一种用于光动力学疗法的肿瘤靶向脂质体、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及脂质体类医药配制品领域，具体涉及一种用于光动力学疗法的肿瘤靶向脂质体、制备方法及其应用。

背景技术

随着科学技术的不断发展，人们对于肿瘤治疗的研究也越来越深入。肿瘤光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是一种相对新颖的肿瘤无创治疗方法，其机制是利用特定波长的光源照射激活肿瘤组织中的光敏剂，从而产生具有生物毒性的单态氧等活性氧物质(Reactive oxygen species，ROS)，这些活性氧物质进一步氧化损伤肿瘤、病毒感染细胞及其他过度增殖细胞。光动力疗法适应症广泛，对于体表、口腔、耳、眼、鼻、喉、子宫以及通过内窥镜可以达到的部位如气管、支气管、食道、喷门、胃、结肠、直肠、膀胱等部位的癌症均可用光动力疗法。

铜离子-半胱氨酸是一种新型的光敏剂，通过有针对性地将铜离子-半胱氨酸传递到肿瘤细胞中，当它暴露在适当波长的光下时可以对肿瘤组织进行有选择性的损伤和破坏，减少对正常组织的副作用，从而达到治疗肿瘤的目的。铜离子也可以通过与肿瘤细胞表面的巯基(-SH)发生反应，形成铜硫键(Cu-S)，从而对肿瘤细胞造成损伤。CN105233283B公开了一种光动力治疗深部肿瘤靶向纳米光敏剂及其制备方法，利用蛋白质、多肽或氨基酸(半胱氨酸)与可溶性铜盐溶液反应，再经还原后得到一价蛋白质螯合靶向纳米光敏剂、多肽铜螯合或氨基酸铜螯合靶向纳米光敏剂。

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)也是一种新型的光敏剂，5-氨基乙酰丙酸可以作为光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)的药物前体，5-氨基乙酰丙酸进入肿瘤细胞后，通过内源性代谢产生的催化作用，转化为具有光敏活性的荧光素。随后，使用特定波长的光照射荧光素，激活其产生活性氧和自由基，从而引起肿瘤细胞的损伤和死亡。5-氨基乙酰丙酸在光动力疗法中的应用还可以激活免疫系统，增强机体对肿瘤的免疫反应。PDT过程中产生的光敏物质和活性氧可以促进肿瘤抗原的释放和免疫细胞的活化，从而引发针对肿瘤的免疫反应。CN116271114A公开了一种装载5-氨基乙酰丙酸的脂质组装体及其制法，所述脂质组装体为中空的球体，以反应性磷脂PEG试剂螯合形成外层亲水的磷脂-螯合剂结合物为核心，磷脂-螯合剂结合物的外层通过腙键偶联装载5-氨基乙酰丙酸，再结合做为内光源激发光敏剂的放射性核素所构成。

pH敏感脂质体作为肿瘤组织靶向药物载体具有独特优势。肿瘤组织的pH通常低于正常组织，处于5.3-6.3的范围。在中性和弱碱性条件下，pH敏感脂质体相对稳定，但在酸性条件下则不稳定。当生理环境的pH值从7.4变为肿瘤组织微环境的5.3-6.3时，pH敏感脂质体的膜结构会发生改变，导致药物释放，发挥抗肿瘤效果。目前已经有较多文献报告将脂质体用于负载光敏剂，例如上文的CN116271114A，但还未有将pH敏感脂质体负载光敏剂的文献报告。

此外，光动力学疗法成功治疗肿瘤的前提是肿瘤组织必须富集足够量的光敏剂，因此设计合适的给药载体将光敏剂向肿瘤组织选择性的富集是光动力疗法治疗肿瘤的关键。目前负载光敏剂的文献，由于仅在脂质体内部负载光敏剂，容易导致光敏剂的含量偏低。

基于上述技术问题，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于光动力学疗法的肿瘤靶向脂质体、制备方法及其应用，所述的肿瘤脂质体能够同时向肿瘤组织定位输送高含量的多种光敏剂，且具有pH敏感特性和体内肿瘤组织特异性结合的特性。

本发明的第一方面提供了一种用于组装肿瘤靶向性脂质体的光敏剂前体，所述光敏剂前体为5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物，所述光敏剂前体的结构式如式I所示：

本发明光敏剂前体的作用机理为：5-氨基乙酰丙酸通过与巯基乙酸异辛酯的偶联，提高了5-氨基乙酰丙酸的稳定性；偶联物结构中，5-氨基乙酰丙酸为亲水端，巯基乙酸异辛酯为疏水端，用于脂质体时，可参与脂质体磷脂双层膜的组装，脂质体的内部和双层膜中均可负载光敏剂，提高了光敏剂的含量；此外，肿瘤组织具有选择性的摄取体内过多的5-氨基乙酰丙酸，亲水端(5-氨基乙酰丙酸)暴露于脂质体的表面作为肿瘤组织识别靶标，实现了脂质体与肿瘤的特异亲和特性。

在一个或多个实施方案中，所述光敏剂前体的制备方法为：在有机溶液中使用碳二亚胺类缩合剂活化5-氨基乙酰丙酸，滴加到巯基乙酸异辛酯有机溶液中反应，制备得到所述光敏剂前体。

进一步地，所述碳二亚胺类缩合剂为N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)。

本发明的第二方面，提供了一种用于光动力学疗法的肿瘤靶向脂质体，所述肿瘤靶向脂质体包括空白脂质体和负载的光敏剂，所述空白脂质体包含磷脂分子、pH敏感脂质、本发明第一方面的光敏剂前体(5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物)；所述磷脂分子、pH敏感脂质、光敏剂前体和光敏剂的质量比例为：10～15:2～4:0.5～2:0.5～2，所述光敏剂为可用于光动力疗法的光敏剂。

进一步地，所述磷脂分子选自大豆磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱中的一种或多种。

进一步地，所述pH敏感脂质选自胆固醇半琥珀酸酯、二棕榈酸磷脂、十七烷酸磷脂、N-十六酰、L-高半胱氨酸、二油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。脂质体双层膜包含pH敏感，随血液循环进入肿瘤微环境后，由于pH偏低，在pH敏感材料的作用下促使光敏剂前体和光敏剂的快速释放，最终实现了光敏剂在肿瘤组织中的富集。

进一步地，所述光敏剂选自5-氨基乙酰丙酸、铜离子-半胱氨酸配合物的一种或两种；优选为铜离子-半胱氨酸配合物。由于不同光敏剂的作用机理略微不同，所以不同光敏剂之间可以产生协同作用，例如铜离子可以通过形成铜硫键对肿瘤细胞造成损伤，5-氨基乙酰丙酸可以激活免疫系统，增强机体对肿瘤的免疫反应，因而在优选的技术方案中，铜离子-半胱氨酸和5-氨基乙酰丙酸的共装载，有助于在光动力学(PDT)过程中发挥协同效果。

在一个或多个实施方案中，所述肿瘤靶向脂质体的制备方法为：将光敏剂的水溶液加到含有磷脂分子、pH敏感脂质、本发明第一方面的光敏剂前体的有机相中，搅拌得到初级乳液；在初级乳液中滴加二次乳化分散剂的水溶液，搅拌得到双乳液；去除有机溶剂，得到肿瘤靶向脂质体。

进一步地，所述二次乳化分散剂为聚乙烯醇。

进一步地，所述制备方法还包括得到脂质体后冷冻干燥保存的步骤。

本发明的第三方面提供了一种用于光动力学疗法的肿瘤靶向脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤为食道癌、胃癌、肺癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌或子宫内膜癌等。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

(1)本发明的通过5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯的偶联，提高了5-氨基乙酰丙酸的稳定性；

(2)5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物用于脂质体时，参与脂质体组装，提高了光敏剂的含量，并通过脂质体表面的5-氨基乙酰丙酸提高肿瘤组织靶向性。

(3)本发明的肿瘤靶向脂质体多种光敏剂的共负载，例如铜离子-半胱氨酸和5-氨基乙酰丙酸，有助于在光动力学(PDT)过程中发挥协同效果。

(4)本发明的肿瘤靶向脂质体具有pH敏感性，随血液循环进入肿瘤组织后，由于肿瘤微环境的偏低pH，实现光敏剂的快速释放，增加了光敏剂在肿瘤组织中的富集。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明实施的实施例，并与说明书一起用于解释本发明实施例的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明实施的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例3制备的pH敏感脂质体结构示意图；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围。

实施例1 5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物的制备

取0.1g 5-氨基乙酰丙酸，0.5mL 120mM N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)乙醇溶液及0.5mL吡啶加入5mL二甲基亚砜溶解混合均匀得5-氨基乙酰丙酸活化液，氮气保护。混合物缓慢滴加到0.1g巯基乙酸异辛酯的二甲基亚砜溶液中。在惰性气氛下搅拌混合反应物8小时，产物经丙酮结晶得5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物。

实施例2铜离子-半胱氨酸配合物的制备

将0.1g的硫酸铜、0.3g的半胱氨酸溶解在50mL pH7.2Tris缓冲溶液中。在70℃温度下将反应溶液磁力搅拌4h后置冰箱冷藏放置48h，以促使铜离子半胱氨酸配合物结晶沉淀，过滤、真空干燥得铜离子-半胱氨酸配合物。

实施例3负载铜离子-半胱氨酸配合物和5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物的pH敏感脂质体制备

将含有10mg铜离子-半胱氨酸配合物的5mL蒸馏水滴加到含有10mg 5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物、100mg磷脂酰胆碱、30mg胆固醇半琥珀酸酯的5mL乙酸乙酯的有机相中，在35000r.p.m的搅拌速率下得到初级乳液。将初级乳液超声处理并逐滴注入2％聚乙烯醇溶液(5mL)中，连续搅拌1h，得到负载铜离子-半胱氨酸配合物和5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物的W/O/W双乳液。在室温下继续搅拌以蒸发有机溶剂得负载铜离子-半胱氨酸配合物和5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物的pH敏感脂质体。pH敏感脂质体的结构示意图如图1所示。

对比例1负载铜离子-半胱氨酸配合物的pH敏感脂质体制备

制备方法同实施例3，区别在于没有装载5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物。将含有10mg铜离子-半胱氨酸配合物的5mL蒸馏水滴加到含有100mg磷脂酰胆碱、30mg胆固醇半琥珀酸酯的5mL乙酸乙酯的有机相中，在35000r.p.m的搅拌速率下得到初级乳液。将初级乳液超声处理并逐滴注入2％聚乙烯醇溶液(5mL)中，连续搅拌1h，得到负载铜离子-半胱氨酸配合物的W/O/W双乳液。在室温下继续搅拌以蒸发有机溶剂得负载铜离子-半胱氨酸配合物的pH敏感脂质体。

对比例2负载5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物的pH敏感脂质体制备

制备方法同实施例3，区别在于没有装载铜离子-半胱氨酸配合物。将5mL蒸馏水滴加到含有10mg 5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物、100mg磷脂酰胆碱、30mg胆固醇半琥珀酸酯的5mL乙酸乙酯的有机相中，在35000r.p.m的搅拌速率下得到初级乳液。将初级乳液超声处理并逐滴注入2％聚乙烯醇溶液(5mL)中，连续搅拌1h，得到负载5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物的W/O/W双乳液。在室温下继续搅拌以蒸发有机溶剂得负载5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物的pH敏感脂质体。

对比例3负载5-氨基乙酰丙酸的pH敏感脂质体的制备

制备方法同对比例2，区别在于将对比例2中5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物替换为5-氨基乙酰丙酸。将含有10mg 5-氨基乙酰丙酸的5mL蒸馏水滴加到含有100mg磷脂酰胆碱、30mg胆固醇半琥珀酸酯的5mL乙酸乙酯的有机相中，在35,000r.p.m的搅拌速率下得到初级乳液。将初级乳液超声处理并逐滴注入2％聚乙烯醇溶液(5mL)中，连续搅拌1h，得到负载5-氨基乙酰丙酸的W/O/W双乳液。在室温下继续搅拌以蒸发有机溶剂得负载5-氨基乙酰丙酸的pH敏感脂质体。

实施例与对比例的性能测试方法及结果

(1)5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物稳定性实验

色谱条件：

C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-20mmol·L-1磷酸二氢钾(B)(pH值2.0，含2.0mmol·L-1辛烷磺酸钠)；梯度洗脱程序：0～5分钟18％ A，5～10分钟18％ A～55％ A，10～15分钟55％ A，15～20分钟55％ A～18％ A；流速：0.5mL·min-1；检测波长：205nm；柱温：25℃；进样量：20μL。

测定法：

取5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物和5-氨基乙酰丙酸分别溶于去氧的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，浓度均为2.0mg/mL，密封。高温试验：60℃放置10天，分别于0、5、10天取样，测定含量变化情况；强光照试验：4500Lux条件下放置10天、分别于0、5、10天取样，测定含量变化情况。高温和强光照稳定性实验结果见表1和表2。5-氨基乙酰丙酸是典型的第二代光敏剂，性质不稳定，温度、浓度、pH等都是影响其稳定的重要原因，经高温和强光照试验表明，本发明通过制备5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物作为5-氨基乙酰丙酸的前体增强了5-氨基乙酰丙酸的稳定性。

表1高温稳定性实验结果

表2强光照稳定性实验结果

(2)实施例3的pH敏感脂质体抑瘤率实验

取对数期培养的MCF-7细胞株经过胰酶消化后，使用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬并调整细胞密度为1×10^8个/mL。然后将0.1毫升细胞悬液注射到40只裸小鼠的背部皮下。在25℃、12小时光照、自由进食和饮水、恒温恒湿条件下饲养约10天，直到肿瘤直径约为0.5～0.8厘米时说明荷瘤成功。建模成功后，裸小鼠被随机分为5组：模型组(A组)、实施例3组(B组)、对比例1组(C组)、对比例2组(D组)、对比例3组(E组)。A组接受尾静脉注射无菌生理盐水溶液，B组、C组、D组及E组分别接受尾静脉注射实施例3、对比例1组、对比例2组、对比例3脂质生理盐水悬液(给药浓度按铜离子-半胱氨酸配合物或5-氨基乙酰丙酸计为10mg/kg)。于注射后1、5、10天，各组使用半导体激光治疗仪(输出功率100W、波长630nm、光照密度120J/cm^2)对肿瘤进行局部照射治疗，每次治疗持续20分钟。在给药前和给药后第14天，使用游标卡尺分别测量各组肿瘤的长度、宽度和高度，并计算肿瘤体积和抑瘤率。结果如表3所示。

表3肿瘤体积和抑瘤率

由结果可见，B组(实施例3)抑瘤率最大，说明铜离子-半胱氨酸配合物和5-氨基乙酰丙酸在肿瘤组织内发生了协同抗肿瘤作用，而且由于5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物亲水一端(5-氨基乙酰丙酸)作为肿瘤组织识别脂质体的靶标增强了肿瘤组织靶向性，提高了抑瘤效果。D组(对比例2)大于E组(对比例3)，这也证明了由于5-氨基乙酰丙酸与巯基乙酸异辛酯偶联物亲水一端(5-氨基乙酰丙酸)作为肿瘤组织识别脂质体的靶标增强了肿瘤组织靶向性。

最后说明的是，以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。