奥拉替尼在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用

技术领域

本申请涉及奥拉替尼用途技术领域，具体涉及奥拉替尼在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用。

背景技术

奥拉替尼(Oclacitinib，CAS：1208319-26-9)是一种新型、高效的非受体酪氨酸激酶(Janus Kinase,JAK)抑制剂，靶向参与瘙痒和炎症的细胞因子的信号通路，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-13和IL-31。在体外分离的酶测试系统中，奥拉替尼对JAK1、JAK2、JAK3和TYK2的半数抑制浓度(IC50)分别为10nm、18nm、99nm和84nm。可见，奥拉替尼对JAK1的选择性最强，其与JAK1的结合能力分别是JAK2的1.8倍、JAK3的9.9倍。奥拉替尼最早在美国和欧盟被批准用于治疗宠物的过敏性皮炎以及与过敏性皮炎相关的瘙痒症，直到2018年才出现首例将奥拉替尼用于治疗人特应性皮炎的报道。

发明内容

然而，本申请发明人发现奥拉替尼具有抗流感病毒的应用前景。

为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：

第一方面，实施例公开了奥拉替尼在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用。术语“抗”，意为干扰流感病毒的感染进程；抑制流感病毒的生长；抑制流感病毒的复制；抑制流感病毒产生的炎症效应；提高感染流感病毒机体的生存率；延缓感染流感病毒引起的机体体重下降速度；改善或避免感染流感病毒引起机体的细胞损伤；改善或避免感染流感病毒引起机体的肺泡结构损伤；改善或避免感染流感病毒引起机体的心肌组织损伤；或消除、改善或避免感染流感病毒引起机体的中耳炎中的至少一项。

在第一方面的实施例中，所述流感病毒选自甲、乙型流感病毒中的一种或多种。在一些实施例中，所述流感病毒选自甲型流感病毒H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型及所有亚型的禽流感病毒中的至少一种。

在第一方面的实施例中，所述应用选自：避免或降低流感病毒的感染率；抑制流感病毒的生长；抑制流感病毒的复制；抑制流感病毒产生的炎症效应；提高感染流感病毒机体的生存率；延缓感染流感病毒引起的机体体重下降速度；改善或避免感染流感病毒引起机体的细胞损伤；改善或避免感染流感病毒引起机体的肺泡结构损伤；改善或避免感染流感病毒引起机体的心肌组织损伤；或消除、改善或避免感染流感病毒引起机体的中耳炎中的至少一项。

在第一方面的实施例中，所述抑制流感病毒产生的炎症效应包括：抑制IL-8、IP-10或MCP-1中至少一项的表达。

第二方面，实施例公开了一种组合物。所述组合物包括具有抗流感病毒有效量的奥拉替尼和药学上可接受的辅料。

在第二方面的一些实施例中，所述药学上可接受的辅料选自溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、赋形剂、调味剂和载体中一种或多种。在一些实施例中，所述组合物的剂型包括片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。

第三方面，实施例公开了一种抗流感病毒的组合物，其包含奥拉替尼和其他抗病毒或者抗炎症组分，所述其他组分选自但不局限于以下组分之一：抗病毒药(金刚烷胺、金刚乙胺、巴洛沙韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、利巴韦林、干扰素、阿比多尔、瑞德西韦)；非甾体抗炎药(阿司匹林、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、吲哚美辛、酮洛芬、美洛昔康、塞来昔布、吡罗昔康、舒林达)；糖皮质激素(强的松、甲强的松龙、地塞米松、氢化可的松、曲安奈德、倍他米松)；其它消炎药(秋水仙碱、别嘌呤醇、非布司他、甲氨蝶呤、TNF抑制剂、IL-6抑制剂、JAK抑制剂、选择性COX-2抑制剂)。

第四方面，实施例公开了一种抗流感病毒的药物。所述药物为包含浓度不低于0.01μM奥拉替尼的溶液。

在第三方面的一些细胞水平实验的实施例中，所测试的药物为包含浓度不低于0.01μM奥拉替尼的溶液，分别含0.01μM、0.03μM、0.09μM、0.27μM、0.82μM、2.47μM、7.41μM、22.22μM、66.67μM奥拉替尼的溶液。而在一些动物实验的实施例中，所述药物为包含浓度不低于2mg/mL的奥拉替尼。

一个测试例发现，奥拉替尼对U937细胞无毒性，但对感染流感病毒细胞U937产生的三种炎症因子IL-8、IP-10和MCP-1都能够有效的抑制。在U937细胞中，奥拉替尼对IL-8、IP-10和MCP-1的EC50依次为0.05μM、0.18μM和0.19μM。并经计算发现，奥拉替尼对IL-8、IP-10和MCP-1三种炎症因子的选择指数依次为1000、277.8和263.2。该测试例表明，奥拉替尼具有较低的毒性和良好的抗炎效果。

一个测试例发现，奥拉替尼在致死剂量流感病毒感染的小鼠模型中具有良好的治疗效果，可以显著降低小鼠体重下降的幅度、降低小鼠肺泡灌洗液中的炎症因子水平、缓解临床病理病变、提高小鼠的存活时间和存活率。同时，该奥拉替尼可以在感染三天后给药发挥作用，与现有的抗病毒药物互补，这使得奥拉替尼具有非常大的临床应用前景。

术语“药学上可接受的辅料”是指不干扰化合物奥拉替尼的生物活性的效力并在其施用的治疗有效量浓度下对机体不具有明显毒性的组分，包括溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、赋形剂、调味剂等和载体中的任意一种或至少两种的组合。将前述组分用于药学活性物质是本领域所熟知的。例如，所述溶剂包括但不限于水、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)，载体包括但不限于：聚乙二醇、聚羟基乙氧基化蓖麻油、花生油、橄榄油、明胶、乳糖、石膏粉、蔗糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚。各组分能够单独使用或与多种混合使用。

术语“有效量”、“治疗有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状所需的化合物、试剂、制剂或组合物的量，其预期目标能够为症状或病因的消减和/或缓解，或机体的任何其他所需变化。例如，治疗有效量是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本申请公开化合物的组合物的量，可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量。治疗有效量将根据化合物活性、病毒感染引起的病症及其严重程度，以及待治疗的个体的大小和健康情况等而变化。示例性地，在小鼠模型中的治疗有效量能够为1mg/kg-150mg/kg，优选为1mg/kg-100mg/kg，更优地，为5mg/kg-30mg/kg，如10mg/kg或20mg/kg，2次/天。

术语”治疗”及其类似语涵盖对人类或人以外的动物的任何疗法，治疗能够针对已有的病症，或者能够是预防性的(预防性治疗)，其包括治愈、减轻或预防效果。治疗还能够包括治愈、减轻或预防与疾病有关的症状而不是作用于疾病的潜在起因。术语“预防”及其类似语包括使病患减少疾病或病症的发生或恶化的可能性，如针对暴露流感病毒环境后尚未出现流感病毒感染的服药期内，治疗能够是针对初次感染或潜伏病毒激活后的感染的治疗。

本申请所提供的组合物能够适应于任何形式的给药方式进行抗流感病毒的预防和/或治疗，包括但不仅限于口服、鼻腔、经皮、静脉内及肠胃给药，优选通过口服途径给药。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，用于口服给药时，可制成常规的固体制剂及液体制剂。在一些具体的实施方式中，剂型包括但不限于：片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂等。

本申请所提供的组合物能够为单剂量或者多剂量形式。可选地，所述奥拉替尼在所述组合物中的终浓度为0.01μM-200μM。该浓度是指如液体制剂的组合物中BMS-奥拉替尼的终浓度，治疗时服用的奥拉替尼的量根据终浓度、剂量形式和待治疗的个体调整以保证达到治疗有效量。

附图说明

图1为实施例提供的奥拉替尼的细胞毒性和抗炎症活性结果。

图2为实施例提供的奥拉替尼处理感染流感病毒小鼠的体重变化结果。

图3为实施例提供的奥拉替尼处理感染流感病毒小鼠的存活率结果。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白(Nucleoprotein,NP)与基质蛋白(Matrixprotein,M)的抗原性和基因特性的差异，流感病毒可分为A、B、C、D四个型，也称为甲、乙、丙、丁型流感病毒。A型流感病毒的基因组为8节段的单股负链RNA，病毒基因组全长约为13.6kb，可编码18种病毒蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2、PB1-F2、PB1-N40、PA-X、M42、NS3、PA-N155、PA-N182、PB2-S1)。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的差异，A型流感病毒可进一步分为18个HA亚型和11个NA亚型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中H5N1亚型的致死率最高。B型流感病毒通常只感染人，并且不会引起世界范围的流感大流行。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人和猪。D型流感病毒仅感染反刍类动物。

流感病毒自20世纪初发现以来已在全球造成多次大流行，给人类的生命和财产造成了巨大的损失。流感大流行导致全球约有5％～15％的人被感染，其中有300万～500万为重病例，可导致25万～50万重症患者死亡。目前治疗流感的药物主要是神经氨酸酶抑制剂，此类药物的代表是奥司他韦和扎那米维。此类药物对所有已知的人流感病毒和高致病性禽流感病毒均有效。但这些抗病毒药物需要在症状出现后的48小时以内服用才会有较好的治疗效果。超出这个窗口期，疗效会大大下降。造成这种现象的原因是在感染的中后期病毒会引发过度的炎症反应，促发“炎症因子风暴”，仅仅抑制病毒复制不足以控制疾病的进展，因此需要开发出能有效缓解流感炎症的药物。

目前，治疗流感药物评价模型主要分为体外模型(in vitro model)和体内模型(in vivo model)。体外模型主要使用各种流感病毒易感细胞系或流感病毒病理相关细胞系对药物进行评价，其优点在于可提供大量遗传性状相同的细胞，具有操作方便可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物毒性、有效浓度和选择指数，为后期机理研究提供更多基础。体内模型一般使用各种模式动物感染模型，通过药物处理后的各种表型指标来衡量药物在活体动物内的整体效果。其优点是可对候选药物在活体内的效果进行真实、系统的评价。

一些测试例采用能产生三个重要促炎因子的人单核细胞系U937对奥拉替尼的体外抗炎效果进行定量分析，并计算其选择指数。一些测试例采用致死剂量流感病毒感染的小鼠模型对奥拉替尼的体内抗流感效果进行评价。

1、测试材料

U937细胞：购自美国菌种保藏中心(ATCC)(CRL-1593.2)；

病毒株：A型流感病毒H1N1亚型A/Puerto Rico/8/1934，由中国科学院武汉病毒研究所病毒保藏中心提供。

RPMI-1640培养基，胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司；Cell titer-glo细胞活性检测试剂盒购自Promega公司(Promega,Madison,WI,USA)。Varioskan LUX多功能酶标仪购自Thermo scientific公司；CO

2、细胞水平测试

(1)细胞培养

将冻存的U937细胞复苏并经过2次传代后，用RPMI-1640完全培养基(RPMI-1640培养基，10％血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)扩大培养，接种密度不低于1×10

(2)供试品溶液的配制

配制含10mM奥拉替尼(购自TargetMol公司)的DMSO溶液，以作为供试品溶液。

(3)奥拉替尼的细胞毒性检测

药物处理孔：U937细胞按1.5×10

未处理对照孔：与药物处理孔的区别在于，未添加供试品溶液。

计算细胞存活率(％)＝(药物处理孔的OD450/未处理对照孔的OD450)×100％

如图1所示，奥拉替尼以最高浓度200μM处理U937细胞并依次做3倍倍比稀释，共10个稀释度。当使用66.67μM处理48小时后，细胞表现出微弱毒性。当使用22.22μM处理48小时后，细胞活力与对照组相比无差别，说明奥拉替尼在此浓度下对细胞无毒性。

(4)抗炎活性测试

药物处理孔：将U937细胞按1.5×10

病毒对照孔：与药物处理孔的区别在于未加供试品溶液。

空白对照孔：与药物处理孔的区别在于，未加入PR8病毒溶液和供试品溶液。

计算各检测孔中药物对炎症因子的抑制率(％)＝100％－(药物处理孔的OD450－空白对照孔的OD450)/(病毒对照孔的OD450－空白对照孔的OD450)×100％

结果如图1所示，奥拉替尼可显著抑制IL-8、IP-10和MCP-1的产量，并呈剂量依赖性抑制，其半数有效浓度EC50分别为0.05μM、0.18μM、0.19μM。

药物选择指数(SI)用于判断药物效果的安全范围，选择指数大于1以上为有效，指数越大安全范围越大。计算公式为：SI＝CC50/EC50。结合以上结果，奥拉替尼在U937上对三个炎症因子的选择指数依次为1000、277.8和263.2，均远大于1。由此说明，奥拉替尼具备抗流感病毒引发的炎症作用。

3、动物水平测试

(1)测试材料

测试动物：SPF级6～8周龄BALB/c雌鼠购自广东省医学实验动物中心。

(2)供试品溶液的配制

以2mg/mL的供试品溶液为例：

取2mg的奥拉替尼(购自TargetMol公司)粉末溶解到20μL DMSO溶液中(DMSO终浓度为2％)，待药物完全溶解后加入300μL PEG300(PEG300终浓度为30％)混合均匀使其澄清，向上述体系中加入50μL Tween80(Tween80终浓度为5％)混合均匀使其澄清，向上述体系中加入630μL超纯水定容至1ml，得到含2mg/mL奥拉替尼的供试品溶液。

(3)测试过程

将6～8周龄的BALB/c雌鼠使用异弗烷将小鼠麻醉后采用滴鼻的方式接种50μL含有125TCID50的PR8流感病毒，随机分为药物组(Peficitinib)和安慰剂组(Placebo)。另外，取正常的6～8周龄的BALB/c雌鼠接种与攻毒组小鼠同等体积的PBS作为阴性对照组(PBS)。每组包含10只小鼠。

药物组的给药：于感染病毒后第3天，灌胃给予小鼠剂量为7.5mg/kg/d的含有奥拉替尼的2mg/mL的供试品溶液，每天给药2次，连续给药5天。

安慰组的给药：以与药物组相同的给药方式、给药周期和给药体积的安慰剂(0.5％(w/v)的羧甲基纤维素钠溶液)。

阴性对照组的给药：以与药物组相同的给药方式、给药周期和给药体积的pH＝7.0的PBS溶液。

每天定时称量每组小鼠体重、观察临床病理状态并记录打分、观察小鼠生存状况。给药完成后，每天继续观察、记录小鼠的体重和临床打分，定时更换垫料、添加饮水和食物，及时取出死亡小鼠，直至实验结束。根据统计结果，绘制小鼠体重变化曲线、临床病理打分曲线和存活率曲线。

(4)测试结果

如图2所示，与安慰剂组相比，奥拉替尼治疗小鼠的平均体重下降幅度显著减弱，在病毒感染后的第9天，奥拉替尼治疗小鼠的平均体重开始逐渐恢复，而placebo对照组小鼠平均体重直到第14天才开始缓慢恢复。

如图3所示，当以300TCID

上述结果表明，奥拉替尼在小鼠体内有明显的抗流感病毒引发的炎症效果。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。