一种覆膜ZIF-8偶联线粒体的靶向递送系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种覆膜ZIF-8偶联线粒体的靶向递送系统及其制备方法，该递送系统可应用于制备急性肺损伤药物。

背景技术

急性肺损伤(Acute lung injuer，ALI)是由急性肺炎、败血症、严重创伤或急性胰腺炎等多种致病因素引起的肺部急性损伤，其特征在于肺部炎症和微血管通透性增加，并最终发展为急性呼吸窘迫综合症(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)。革兰阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖(LPS)作为感染性致病因素已被证实可诱发ALI。LPS进入肺部组织后，被固有免疫细胞所感知并启动炎症介质的分泌，导致肺部炎症水平升高，并进一步导致肺泡上皮和内皮屏障被破坏，损害机体的正常呼吸功能。急性肺损伤(ALI)是临床上常见的危重症之一，是呼吸危重症医学界研究的难点和热点，其死亡率高，严重影响着患者的生命质量，且目前尚无特效治疗方法。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为19～22个核苷酸的短链非编码RNA，可特异性地从转录后水平调控靶基因的表达。miRNA具有多种生物活性，在许多疾病包括ALI的病理过程中发挥重要作用。在肺损伤和修复过程中，特定miRNA异常表达，并通过影响靶基因表达而调控炎症通路和免疫反应。巨噬细胞是一类重要的固有免疫细胞，其在呼吸道等组织种构成抗感染的第一道防线，并调控免疫-炎症反应和组织稳态。巨噬细胞具有不同的表型，主要分为M1促炎和M2抗炎表型，在肺损伤发生、发展中发挥重要作用。已有研究表明，miRNA-127对巨噬细胞表型和功能具有重要调节作用，细菌内毒素等感染因子可促进miRNA-127表达，过量表达的miRNA-127通过AKT/DUSP1/JNK通路促进巨噬细胞向促炎型M1表型转化，促发IL-1β、IL-6和TNFα等炎症因子大量释放，导致内毒素引起的小鼠急性肺损伤死亡率显著上升。在临床上，血清miRNA-127水平与脓毒症病人的严整程度成正比，并已成为其预后不良的重要辅助诊断指标。基于此，探索miRNA-127为靶标的治疗方法已成为减轻急性肺损伤和脓毒症等疾病症状的一个重要研究领域。

线粒体(Mitochondrion)是一种存在于大多数细胞中的多功能细胞器，主要负责能量产生、细胞凋亡、蛋白合成、免疫和炎症反应等生命过程。作为一种与能量代谢密切的相关的细胞器，线粒体结构和功能的完整性与机体健康密切相关。在急性肺损伤发生过程中，线粒体功能障碍已成为肺组织损伤和肺泡巨噬细胞凋亡的重要特征。线粒体损伤引起代谢重编程，促进细胞代谢路径从氧化磷酸化向糖酵解转变，推动巨噬细胞由M2向M1型转化。同时，线粒体损伤产生的过量ROS，以及由于线粒体受损而渗漏的线粒体DNA(mtDNA)进一步促发巨噬细胞活化，产生大量炎症因子和趋化因子，吸引大量炎症细胞浸润，从而引起级联反应和“细胞风暴(cytokine storm)”样症状。研究显示，线粒体功能缺损和巨噬细胞过度活化是引发新冠病毒等呼吸道病毒感染病情加重和高死亡率的重要原因。基于此，靶向急性肺损伤发展过程中过度活化的巨噬细胞，为其提供外源性功能完善的线粒体，通过修复内毒素等引起的线粒体损伤，增强氧化磷酸化水平，逆转M2/M1表型转换，有望成为恢复免疫平衡、减轻炎症反应、促进肺组织修复的新策略。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种覆膜ZIF-8偶联线粒体的靶向递送系统及其制备方法和应用。

为解决急性肺损伤炎症发展和线粒体损伤导致的能量代谢异常、巨噬细胞过度活化、以及炎症因子风暴等问题，本发明提供了一种覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统及其制备方法，及其在制备用于治疗急性肺损伤、能量代谢异常或炎症的药物中的应用。本发明公开了如下技术方案：

一种覆膜ZIF-8偶联线粒体的靶向递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将六水硝酸锌、2-甲基咪唑和anti-miRNA-127混合并经过溶剂热法处理得到负载anti-miRNA-127的ZIF-8纳米颗粒；

(2)利用糖蛋白标记试剂和第一生物正交试剂先后处理细胞，并提取细胞的细胞膜，得到修饰后的细胞膜；

(3)将所述的负载anti-miRNA-127的ZIF-8纳米颗粒与所述的修饰后的细胞膜混合后经超声和挤压得到覆膜ZIF-8纳米颗粒；

(4)提取外源性线粒体；

(5)将所述的外源性线粒体利用第二生物正交试剂处理；

(6)将所述的覆膜ZIF-8纳米颗粒和步骤(5)处理的外源性线粒体偶联，得到所述的覆膜ZIF-8偶联线粒体的靶向递送系统。

其中，所述的anti-miRNA-127为miRNA-127抑制剂。

其中，步骤(1)中，所述的ZIF-8纳米颗粒，其范围为70～200nm。优选地，为120nm。

其中，步骤(1)中，所述的六水硝酸锌、2-甲基咪唑和anti-miRNA-127的质量比为5000:11000:11；所述的溶剂热法处理，溶剂为甲醇，温度为30℃，时间为5min。优选地，所述的溶剂热法处理，磁力搅拌器处理，转速为600rpm。

步骤(1)制备得到的ZIF-8为金属有机框架化合物，其具有良好的生物相容性和和PH响应性，同时具有嵌套的三维多孔网状结构，可以封装核酸、蛋白、药物等多种有效成分。

其中，步骤(2)中，所述的细胞为靶向细胞的同源细胞，使所述的细胞膜实现同源细胞靶向作用。优选地，所述的细胞为人源细胞或非人源细胞中的任意一种或多种的组合；更优选为RAW246.7巨噬细胞。

其中，步骤(2)中，所述的糖蛋白标记试剂为Ac

所述的第一生物正交试剂为TZ-DBCO，所述的TZ-DBCO浓度为50μM。所述的第一生物正交试剂处理细胞的温度为37℃，时间为30min。优选地，所述的第一生物正交试剂的用量以每5mL的第一生物正交试剂处理1×10

其中，步骤(2)中，所述的细胞膜的提取方法为：将经糖蛋白标记试剂和第一生物正交试剂先后处理的细胞悬浮于含0.5％(w/v，g/mL)BSA、225mM甘露醇、30mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、75mM蔗糖、蛋白酶抑制剂(20μL/4mL)和1％(v/v)磷酸酶抑制剂混合物(pH7.4)的溶液中，使用超声波仪对细胞悬液裂解。将超声后的细胞悬液于4℃，800g离心10min，以去除细胞核成分及未破裂的细胞。利用超速离心机在100,000g离心60min得到细胞膜沉淀。细胞膜沉淀物进一步通过冷冻干燥，蛋白浓度定量后储存在-80℃冰箱中备用。

其中，步骤(3)中，所述的负载anti-miRNA-127的ZIF-8纳米颗粒与所述的修饰后的细胞膜质量比为1:1。所述的细胞膜包覆在ZIF-8纳米颗粒表面。

其中，步骤(3)中，所述的超声为26℃水浴超声3min；所述的挤压为使用Avanti微型挤出器反复通过200nm的的聚碳酸酯多孔膜，得到均质溶液。将均质溶液100,000g离心60min，得到的沉淀即为覆膜ZIF-8纳米颗粒。

其中，步骤(4)中，所述的外源性线粒体来源于细胞、肌肉或肝脏组织中的任意一种。优选为来源于RAW246.7巨噬细胞。所述的外源性线粒体具有完整的外膜和内膜结构和生物活性。优选地，采用梯度离心法分离细胞线粒体。所述的梯度离心，即利用线粒体提取试剂盒，将细胞与线粒体分离试剂混合，悬浮细胞，将细胞悬液匀浆得到细胞匀浆，将细胞匀浆1000g，4℃离心10min，转移上清到另一离心管中，3500g，4℃离心10min，小心去除上清，沉淀即为分离得到的细胞外源性线粒体。

其中，步骤(5)中，所述的第二生物正交试剂为TCO-NHS；所述的TCO-NHS浓度为50μM；所述的处理条件为冰上孵育30min。优选地，所述的第二生物正交试剂的用量以每mL第二生物正交试剂中加入15～60μg外源性线粒体计。

其中，步骤(6)中，所述的覆膜ZIF-8纳米颗粒和步骤(5)得到的外源性线粒体的质量比为1:0.5～2。所述的偶联条件为冰上孵育30min。所述的覆膜ZIF-8纳米颗粒偶联外源性线粒体通过TZ-DBCO和TCO-NHS生物正交反应试剂处理后，通过点击化学反应实现快速高效的共价连接。优选地，所述的覆膜ZIF-8纳米颗粒和步骤(5)得到的外源性线粒体的质量比为1:1。

本发明的第二方面在于，提供了一种上述的制备方法制备得到的覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统。优选地，所述的递送系统可靶向肺巨噬细胞，被细胞摄取后可以同时释放anti-miRNA-127和外源性线粒体。

其中，所述的递送系统为两种药物(anti-miRNA-127和外源性线粒体)的共递送系统，具有良好的生物相容性，具有同源细胞靶向作用。

本发明的第三方面在于，还提供了一种上述的覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统和/或上述的覆膜ZIF-8纳米颗粒在制备急性肺损伤治疗药物中的应用。优选地，所述的递送系统具有抗炎和恢复能量代谢的双重作用。所述的递送系统还可应用于炎症及能量代谢异常相关疾病的治疗康复等技术领域中。

有益效果：

本发明提供了一种基于覆膜ZIF-8偶联外源性线粒体的靶向共递送纳米材料，用于急性肺损伤治疗。(1)覆膜ZIF-8具有巨噬细胞靶向性和pH响应性，具有稳定的结构和良好的尺寸均一性；(2)ZIF-8具有高效的核酸装载和递送效率，保证了核酸药物的有效递送；(3)通过生物正交反应试剂偶联外源性线粒体，避免了对线粒体活性的损伤；(4)纳米递送系统可以将线粒体靶向递送至巨噬细胞并促进线粒体在细胞内的释放，提高巨噬细胞的能量代谢和炎症调控，改善小鼠急性肺损伤。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统的共聚焦显微镜图。a.负载anti-miRNA-127的ZIF-8材料；b.覆膜ZIF-8纳米颗粒；c.覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统(红色：DiD标记的细胞膜；绿色：Mito-Green标记的线粒体)。

图2为覆膜ZIF-8材料促进外源性线粒体的内化。外源性线粒体被RAW246.7巨噬细胞摄取图像。

图3为覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统作用于RAW246.7细胞的情况增加ATP的生成和降低活性氧的产生。a.经LPS处理的RAW246.7细胞在给药后ATP的生成情况；b.经LPS处理的RAW246.7细胞在给药后线粒体活性氧的生成情况。

图4为覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统对急性肺损伤的治疗效果。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下列实施例中，所述的anti-miRNA-127为miRNA-127抑制剂。

本发明中所述w/v，如无特殊说明，均为g/mL。

实施例1：覆膜ZIF-8纳米颗粒的制备

覆膜ZIF-8纳米颗粒的制备，包括以下步骤：(1)负载anti-miRNA-127的ZIF-8纳米颗粒的制备。(2)RAW246.7巨噬细胞细胞膜修饰后的提取。(3)将上述修饰后的细胞膜包裹负载anti-miRNA-127的ZIF-8纳米颗粒的有序组装。具体操作如下：

(1)负载anti-miRNA-127的ZIF-8纳米颗粒的制备：用六水硝酸锌和2-甲基咪唑为原料，称取15mg六水硝酸锌和33mg 2-甲基咪唑加入33μg anti-miRNA-127，通过甲醇溶剂热法(甲醇用量为1.5mL，磁力搅拌器处理，转速为600rpm，30℃，5min)合成负载anti-miRNA-127的金属有机框架化合物ZIF-8。

(2)RAW246.7巨噬细胞细胞膜修饰后的提取：RAW246.7巨噬细胞1×10

(3)将上述获得的负载anti-miRNA-127的ZIF-8纳米颗粒1mg和RAW246.7巨噬细胞来源的修饰后的细胞膜1mg混合，26℃水浴超声3min，超声结束后，使用Avanti微型挤出器将上述混合液反复40次通过200nm的聚碳酸酯多孔膜，得到均质溶液。将均质溶液进一步在100,000g下离心60min，得到的沉淀即为覆膜ZIF-8纳米颗粒(Anti-miRNA-127@ZIF@Ma)。将覆膜ZIF-8纳米颗粒重悬于PBS缓冲液中。如图1a和图1b所示，制备的覆膜ZIF-8纳米颗粒形态完整，尺寸为120nm左右。

配制浓度为1～5μM的DiD工作液，制备的覆膜ZIF-8纳米颗粒用DiD工作液37℃下染30min，12000rpm离心收集覆膜的ZIF-8，得到红色的覆膜ZIF-8纳米颗粒。

实施例2：覆膜ZIF-8偶联线粒体的靶向递送系统的制备

(1)提取RAW246.7巨噬细胞来源的线粒体：分离线粒体(细胞线粒体分离试剂盒，购自碧云天生物技术公司)的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷。收集2×10

(2)用1mL第二生物正交试剂TCO-NHS(50μM)与30μg分离的外源性线粒体冰上孵育30min，引入TCO基团，3500g，4℃离心10min，去除上清，在沉淀中加入30μg覆膜ZIF-8纳米颗粒，冰上孵育30min，得到基于覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统(Anti-miRNA-127/Mito@ZIF@Ma)。如图1c所示，覆膜ZIF-8所标记的红色荧光和线粒体标记的绿色荧光相重合，说明覆膜ZIF-8纳米颗粒和外源性线粒体成功偶联。

实施例3：核酸装载效率的检测

用不同浓度FAM荧光素偶联的Anti-miRNA-127做荧光标曲，合成Anti-miRNA-127后去上清检测上清中残留的Anti-miRNA-127含量以及最终合成的ZIF-8纳米颗粒的质量，最终可得到核酸装载效率，结果表明，ZIF-8纳米颗粒的核酸装载效率可达到90％以上。

实施例4：外源性线粒体和药物递送效率的检测

在传统的线粒体递送中，游离的线粒体主要通过内吞方式被受体细胞所吞噬，然而这种递送方式大的效率较低。本发明利用RAW246.7细胞膜包覆的ZIF-8纳米材料偶联线粒体，以期提高细胞对线粒体的摄取效率。

将3×10

此外，同上，将相同剂量的游离Anti-miRNA-127(33μg)和覆膜ZIF-8偶联的线粒体分别与RAW246.7细胞共孵育。共聚焦显微镜观察细胞对药物摄取效率的差异，结果表明Free-Anti-miRNA-127相比，ZIF-8作为载体后细胞内荧光强度明显增加，荧光强度可达到free-anti-miRNA-127的4倍。

实施例5：基于覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统增加RAW246.7细胞ATP的合成

外源性线粒体移植可以增加受体细胞的ATP生成及降低线粒体活性氧的产生。因此，我们设立了细胞炎症模型，即通过2mL 100ng/L的脂多糖(LPS)溶液刺激3×10

细胞内活性氧的检测：同上述模型相同，LPS刺激RAW246.7细胞12h，用同剂量线粒体(15μg)处理细胞12h，用MitoSoX Red探针检测细胞内线粒体活性氧的产生。如图3b所示，通过红色荧光强度可知，覆膜ZIF-8偶联外源性线粒体处理组细胞内活性氧水平显著降低。

实施例6：覆膜ZIF-8偶联外源性线粒体纳米颗粒治疗急性肺损伤的效果

6-8周龄的C57小鼠(20～22g)(购自杭斯生物科公司)随机分为8个组(每组3只)，分别(1)空白对照组；(2)LPS造模组；(3)ZIF-8载体组(无anti-miRNA-127，给药量为0.2mg)；(4)Free-anti-miRNA-127组；(5)Anti-miRNA-127@ZIF@Ma组；(6)Free-Mito组；(7)Mito@ZIF@Ma组(无anti-miRNA-127)；(8)Anti-miRNA-127/Mito@ZIF@Ma组。除空白对照组外，其他组用100μL LPS(1mg/kg)气管滴注，4h后按不同分组进行尾静脉注射给药，(4)～(8)组中任意几组的组合使用相同剂量的anti-miRNA-127(0.0193mg)和/或相同剂量的Mito(0.06mg)进行给药，给药24h后取肺组织，用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋和切片后进行H&E染色，观察各组肺切片的病理情况。如图4所示，LPS组和LPS+ZIF组，小鼠肺泡结构塌陷，肺泡间隔增厚，肺膜透明度改变，有大量炎性细胞浸润。其他给药组处理后，肺泡壁厚度减少，炎性细胞浸润减少，炎症减轻。H&E结果显示Anti-miRNA-127@ZIF@Ma组(5)、Mito@ZIF@Ma组(7)、Anti-miRNA-127/Mito@ZIF@Ma组(8)表现肺部炎症明显减轻。其中，Anti-miRNA-127/Mito@ZIF@Ma组(8)的炎症减轻最为明显，相较于其他组别，从HE切片看出肺泡结构较为完整，肺泡壁厚度减少，炎性细胞浸润减少。因此，以上结果表明覆膜ZIF-8偶联的外源性线粒体对急性肺损伤具有良好的治疗效果。此外，利用高剂量的LPS10mg/kg对6-8周龄的C57小鼠(20～22g)气管滴注，建立急性肺损伤模型，并同上述给药方式进行给药24h，结果表明，造模组生存率为20％，free-Mito组生存率为40％，Anti-miRNA-127/Mito@ZIF@Ma生存率为80％。

本方法基于负载anti-miRNA-127的金属有机框架材料ZIF-8和巨噬细胞来源的线粒体，通过覆膜、生物偶联等手段，制备得到同时具有靶向巨噬细胞、递送anti-miRNA-127、转移外源性线粒体的多功能靶向纳米递送系统。本发明所构建的纳米材料，经尾静脉后，可靶向至巨噬细胞，通过降低肺部炎症、提高肺巨噬细胞能量代谢、恢复氧化-还原平衡，从而缓解LPS诱导的急性肺损伤、促进组织修复。

综上，本发明所构建的覆膜ZIF-8纳米靶向递送系统能够有效增强外源性线粒体的递送，并对急性肺损伤具有良好的治疗效果。

本发明提供了一种基于覆膜ZIF-8的外源性线粒体递送系统及其制备和应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。