功能强化的新型嵌合抗原受体

技术领域

本发明涉及一种新型嵌合抗原受体、包含其的免疫细胞及其用途，所述新型嵌合抗原受体使用已知在细胞粘附及迁移中起主要作用的CD99L2的部分区域作为嵌合抗原受体的骨架(backbone)。

背景技术

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞是一种在从患者血液中分离的T细胞中人工表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；CAR)的基因导入T细胞(Kershaw MH，et al.，NatRev Immunol.2005；5(12):928-40)，所述嵌合抗原受体为将与肿瘤细胞表面的癌抗原特异性结合的重组抗体(scFv等)区域与T细胞受体的信号传导区进行连接的融合蛋白。当CAR蛋白质基因以逆转录病毒(retrovirus)或慢病毒(lentivirus)形式导入T细胞时，由于基因导入效率高，2周内50％以上的T细胞的表面表达CAR蛋白质，从而可在短时间内制备出大量肿瘤特异性T细胞。

就制备的CAR-T细胞而言，当CAR蛋白质的抗体区识别肿瘤时，通过向T细胞内部传递激活信号来起到杀伤肿瘤的肿瘤杀伤细胞的作用。因此，自2000年代末以来，CAR-T细胞疗法的临床试验迅速增加(Jena B，et al.，Blood.2010；116(7):1035-44)。尤其，以作为B淋巴细胞血液肿瘤癌抗原的CD19作为靶标的CAR-T细胞治疗从初期临床试验开始就显示出令人瞩目的成果。2010年左右，原本在B细胞淋巴瘤中表现出部分效果的CD19 CAR-T细胞治疗,自从宾夕法尼亚大学的研究小组给出其对现有治疗没有效果的慢性淋巴细胞白血病患者取得完全缓解的报告开始，最近使得对现有所有治疗没有效果的急性淋巴细胞白血病患者30名中的27名在一个月内得到完全缓解，并且能表现出6个月整体存活率达到78％的惊人治疗效果，从而使得所述CD19 CAR-T细胞治疗呈现出快速增长的趋势，如多家跨国制药公司的大规模投资等(Maude SL，et al.，N Engl J Med.2014；371(16):1507-17)。其结果，两种CD19靶标CAR-T细胞疗法于2017年末获得美国食品药品监督管理局(FDA)认证。

目前，CAR-T细胞开发主要集中在血液肿瘤，并且处于向部分实体瘤扩展的阶段(Yip A，Webster RM，Nat Rev Drug Discov.2018；17(3):161-2)。作为主要血液肿瘤靶标，针对多发性骨髓瘤的抗-B细胞成熟抗原(BCMA)CAR-T细胞疗法处于领先地位，并且对于B淋巴血液肿瘤抗原，除了CD19之外，也正开发针对CD20及CD22等的CAR-T细胞疗法。针对实体瘤的CAR-T细胞疗法正在对GD2(脑肿瘤)及间皮素(Mesothelin)(胸膜癌)等进行部分临床试验，但尚未报道出显著的功效。推测其原因为，就实体瘤而言，存在多个阻碍CAR-T细胞的效力的因素。例如，可以理解为：与肿瘤细胞主要分布在血液中而不能很好地生成肿瘤微环境的白血病相比，实体瘤可以构建免疫抵抗性肿瘤微环境，例如，分泌免疫抑制细胞因子(cytokine)(如，TGF-beta及IL-10)、或者募集(recruit)免疫抑制细胞(如，调节性T细胞(Regulatory T cell)或髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC))、或者在肿瘤表面表达免疫抑制配体(如，PD-L1)等(Rabinovich GA，et al.，Annu RevImmunol.2007；25:267-96)。因此，为了日后CAR-T细胞疗法的广泛应用，需要开发一种可克服免疫抑制环境并发挥效力的T细胞活性大幅增加的CAR-T细胞。

增强CAR-T细胞的功能的一种策略是通过改变CAR蛋白质自身的结构来增加T细胞激活(Dotti G，et al.，Immunol Rev.2014；257(1):107-26)。CAR蛋白质设计为识别癌抗原的抗体的可变区(variable region)(单链抗体(single chain variable fragment；scFv))通过骨架区(backbone region；胞外间隔区(extracellular spacer)+跨膜结构域(transmembrane domain))与胞内信号传导区连接的形态。胞内信号传导区主要基于作为T细胞受体(T cell receptor)的信号亚基(subunit)的CD3ζ链(zeta chain)的胞内区(intracellular region)(第一代CAR)。目前为止，持续通过修饰(modification)CAR蛋白质来提高CAR-T细胞的功能，并且其中大部分都以替换或添加共刺激分子(co-stimulatorymolecule)的信号传导区的形式进行(Morello A，et al.，Cancer Discov.2016；6(2):133-46)。例如，目前市售的两种CAR-T细胞疗法分别使用CD28和41BB共刺激分子的胞内区(第二代CAR)，而随后尝试同时包含CD28和41BB胞内区的CAR(第三代CAR)等。目前市售的诺华公司的卡美莱(Kymriah)CAR-T细胞和吉利德科学公司的阿基仑赛(Yescarta)CAR-T细胞是分别使用41BB和CD28胞内区的第二代CAR-T细胞。

相反地，在CAR骨架(backbone)区中，CD8、CD28、IgG1或IgG4的部分区域仅用于物理连接功能，几乎没有被赋予功能要素的示例。因此，通过替换CAR骨架(backbone)区，可能能够实现一种诱导CAR-T细胞功能提升的新型修饰。

在这种技术背景下，本发明人通过导入使用包含CD99L2蛋白质的跨膜区的区域作为CAR骨架(backbone)区的新型CAR设计，探索了改善CAR-T细胞的肿瘤治疗功效的可能性。结果表明，与现有CD8骨架CAR(CD8 backbone CAR)-T细胞相比，CD99L2骨架CAR-T细胞表现出显著提高的抗肿瘤功效，从而完成了本发明。

在本背景技术部分中记载的所述信息仅用于提高对本发明的背景的理解，因此对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，可不包括形成已知现有技术的信息。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种表现出提高的肿瘤治疗效果的嵌合抗原受体及包含其的免疫细胞。

本发明的另一目的在于，提供一种编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含所述核酸的表达载体及包含所述表达载体的病毒。

本发明的再一目的在于，提供一种包含所述免疫细胞的癌症治疗用组合物、使用所述免疫细胞的癌症治疗方法、所述免疫细胞在癌症治疗中的用途以及所述免疫细胞在制备癌症治疗用药物中的应用。

为了实现所述目的，本发明提供一种包含CD99L2蛋白质衍生胞外结构域及跨膜结构域的嵌合抗原受体。

本发明还提供一种编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述表达载体的病毒及表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞。

本发明还提供一种包含所述免疫细胞的癌症治疗用组合物、使用所述免疫细胞的癌症治疗方法、所述免疫细胞在癌症治疗中的用途以及所述免疫细胞在制备癌症治疗用药物中的应用。

附图说明

图1是示出CD99L2骨架CAR的设计及体外活性检测结果的图。

图1A是各CAR蛋白质的结构设计示意图(hCD8 L：人CD8a签到序列(human CD8aleader)、αCD19 scFv：抗-CD19抗体(克隆FMC63)单链可变片段(anti-CD19 antibody(clone FMC63)single chain variable fragment)、EC：胞外区(extracellular region)、TM：跨膜区(transmembrane region)、cyt：胞内区(cytoplasmic region))。图1B及图1E是示出CAR-T细胞表面的CAR蛋白质的表达水平的图(图表内数值：细胞比率(％))。图1C及图1F是示出各CAR-T细胞对Raji-Luc淋巴瘤细胞的杀伤力的图表(相对光单位(Relativelight unit)：与CAR-T细胞过夜培养后生存的Raji-Luc细胞中的荧光素酶(luciferase)活性值；效靶比(E:T ratio，Effector:Target ratio)：共同培养的CAR-T细胞(Effector)与Raji-Luc细胞(目标(Target))的细胞数比率)。图1D及图1G是示出共同培养CAR-T细胞和Raji细胞后分泌至上清液中的IFN-γ的量的图表。

图2是CD99L2骨架CAR-T细胞的激活动力学(kinetics)分析结果，其中，图2A和图2B分别为：在共同培养CAR-T细胞和Raji细胞时，CD4阳性(图2A)及CD8阳性(图2B)CAR-T细胞表面激活标志物的表达率根据时间而变化的流式细胞分析结果(MFI：平均荧光强度(mean fluorescent intensity))。

图3是示出CD99L2骨架CAR-T细胞的体内肿瘤去除促进效果的图，具体为：向NSG小鼠静脉注射Raji-Luc细胞后(第0天)，当第7天静脉注射CAR-T细胞时，用生物发光成像(bioluminescence imaging)技术在每个时间段测定肿瘤细胞的体内增殖度的代表图像。

具体实施方式

除非以其他方式定义，本说明书中使用的所有技术术语及科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。通常，本说明书中使用的命名法是本技术领域中众所周知且常用的。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；CAR)是一种将抗体的抗原识别结构域与细胞膜结构域及胞内信号传导结构域连接的人工受体。通过基因导入表达该受体的T细胞(CAR-T细胞)通过抗体结构域来识别肿瘤表面抗原，从而被激活，由此具有特异性杀伤肿瘤的能力。因此，CAR-T细胞被开发为一种结合了抗体的肿瘤靶向能力和T细胞的肿瘤杀伤能力的抗体基因细胞疗法，尤其对血液肿瘤表现出显著的治疗功效，目前已上市了两种以上的CAR-T细胞疗法。然而，在血液中与肿瘤细胞相遇概率高的血液肿瘤中，CAR-T细胞疗法表现出高治疗效率，但对实体瘤却表现出低治疗效率。因此，为了实现CAR-T细胞治疗对于实体瘤的广泛应用，应改善CAR-T细胞的功能。作为CAR-T细胞功能强化策略的一环，人们正在努力通过修饰CAR蛋白质的结构来制备出更有效的CAR蛋白质。

CAR骨架(backbone)区包含跨膜结构域，而新的细胞膜蛋白质跨膜结构域可用于提高CAR功能。在本发明中，作为对象使用了CD99L2。CD99抗原样蛋白2(CD99L2，CD99antigen-like 2)是一种属于CD99家族(family)的细胞膜蛋白质，已知CD99家族蛋白(family protein)主要表达于白血球(leukocyte)和内皮细胞(endothelial cell)等。在功能上，据报道这些蛋白质促进细胞之间的粘附(cell adhesion)及细胞迁移(cellmigration)等(Pasello M，et al.，J Cell Commun Signal.2018；12(1):55-68)。尤其，据报道CD99L2参与炎症条件下嗜中性粒细胞(neutrophil)、单核细胞(monocyte)及T细胞等的血管外渗(extravasation)。另外，提出了在血管内皮细胞上表达的CD99L2具有参与白细胞(leukocyte)的外渗(extravasation)的可能性(Seelige R，et al.，J Immunol.2013；190(3):892-6)。CD99L2与CD99形成异二聚体(heterodimer)(Nam G，et al.，JImmunol.2013；191(11):5730-42)，此外，据报道CD99蛋白质参与T细胞共刺激(T cell co-stimulation)，因此CD99L2也有可能有助于T细胞激活(Oh KI，et al.，Exp Mol Med.2007；39(2):176-84)。

最终，通过本发明设计并制备出了导入CD99L2区的CAR蛋白质，从而提出一种通过T细胞激活来提高功能的CAR-T细胞的新概念。

因此，一方面，本发明涉及一种嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；CAR)，所述嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；CAR)包括：(a)抗原结合结构域(antigen binding domain)；(b)包含胞外连接部和跨膜结构域(transmembrane domain)的骨架(backbone)；以及(c)胞内信号传导结构域(intracellular signaling domain)，其特征在于，所述胞外连接部包含CD99L2衍生胞外结构域(extracellular domain)，所述跨膜结构域包含CD99L2衍生跨膜结构域。

在本发明中，“骨架(backbone)”是指包含胞外连接部(extracellular spacerdomain)和跨膜结构域(transmembrane domain)的区域。

在本发明中，“胞外连接部(extracellular spacer domain)”是指连接抗原结合结构域和跨膜结构域的区域。

在本发明中，所述胞外连接部的特征可以是包含CD99L2衍生胞外结构域(extracellular domain)的整体或部分，优选地，人CD99L2衍生胞外结构域。所述CD99L2衍生胞外结构域的特征在于，可以包含由SEQ ID NO.10表示的氨基酸序列的整体或部分，但不限于此。33]在本发明中，所述跨膜结构域(transmembrane domain；TM)的特征在于，可以包含CD99L2衍生跨膜结构域的整体或部分，优选地，可以包含人CD99L2衍生跨膜结构域。所述CD99L2衍生跨膜结构域的特征在于，可以包含由SEQ ID NO.11表示的氨基酸序列的整体或部分，但不限于此。

另外，在本发明中，所述嵌合抗原受体的特征在于，还可以包含CD99L2衍生胞内结构域(intracellular domain)。

所述CD99L2衍生胞内结构域的特征在于，可以包含CD99L2衍生胞内结构域的整体或部分，优选地，可以包含由SEQ ID NO.12表示的氨基酸序列，但不限于此。

在本发明中，所述胞外连接部的特征在于，还可以包括铰链区(hinge domain)。

所述铰链区的特征在于，可以由任意寡肽或多肽组成，可以包含1个至100个氨基酸残基，优选地，可以包含10个至70个氨基酸残基，但不限于此。

在本发明中，所述胞内信号传导结构域(intracellular signaling domain)是指位于免疫细胞的细胞膜内侧(即细胞质)的部分，当胞外结构域中包含的抗原结合结构域与靶标抗原结合时，所述胞内信号传导结构域通过向细胞内传导信号来激活免疫细胞的免疫反应的区域。

在本发明中，优选地，所述胞内信号传导结构域是选自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcR γ、FcRβ、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d组成的组中的一种以上的胞内信号传导结构域，但不限于此，更优选地，可以是CD3ζ。本发明的CD3ζ的胞内信号传导结构域可具有包含SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14(SEQ ID NO.13的序列中的第14位的氨基酸残基的谷氨酰胺(Q)被赖氨酸(K)取代)的氨基酸序列的氨基酸序列，但不限于此。

另外，本发明的所述胞内信号传导结构域的特征在于，还可以包含共刺激(co-stimulatory)结构域，但不限于此。优选地，本发明的共刺激(co-stimulatory)结构域是选自由CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、ICOS、LFA-1、GITR、MyD88、DAP1、PD-1、LIGHT、NKG2C、B7-H3及CD83配体组成的组中的一种以上的共刺激结构域，但不限于此。

优选地，本发明的胞内信号传导结构域的特征在于，可以包含CD3ζ的胞内信号传导结构域及4-1BB的共刺激结构域，所述CD3ζ的胞内信号传导结构域包含由SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14表示的氨基酸序列，所述4-1BB的共刺激结构域包含由SEQ ID NO.15表示的氨基酸序列，但不限于此。

尤其，本发明的嵌合抗原受体的特征在于，可以包含一种以上的胞内信号传导结构域及一种以上的共刺激结构域。

当本发明的嵌合抗原受体包含一种以上的胞内信号传导结构域及一种以上的共刺激结构域时，一种以上的共刺激结构域与一种以上的胞内信号传导结构域可相互串联连接。在此情况下，各个结构域可直接连接，或可选地，由2个至10个氨基酸残基组成的寡肽接头或多肽接头连接，优选地，作为这种接头序列，可例举甘氨酸-丝氨酸连续序列。

在本发明中，所述嵌合抗原受体还可包含T细胞的免疫功能促进因子，作为所述T细胞的免疫功能促进因子可例举白细胞介素-7(interleukin 7，IL-7)、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或CCL19，但不限于此。针对T细胞的免疫功能促进因子可参照WO2016/056228A。

在本发明中，所述嵌合抗原受体还可包含白细胞介素受体链(interleukinreceptor chain)，所述白细胞介素受体链包含JAK结合基序及STAT 3/5缔合基序，并且可举例为IL-2Rβ，但不限于此。与此相关地，可参照WO2016/127257A。

在第一代CAR中，包含胞外结构域、跨膜结构域及胞内信号传导结构域，所述胞外结构域包含在癌细胞中特异性表达的抗原的识别区，其中，作为信号传导结构域仅使用了CD3ζ，但具有对癌症的治疗效果微乎其微，并且持续时间短的问题。这种第一代CAR具体记载于美国授权专利第6319494号中，并且其将通过引用被并入本发明中。

为了提高对免疫细胞的反应性，制备了结合共刺激结构域(CD28或CD137/4-1BB)和CD3ζ的第二代CAR，与第一代CAR相比，显著增加了体内残留的包含CAR的免疫细胞的数量。相对于第二代CAR使用一种共刺激结构域，在第三代CAR中，使用了两种以上的共刺激结构域。为了实现体内包含CAR的免疫细胞的扩张及持续性，可将共刺激结构域与4-1BB、CD28或OX40等进行结合。第二代CAR具体记载于美国授权专利第7741465号、第7446190号或第9212229号中，第三代CAR具体记载于美国授权专利第8822647号中，并且它们将通过引用被并入本发明中。

在第四代CAR中，包含编码细胞因子(如IL-12或IL-15)的额外基因，可使细胞因子的基于CAR的免疫蛋白额外表达，第五代CAR为了强化免疫细胞而额外包含白细胞介素受体链，例如，IL-2Rβ。第四代CAR具体记载于美国授权专利第10316102号中，第五代CAR具体记载于美国授权专利第10336810号中，并且它们将通过引用被并入本发明中。

在本发明中，所述抗原结合结构域的特征在于，可以包含与选自以下组中的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段(antigen binding fragment)，但不限于此。

4-1BB、B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)、B-细胞激活因子(B-cell activating factor，BAFF)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9，CA9；另外，还已知为CAIX或G250)、癌/睾丸抗原1B(cancer/testis antigen 1B，CTAG1B；另外NY-ESO-1或LAGE2B)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、周期素(cyclin)、周期素A2、周期素B1、C-C基序趋化因子配体1(C-C Motif Chemokine Ligand 1，CCL-l)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD52、CD58、CD62、CD79A、CD79B、CD80、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白多糖4(chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4)、CLDN18(claudin-18)、CLDN6、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)、c-Met(酪氨酸蛋白激酶Met(tyrosine-protein kinase Met))、DLL3、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、截短型表皮生长因子受体(truncatedepidermal growth factor receptor，tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变体(type IIIepidermal growth factor receptor mutation，EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(epithelialglycoprotein 2，EPG-2)、上皮糖蛋白40(epithelial glycoprotein 40，EPG-40)、肝配蛋白(ephrin)B2、肝配蛋白受体A2(ephrin receptor A2，EPHA2)、雌激素受体(estrogenreceptor)、Fc受体(Fc receptor)、Fc受体样蛋白5(Fc receptor like 5，FCRL5；另外，还已知为Fc受体同源物5(Fe receptor homolog 5)或FCRH5)、成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23，FGF23)、叶酸结合蛋白(folate binding protein，FBP)、叶酸受体α(folate receptor alpha，FOLR1)、叶酸受体β(folate receptor beta，FOLR2)、GD2(神经节苷脂(ganglioside)GD2、O-乙酰化GD2(O-acetylated GD2，OGD2))、神经节苷脂(ganglioside)GD3、糖蛋白100(glycoprotein 100，gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)、G蛋白偶联受体5D(G Protein Coupled Receptor 5D，GPCR5D)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase)erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体(dimers)、人高分子量黑色素瘤相关抗原(Human highmolecular weight melanoma-associated antigen，HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、人类白细胞抗原A1(Human leukocyte antigenA1，HLA-A1)、人类白细胞抗原A2(Human leukocyte antigen A2，HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22receptor alpha，IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13receptor alpha 2，IL-13Ra2)、T细胞可诱导共刺激分子(inducible T-cell costimulator，ICOS)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1receptor，IGF-1受体(receptor))、整合素(integrin)αvβ6、干扰素受体(interferon receptor)、IFNγ受体(IFNγR)、白细胞介素2受体(interleukin-2receptor，IL-2R)、白细胞介素4受体(interleukin-4receptor，IL-4R)、白细胞介素5受体(interleukin-5receptor，IL-5R)、白细胞介素6受体(interleukin-6receptor，IL-6R)、白细胞介素17受体A(interleukin-17receptor A，IL-17RA)、白细胞介素31受体(interleukin-31receptor，IL-31R)、白细胞介素36受体(interleukin-36receptor，IL-36R)、激酶插入区受体(kinase insert domain receptor，kdr)、L1细胞粘附分子(L1 cell adhesion molecule，L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位(CE7 epitope of L1-CAM)、富含亮氨酸重复序列蛋白8家族成员A(Leucine Rich Repeat Containing 8FamilyMember A，LRRC8A)、路易斯Y(Lewis Y)、淋巴细胞激活基因3(lymphocyte-activationgene 3，LAG3)、黑色素瘤相关抗原(Melanoma-associated antigen，MAGE)Al、MAGEA3、MAGEA6、MAGEAlO、间皮素(mesothelin，MSLN)、小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，CMV)、粘蛋白1(mucin 1，MUC1)、自然杀伤细胞家族2成员D(natural killer group2member D，NKG2D)配体(ligands)、黑色素瘤抗原A(melan A，MART-l)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)、神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1，NRP-1)、神经纤毛蛋白-2(neuropilin-2，NRP-2)、癌胚胎抗原(oncofetal antigen)、PD-L1、黑色素瘤优先表达抗原(Preferentiallyexpressed antigen of melanoma，PRAME)、黄体酮受体(progesterone receptor)、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen)、前列腺干细胞抗原(prostate stem cellantigen，PSCA)、前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)、核因子κB受体激活因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-βligand，RANKL)、受体酪氨酸激酶样孤儿素受体1(receptor tyrosine kinase like orphanreceptor 1，ROR1)、SLAM家族成员7(SLAM family member 7，SLAMF7)、生存素(survivin)、滋养层糖蛋白(trophoblast glycoprotein，TPBG；另外，还已知为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(tumor-associated glycoprotein 72，TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosine relatedprotein 1，TRP1；另外，TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosine related protein2，TRP2；另外，还已知为多巴色素互变异构酶(dopachrome tautomerase)、多巴色素δ异构酶(dopachrome delta-isomerase)或DCT)及肾母细胞瘤(Wilms Tumor 1；WT1)。

在本发明中，抗体的“片段”是指具有抗原结合功能的片段，并且用作包含scFv、Fab、F(ab’)2、Fv及纳米抗体(nanobody)片段等的含义。

“单链(单一链)Fv”或“单链可变片段(single chain variable fragment，scFv)”抗体片段包含抗体的VH及VL结构域，而这些结构域存在于单个多肽链内。Fv多肽还可包含VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，以使scFv为实现抗原结合而形成所需的结构。

“Fv”片段是一种含有完整的抗体识别及结合区的抗体片段。这种区域由一个重链可变结构域及一个轻链可变结构域(例如，scFv)实质紧密地共价结合的二聚体。

“Fab”片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域、以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。“F(ab’)2”抗体片段包含一对Fab片段，通常它们在羧基末端附近通过铰链半胱氨酸以共价方式连接。

“纳米抗体(nanobody)”是一种含有单体可变抗体结构域(monomeric variableantibody domain)的片段。主要由源自仅用单体重链就能表现出靶标特异性的骆驼等的抗体结构域的低分子量片段组成。

在本发明中，所述抗原结合片段的特征在于，其为抗体的单链可变片段(singlechain variable fragment；scFv)或纳米抗体(nanobody)。

在本发明中，优选地，所述抗原结合结构域的特征在于，可以包含抗-CD19抗体或其scFv，并且所述抗-CD19抗体的scFv的特征在于，可以包含由SEQ ID NO.8表示的氨基酸序列，但不限于此。

在本发明中，所述嵌合抗原受体的特征在于，可以在抗原结合结构域的N-末端还包含信号肽(signal peptide；SP)。在本发明中，所述信号肽的特征在于，可以源自选自由CD8α、GM-CSF受体α、Ig-kappa及IgG1重链组成的组中的分子，但不限于此，优选地，可以是CD8α信号肽，并且所述CD8α信号肽的特征在于，可以包含由SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列。

作为优选例，本发明的嵌合抗原受体，其特征在于，包含：CD99L2衍生胞外结构域(特征是由SEQ ID NO.10表示)；CD99L2衍生跨膜结构域(特征是由SEQ ID NO.11表示)；以及CD99L2衍生胞内结构域(特征为：由SEQ ID NO.12表示)。

另外，所述嵌合抗原受体还可包含：4-1BB共刺激结构域(特征为：由SEQ ID NO.15表示)；CD3ζ胞内信号传导结构域(特征为：由SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14表示)；和/或CD8信号肽(特征为：由SEQ ID NO.7表示)，但不限于此。

在本发明中，示例性地，包含针对CD19的抗原结合部位的嵌合抗原受体可包含由SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列80％以上，优选地，90％以上，更优选地，95％以上，最优选地，99％以上的序列同一性的其变体。

另一方面，发明在涉及一种编码所述嵌合抗原受体的核酸。

本发明的术语“核酸”具有广义上包含DNA(gDNA及cDNA)及RNA分子的含义，并且作为核酸的基本构成单位的核苷酸不仅包含天然核苷酸，还包含糖或碱基部分修饰的类似物(analogue)。本发明的编码嵌合抗原受体或各结构域的核酸的序列可以被修饰。所述修饰包括核苷酸的添加、缺失、或者非保守型取代或保守型取代。

编码本发明的嵌合抗原受体的核酸(多核苷酸)可通过密码子优化来修饰，并且这起因于密码子的简并性(degeneracy)，普通技术人员能够很好地理解编码多肽或其变体片段的多个核苷酸序列的存在。这些多核苷酸(核酸)中的一部分与任意天然产生型基因的核苷酸序列具有最小同源性。尤其，优选由于密码子使用方式的差异而可变的多核苷酸，例如，在人类、灵长类动物和/或哺乳动物的密码子选择上优化的多核苷酸。

在本发明中，编码所述嵌合抗原受体的核酸可包含：编码CD99L2衍生胞外结构域的核苷酸序列(特征是由SEQ ID NO.19表示)；以及编码CD99L2衍生跨膜结构域的核苷酸序列(特征是由SEQ ID NO.20表示)。

在本发明中，编码所述嵌合抗原受体的核酸还可额外包含：编码CD99L2衍生胞内结构域的核苷酸序列(特征为：由SEQ ID NO.21表示)；编码4-1BB共刺激结构域的核苷酸序列(特征为：由SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26表示)；编码CD3ζ的胞内信号传导结构域的核苷酸序列(特征为：由SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24表示)；和/或编码CD8信号肽的核苷酸序列(特征为：由SEQ ID NO.16表示)，但不限于此。

优选地，还可包含编码抗-CD19抗体的单链可变片段(scFv)的核苷酸序列(特征为：由SEQ ID NO.17表示)。

作为本发明的一示例，编码所述嵌合抗原受体的核酸可包含由SEQ ID NO.5或SEQID NO.6表示的核苷酸序列，或者具有与所述核苷酸序列80％以上，优选地，90％以上，更优选地，95％以上，最优选地，99％以上的序列同一性的变体。

另一方面，本发明涉及一种包含所述核酸的表达载体及包含所述表达载体的病毒。

本发明的术语“载体”是指可转移或输送其他核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如，插入到载体核酸分子中。载体可包含在细胞中用于指示自主复制的序列，或者可包含足以可整合到宿主细胞DNA中的序列。所述载体的特征在于，可以选自由DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体及逆转录病毒载体组成的组中，但不限于此。

在本发明中，所述核酸或所述载体被转染(transfection)至病毒生产细胞(包装细胞株(packaging cell line))中。为了实现“转染(transfection)”，在原核或真核宿主细胞中导入外源性核酸(DNA或RNA)的过程中通常可使用多种技术，例如，电穿孔法(electroporation)、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖转染或脂质转染法(lipofection)等。

在本发明中，从病毒生产细胞生产的病毒转导(transduction)到免疫细胞中。“转导”到细胞中的病毒的核酸以插入或不插入到细胞基因组的状态用于生产嵌合抗原受体蛋白质。

另一方面，本发明涉及一种在表面表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞。

在本发明中，所述免疫细胞的特征在于，可以为T细胞、NK细胞、NKT细胞或巨噬细胞，但不限于此，优选地，其特征在于，可以是T细胞。

本发明的表达嵌合抗原受体的免疫细胞的特征在于，可以为CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T Cell))、CAR-NK细胞(嵌合抗原受体自然杀伤细胞(Chimeric Antigen Receptor Natural Killer Cell))、CAR-NKT细胞(嵌合抗原受体自然杀伤T细胞(Chimeric Antigen Receptor Natural killer T Cell))或CAR-巨噬细胞(嵌合抗原受体巨噬细胞(Chimeric Antigen Receptor Macrophage))。

在本发明中，所述T细胞的特征在于，可以选自由CD4阳性T细胞；CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte；CTL)；γδ(gamma-delta)T细胞；肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte；TIL)及从外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell；PBMC)中分离的T细胞组成的组中。

另一方面，本发明涉及一种包含表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞(例如，T细胞)的癌症治疗用组合物。

在本发明中，“癌症”和“肿瘤”用作相同的含义，它们是指以无法典型方式调节的细胞生长/增殖为特征的哺乳动物的生理学状态。

本发明的可用CAR治疗的癌症不仅包括血管生成的肿瘤，还包括未生成血管或尚未实质上生成血管的肿瘤。所述癌症可包括非实体瘤(例如，血液肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤)，或者可包括实体瘤。本发明的可用CAR治疗的癌症的类型可例举恶性上皮肿瘤(carcinoma)、母细胞瘤、肉瘤、特定白血病或淋巴恶性肿瘤、良性及恶性肿瘤，例如，肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)及黑色素瘤，但不限于此。还包括成人肿瘤/癌及儿童肿瘤/癌。

血癌是血液或骨髓的癌症。作为血(或造血)癌的实例可包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病及成髓细胞白血病、幼淋巴细胞性白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病及红白血病)、慢性白血病(例如，慢性淋巴细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病及慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(迟发性及高分级形态)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链病、骨髓异常增生综合症、毛细胞白血病及骨髓增生异常征的白血病。

实体瘤是通常不包括囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的或恶性。不同类型的实体瘤根据形成它们(例如，肉瘤、癌症及淋巴瘤)的细胞类型来命名。作为实体瘤(如肉瘤、癌症)的实例可例举纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤(synovioma)、间皮瘤(mesothelioma)、尤文氏(Ewing)瘤瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、淋巴恶性肿瘤、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、咽喉癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯氏瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤(seminoma)、膀胱癌、黑色素瘤及中枢神经系统(CNS)肿瘤(例如，神经胶质瘤(例如，脑干神经胶质瘤及混合性神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也已知为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤(Schwannomacraniopharyogioma)、室管膜瘤(ependymoma)、松果体瘤(pinealoma)、血管母细胞瘤、听神经瘤(acoustic neuroma)、少突胶质细胞瘤(oligodendroglioma)、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤及转移性脑瘤。

本发明的治疗用组合物是用于预防或治疗癌症的组合物，本发明的术语“预防”是指通过施用本发明的组合物来抑制或延迟癌症进展的所有行为，并且“治疗”是指抑制癌症的发展、减轻或消除其症状。

本发明的包含表达嵌合抗原受体的免疫细胞的药物组合物中还可包含药学上可接受的赋形剂。作为这种赋形剂的实例可包含表面活性剂(优选地，聚山梨醇酯系列的非离子表面活性剂)；缓冲剂(如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等)；糖或糖醇类(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或葡聚糖及甘露醇等)；氨基酸、蛋白质或多肽(如甘氨酸及组氨酸等)；抗氧化剂；螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽等)，再例如，可为渗透剂；辅助剂；以及保存剂，但不限于此。

本发明的组合物可使用本领域已知的方法来进行剂型化，以在施用于除人类之外的哺乳动物后，可提供活性成分的快速、持续或延迟释放。剂型可以是粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软质或硬质明胶胶囊、无菌注射溶液及无菌粉末的形态。

另一方面，本发明涉及一种癌症治疗方法，其包括向受试者施用表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞的步骤。

本发明还涉及一种所述免疫细胞在癌症治疗中的用途。

本发明还涉及一种所述免疫细胞在制备癌症治疗用药物中的应用。

所述受试者可以是患有肿瘤的哺乳动物，具体地，可以是人类，但不限于此。

本发明的表达嵌合抗原受体的免疫细胞或包含其的组合物可通过口服给药、注射(infusion)、静脉给药(intravenous injection)、肌内给药(intramuscular injection)、皮下给药(subcutaneous injection)、腹腔给药(intraperitoneal injection)、直肠给药(Intrarectal administration)、局部给药(topical administration)、鼻内给药(intranasal injection)等方式进行给药，但不限于此。

活性成分的给药量可根据给药途径、患者的年龄、性别、体重及患者的严重程度等多种因素进行适当选择，本发明的治疗用组合物可与具有用于预防、改善或治疗癌症症状的效果的已知化合物联合给药。

以下，通过实施例，对本发明进行更详细地说明。这些实施例仅用于说明本发明，且对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，本发明的范围不应被解释为受到这些实施例的限制。

实施例1：材料及方法

实施例1-1：小鼠及细胞株

免疫缺陷NSG小鼠购自杰克逊实验室(Jackson laboratory)。Raji淋巴瘤细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

实施例1-2：用于CAR表达的慢病毒载体(Lentiviral vector)的制备

CD19靶标CD8骨架CAR(CD8 backbone CAR)(h19BBz)ORF cDNA是按照现有公开的序列(美国专利US2013/0287748A1)，委托DNA合成来制备的(IDT公司(Integrated DNATechnologies))。CD19靶标CD99L2骨架CAR(CD99L2 backbone CAR)ORF cDNA(FL2LBBz、FL2PBBz)是从美国生物技术信息中心(NCBI)数据库中的人CD99L2 ORF序列(NM_031462.4)中选取CD99L2的部分胞外区、跨膜区及胞内区的序列，并通过密码子优化及DNA合成(Integrated DNA Technologies)来与人41BB胞内区及人CD3ζ链胞内区序列连接后，再通过聚合酶链式反应(PCR)与抗-CD19 scFv(克隆FMC63(clone FMC63))连接，从而完成了制备。用于CAR表达的慢病毒载体(Lentiviral vector)通过部分修饰pCDH-EF1(Addgene#72266)载体(vector)来使用，并且克隆(cloning)到BamHI/SalI限制性内切酶位点来制备了每个CAR ORF cDNA。每个CAR蛋白质的氨基酸序列及核苷酸序列如下表1及表2中所示。

表1嵌合抗原受体蛋白质的氨基酸序列

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表2嵌合抗原受体蛋白质的核苷酸序列

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构成所述CAR蛋白质的每个结构域的氨基酸及核苷酸序列如下表3及表4中所示。

表3构成CAR蛋白质的各个结构域的氨基酸序列

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表4构成CAR蛋白质的各个结构域的核苷酸序列

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实施例1-3：用于CAR表达的慢病毒(lentivirus)的生产

使用脂质体3000(Lipofectamin 3000)(英杰公司(Invitrogen))，将各个慢病毒质粒(Lentiviral plasmid)与3种包装(packaging)DNA(pMD.2G、pMDLg/pRRE及pRSV-rev)一起转染(transfection)到293T细胞株(cell line)(ATCC)中，然后获得包含24小时～48小时内分泌的慢病毒(lentivirus)的培养上清液，过滤(0.45μm的过滤器)并去除细胞残留颗粒，使用超高速离心机浓缩100倍后，将其用作用于制备CAR-T细胞的慢病毒(lentivirus)浓缩液。

实施例1-4：CAR-T细胞的制备

在通过白细胞成分采血(leukapheresis)从正常人获得的白细胞中加入TransAct试剂(reagent)(10μl/ml，美天旎公司(Miltenyi))后，在含有人IL-7(12.5ng/ml，Miltenyi)及人IL-15(12.5ng/ml，Miltenyi)的培养基(Miltenyi)中培养24小时来激活T细胞。激活的T细胞清洗2次后，加入慢病毒(lentivirus)浓缩液，在含有人IL-7及人IL-15的培养基中培养2天，并进行了慢病毒(lentivirus)转导(transduction)。将转导的T细胞清洗2次后，转移至含有人IL-7及人IL-15的新鲜培养基，每2天～3天更换一次培养基并增殖9天，将其用作CAR-T细胞。就细胞表面的CAR蛋白质表达而言，对于最终增殖的CAR-T细胞通过用生物素(Biotin)标记的抗FMC63抗体(阿克罗生物系统公司(Acrobiosystems))及PE标记的链霉亲和素(streptavidin)(BD生物科学公司(BD Biosciences))进行染色后，用流式细胞术(flow cytometry)(FACS-CantoⅡ，BD Biosciences)进行了测定。

实施例1-5：表达荧光素酶(luciferase)的Raji细胞(Raji-Luc)的制备

为了在细胞中人工表达荧光素酶(luciferase)，制备了可同时表达荧光素酶(luciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体(lentiviral vector)。在EF1α启动子(promoter)下保留多酶切割位点(多克隆位点(multi-cloning site))的同时在CMV启动子(promoter)下克隆有GFP的双顺反子慢病毒载体(biscistronic lentiviral vector)(pLECE3)(Lee SH，et al.，PLoS One.2020；15(1):e0223814)的多酶切割位点，将从pGL3-basic质粒(plasmid)(普洛麦格公司(Promega))切割提取的萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)ORF cDNA进行克隆，从而制备了pLECE3-Luc载体(vector)。将pLECE3-luc质粒(plasmid)与三种慢病毒包装质粒(lentiviral packaging plasmid)(pMDLg/pRRE、pRSVrev及pMD.G)一起，使用脂质体2000试剂(Lipofectamin 2000reagent)转染至慢病毒包装细胞株(lentivirus packaging cell line)(293FT细胞，英杰公司(Invitrogen))中，24小时～48小时后，获得含有分泌的慢病毒的培养上清液，并使用离心过滤装置来浓缩10倍。将慢病毒(Lentivirus)浓缩液加入至Raji细胞中，在聚凝胺(polybrene)(6μg/ml，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))存在的条件下，在常温下以2500rpm离心90分钟来进行转导。在转导的Raji细胞中，使用流细胞分离仪(FACS-Aria II，BD Biosciences)，对GFP阳性细胞进行分离提纯，并将其用作Raji-Luc细胞。

实施例1-6：CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力及IFN-γ分泌能力的测定

在慢病毒(Lentivirus)转导后，将增殖9天的CAR-T细胞(1.2×10

为了测定CAR-T细胞的激活水平，将CAR-T细胞和Raji细胞以相等个数(3×10

实施例1-7：CAR-T细胞的激活标志物分析

为了比较各个CAR-T细胞的激活水平，在慢病毒(Lentivirus)转导后，增殖9天的CAR-T细胞(1×10

实施例1-8：CAR-T细胞的体内功效评价

向免疫缺陷NSG小鼠静脉注射Raji-Luc细胞(每只小鼠5×10

实施例2：CD99L2骨架CAR-T细胞的制备及激活分析

制备了人CD19靶标CD8骨架CAR的CD8胞外区及跨膜结构域区替换为CD99L2的部分区域的CAR蛋白质。制备了如下构建体(construct)：作为CD99L2蛋白质区使用CD99L2的部分胞外结构域及跨膜结构域的构建体(FL2PBBz)，或在此基础上额外加入胞内结构域的构建体(FL2LBBz)(图1A)。在制备搭载这些CD19靶标CD99L2骨架CAR的cDNA的慢病毒(Lentivirus)后，导入至从人外周血中分离的T细胞中，制备了各个CAR-T细胞。使用流式细胞分析法测定这些CAR-T细胞中的CAR蛋白质的表达率，与FL2PBBz相比，FL2LBBz CAR蛋白质表现出显著的高表达率，该结果在CD4T细胞及CD8 T细胞(图1B下部板块的CD4阴性T细胞)中均得到了证实(图1B)。接下来，为了确认这些CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力，与作为人CD19阳性淋巴瘤细胞的Raji细胞共同培养的结果，确认了FL2LBBz CAR-T细胞的肿瘤杀伤力优于FL2PBBz CAR-T细胞(图1C)。与此相符地，当测定与肿瘤细胞共同培养时的通过CAR-T细胞激活来分泌的IFN-γ量的结果，确认了FL2LBBz CAR-T细胞的IFN-γ分泌量明显多于FL2PBBz CAR-T细胞(图1D)。因此，将FL2LBBz CAR-T细胞选定为CD99L2骨架CAR，以进行日后研究。

为了与现有CD8骨架CAR-T细胞(h19BBz)比较FL2LBBz CAR-T细胞的体外肿瘤杀伤能力及IFN-γ生成能力，制备了两种CAR-T细胞的结果，确认了在FL2LBBz CAR-T细胞中的每个细胞的CAR表达率(平均荧光强度(mean fluorescence intensity))略低于h19BBzCAR(图1E)。然而，针对肿瘤细胞的杀伤能力，两种CAR-T细胞表现出类似的水平，就IFN-γ分泌而言，与h19BBz相比，确认了FL2LBBz CAR-T细胞表现出部分提高的分泌能力(图1F及图1G)。因此，确认了CD99L2骨架CAR-T细胞表现出与现有CD8骨架CAR-T细胞类似或部分提高的试管内活性。

实施例3：CD99L2骨架CAR-T细胞的激活标志物分析

为了更仔细地观察基于CD99L2骨架CAR-T细胞肿瘤的激活水平，通过流式细胞分析法测定了T细胞激活过程中增加的细胞表面激活标志物(CD69、CD44及CD25)随时间的表达。

结果表明，在CD99L2骨架CAR-T细胞中，CD69、CD44及CD25的随时间的表达增加率显著高于CD8骨架CAR-T细胞，并且在CD4CAR-T细胞(图2A)及CD8 CAR-T细胞(图2B)中均得到证实。因此，证明了CD99L2骨架CAR-T细胞在抗原刺激后随时间的激活水平与CD8骨架CAR-T细胞相比非常优异。

实施例4：CD99L2骨架CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效分析

为了测试CD99L2骨架CAR-T细胞的体内功效，向免疫缺陷小鼠(NSG mice)静脉注射荧光素酶(luciferase)表达Raji淋巴瘤细胞后，在第7天静脉注射相同个数的CD8骨架CAR-T细胞及CD99L2骨架CAR-T细胞，用体内生物发光成像(bioluminescence Imaging)方式分析了两种CAR-T细胞的治疗功效。

结果确认了在CD8骨架CAR-T细胞表现出低功效的细胞剂量(dose)中，CD99L2骨架CAR-T细胞能表现出显著的肿瘤去除功效(图3)。

最终，确认与现有CAR-T细胞相比，CD99L2骨架CAR-T细胞表现出大大提高的激活及体内抗肿瘤功效，因此提示了在CAR骨架(backbone)区赋予新激活功能的新概念CAR构建体(construct)的开发。

工业实用性

在本发明中，确认了属于CD99家族(family)的细胞膜蛋白质中CD99L2(CD99抗原样蛋白2(antigen-like 2))的T细胞激活功能，制备了作为骨架(backbone)包含CD99L2的胞外结构域及跨膜结构域的新型嵌合抗原受体。与具有现有骨架的CAR-T细胞相比，这种基于CD99L2的CAR-T细胞表现出提高的T细胞激活及肿瘤治疗效率，因此可有效地用于癌症治疗的免疫细胞治疗。

以上，对本发明内容的特定部分进行了详细描述，对于本领域的技术人员而言，显而易见的是这种具体描述仅仅是优选实施方式，并不用于限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附的权利要求及其等同物来定义。

序列表

附于电子文件。