化。

实施例1至实施例3相比于没有羊膜提取物的填充的对照组（对比例4）而言，羊膜提取物的填充为过氧乙酸提供了更多的反应位点，进而有效的提高了缝合强度。

更换为过氧乙酸相似试剂，如高碘酸钠（对比例5），也无法实现干态羊膜缝合强度的提高。可能的原因是：高碘酸钠无法高效实现对羊膜中的糖胺多糖上的羟基氧化。

试验例2：胶原酶降解测试

本测试包含以下材料：实施例1至实施例3、对比例1至对比例5的干态羊膜。

测试方法：将样品冷冻干燥并称重。将干燥后的样品浸泡在含有25 U/mL胶原蛋白酶的Tris缓冲液（0.1 M, CaCl2 0.05 M, pH=7.4）中，37℃反应72小时。经蛋白酶处理后的样品用去离子水冲洗3次，然后将样品再次冷冻干燥并称重。样品失重率用以下公式进行计算以表征材料酶降解抗性：

其中，W

实验结果参见下表2。

表2

由表2的结果可知，相比于对比例1至对比例5，实施例1至实施例3中的干态羊膜的失重率有大幅下降，表明即其抗蛋白酶降解性能得到大幅提升。

试验例3：干态羊膜在眼科手术中的应用

建立动物模型：取20只新西兰兔（2±0.5kg）采用戊巴比妥钠静脉注射麻醉后，右眼向上侧身固定，用剃须刀去除右眼周围绒毛和睫毛，用碘伏进行消毒处理。用奥布卡因对眼表进行局部麻醉，干滤纸吸去角膜上多余水分，用浸润了浓度为1mol/L的H2SO4溶液的直径约6 mm的单层圆形滤纸,贴附于角膜中央区域表面，计时30秒除去滤纸。用干滤纸吸去角膜上多余酸液后用大量生理盐水冲洗 5 min。造模一周后观察创面愈合情况，去除烧伤较轻已自愈和过重烧伤角膜全层的模型，取中轻度烧伤。自身修复能力不能使创面愈合的16个模型用于修复实验。

手术方法：手术操作均使用无菌手术器械，严格按照临床手术要求进行。

（1）羊膜实验组

随机取8只烧伤模型（2±0.5kg）采用戊巴比妥钠静脉注射麻醉后，前后肢用绳子固定，手术洞巾包裹实验兔全身，用电动剃须刀将兔右眼周围绒毛去除干净，用碘伏进行消毒处理，尽量减少对手术过程和后期角膜修复的影响。手术部位为角膜酸烧伤模型创面区域，在显微镜下首先对受损部位进行清创，用宝石刀将坏死的角膜上皮、组织彻底清理干净

取实施例2制备的干态羊膜，置于无菌生理盐水浸泡，复水30～40min，然后将羊膜（上皮面向上）平铺覆盖在整个角膜表面，接下来在整个角膜上（覆盖羊膜）覆盖一层隐形眼镜，将多余羊膜材料翻起包裹隐形眼镜边缘作为保护，防止缝线拉裂隐形眼镜。用10-0尼绒线“米”字型缝合固定隐形眼镜8针。术后两周酌情更换羊膜材料。第四周后均完全去除羊膜及隐形眼镜。

（2）空白对照组

取其余8只烧伤模型，手术方法与实验组手术方法相同，不使用生物羊膜，术后同样覆盖隐形眼镜保护创面，其余操作及后期护理与实验组相同。

术后评价：观察并拍照记录如下评价项目：每天观察实验兔子的精神状态及活动情况、观察角膜修复情况。动物实验评价标准：整体观察角膜修复后的形态。按照下表分类对动物实验中角膜的修复情况进行评价，参见下表3（注：参考全国眼外伤职业眼病学组的分度标准，以及Roper—Hall对眼部化学损伤程度的分级）。

表3

采用上述“动物实验评价标准”评价方法，于8周对空白对照组和羊膜实验组进行荧光素钠染色，观察角膜上皮缺损面积。评估生物羊膜修复眼表的安全性和有效性。

结果分析：术后上皮化评分结果，参见下表4。

表4

由上表4的结果可知，采用实施例2制备的干态羊膜实验组术后角膜上皮缺损面积较小，即上皮化明显由优于空白组。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。