用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组及试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。

幽门螺杆菌的临床检测包括：第一，抽血检测幽门螺杆菌，抽血检查的其实是幽门螺杆菌的抗体，但是即便已经根除幽门螺杆菌，这种抗体也会在血液里存在1-2年的时间，这个时间进行检查，则可能出现假阳性，所以目前医院已很少使用抽血检查幽门螺杆菌的方法，如果哪个医生还建议你抽血检查，那么他一定不够专业。第二，呼气试验，是目前开展最广泛的检测幽门螺杆菌的方法，分为C13和C14呼气试验，都是在服用C13或C14胶囊后检测，不同点是，C14有一定辐射性，而C13没有，相同点是，两者的准确率相当，都可以达到95％以上，因为C14存在辐射性，所以孕妇，儿童检测时，最好选择没有辐射的C13。第三，粪便检测幽门螺杆菌，这是一种新型的检测方法，但目前还没有在临床上广泛开展，幽门螺杆菌也会从胃内脱落，经过肠道排出，所以在大便化验的时候，即可检测幽门螺杆菌，准确率可以达到98％以上，未来有广阔的应用前景。第四，通过胃黏膜活检检测幽门螺杆菌，在进行胃镜检查的时候，医生对胃内病变部位进行黏膜活检，标本在进行HE染色的时候，也可以发现是否感染幽门螺杆菌，虽然准确度也比较高，但是不可能广泛推广。

发明内容

本发明提供了用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组及试剂盒，引物组共有2组，分别针对幽门螺杆菌及其耐药性基因，通过临床样本验证了本发明提供的引物组扩增效率为116.5％和104.5％，对于优化幽门螺杆菌及其耐药性的临床筛查或科学研究，具有重要的意义和应用价值。

为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组，包括第一引物组和第二引物组；

所述第一引物组包括：正向引物序列SEQ ID NO.4、反向引物序列SEQ ID NO.5和探针序列SEQ ID NO.6；

所述第一引物组包括：正向引物序列SEQ ID NO.7、反向引物序列SEQ ID NO.8和探针序列SEQ ID NO.9。

引物探针组1：

F1(SEQ ID NO.4)：TCCAACCAGATATAGCCACTAGCA；

R1(SEQ ID NO.5)：TTACCCCTTTCATCAAGCAAATC；

P1(SEQ ID NO.6)：CACCCACATACAAGGCTTACCGCCTG。

引物探针组2：

F2(SEQ ID NO.7)：TCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAA；

R2(SEQ ID NO.8)：AACAGAAACATCAAGGGTGGTATCC；

P2(SEQ ID NO.9)：CTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTACT。

优选的，在反应体系中，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的浓度均为0.1-1μmol/L。

本发明的第二个方面，提供了一种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的试剂盒，包括：包括第一引物组和第二引物组；

所述第一引物组包括：正向引物序列SEQ ID NO.4、反向引物序列SEQ ID NO.5和探针序列SEQ ID NO.6；

所述第一引物组包括：正向引物序列SEQ ID NO.7、反向引物序列SEQ ID NO.8和探针序列SEQ ID NO.9。

优选的，还包括5*buffer、Mg

优选的，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的初始浓度均为10uM。

本发明的第三个方面，提供了一种非诊断目的检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的方法，包括以下步骤：

S1、提取样本总DNA；

S2、加入5*buffer、Mg

S3、将反应体系进行qPCR扩增。

优选的，步骤S2中，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的终浓度均为0.1-1μmol/L。

优选的，步骤S3中，qPCR扩增的反应条件为：热盖100-105℃、逆转录40-42℃、预热90-95℃、变性90-95℃、退火55-60℃、延伸70-72℃，变性、退火和延伸共循环40次。

优选的，步骤S3中，qPCR扩增的反应条件为：

与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：本发明筛选了大量用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组，最终筛选出了扩增效率为116.5％、104.5％，拥有更为标准的扩增曲线、更高的灵敏度和低限检测的引物组。

附图说明

为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。

显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。

图1为本发明实施例2的引物探针组1在相同反应体系浓度等条件下的扩增曲线；

图2为本发明实施例2的引物探针组1在相同反应体系浓度等条件下的扩增标准曲线；

图3为本发明实施例2的引物探针组2在相同反应体系浓度等条件下的扩增曲线；

图4为本发明实施例2的引物探针组2在相同反应体系浓度等条件下的扩增标准曲线；

图5为本发明实施例3的引物探针组1在相同反应体系浓度下的qPCR扩增曲线；

图6为本发明实施例3的引物探针组1在相同反应体系浓度下的qPCR反应的内标扩增曲线；

图7为本发明实施例3的引物探针组2在相同反应体系浓度下的qPCR扩增曲线；

图8为本发明实施例3的引物探针组2在相同反应体系浓度下的qPCR反应的内标扩增曲线；

图9为本发明实施例4的引物探针组1的特异性检测扩增曲线图；

图10为本发明实施例4的引物探针组1的特异性检测内标通道扩增曲线图。

图11为本发明实施例5的引物探针组2对非耐药性基因检测扩增曲线图；

图12为本发明实施例5的引物探针组2对非耐药性基因检测内标通道扩增曲线图；

图13为本发明实施例6的引物探针组1对临床样本的检测扩增曲线；

图14为本发明实施例6的引物探针组1对临床样本的内标通道检测扩增曲线。

图15为本发明实施例6的引物探针组2对临床样本的检测扩增曲线；

图16为本发明实施例6的引物探针组2对临床样本的内标通道检测扩增曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例中所提供的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明中的术语“正向引物序列”是指：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从5′向3′方向读出DNA正链的序列。

本发明中的术语“反向引物序列”是指：反向引物(下游引物)是沿着正链进行延长的。体外扩增DNA，双螺旋是部分或完全打开的，不存在冈崎片段，也不会一段段延长，理论上正反引物都是不间断延长的，和体内DNA自我复制是有区别的。

本发明中的术语“探针”是指：一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件:①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。

本发明中的术语“qPCR”是指：Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。

还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。

下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1确定检测序列范围及引物设计

1.1、确定检测序列范围

本发明检测序列范围：幽门螺杆菌保守序列SEQ ID NO.1、幽门螺杆菌耐药性基因23sRNA SEQ ID NO.2的A2143G突变序列SEQ ID NO.3。

幽门螺杆菌保守序列SEQ ID NO.1

GCAGGAATCATTATAGGGAATCAAATCCGAACGGATCAAAAGTTCATGGGCGTGTTTGATGAATCTTTGAAAGAAAGGCAAGAAGCAGAAAAAAATGGAGGGTCTACTGGTGGGGATTGGTTGGATATTTTTTTATCATTTATATTTGACAAAAAACAATCTTCTGATGTCAAAGAAGCAATCAATCAAGAACCAGTTCCTCATATCCAACCAGATATAGCCACTAGCACCACCCACATACAAGGCTTACCGCCTGAATCTAGGGATTTGCTTGATGAAAGGGGTAATTTTTCTAAATTCACTCTTGGCGATATGGAAATGTTAGACGTTGAGGGCGTCGCCGACATGGATCCTAATTACAAGTTCAATCAATTATTGATTCACAATAACACTCTGTCTTCTGTGTTAATAGGGAGTCATGATGGCATAGAACCTGAAAAAGTTTCATT

幽门螺杆菌耐药性基因23sRNA SEQ ID NO.2

TCTGGTTAAGGAACTCTGCAAACTAGCACCGTAAGTTCGCGATAAGGTGTGCCACAGCGATGTGGTCTCAGCAAAGAGTCCCTCCCGACTGTTTACCAAAAACACAGCACTTTGCCAACTCGTAAGAGGAAGTATAAGGTGTGACGCCTGCCCGGTGCTCGAAGGTTAAGAGGATGCGTCAGTCGCAAGATGAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGGGATACCACCCTTGATGTTTCTGTTAGCTAACTGGCCTGTGTTATCCACAGGCAGGACAATGCTTGGTGGGTAGTTTG

幽门螺杆菌A2143G突变序列SEQ ID NO.3

TCTGGTTAAGGAACTCTGCAAACTAGCACCGTAAGTTCGCGATAAGGTGTGCCACAGCGATGTGGTCTCAGCAAAGAGTCCCTCCCGACTGTTTACCAAAAACACAGCACTTTGCCAACTCGTAAGAGGAAGTATAAGGTGTGACGCCTGCCCGGTGCTCGAAGGTTAAGAGGATGCGTCAGTCGCAAGATGAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGATGTTTCTGTTAGCTAACTGGCCTGTGTTATCCACAGGCAGGACAATGCTTGGTGGGTAGTTTG

1.2、引物设计及筛选

本发明针对步骤1.1中的序列选择设计了多组引物探针组，并进行验证实验。基于篇幅限制，以下实施例中只公开验证结果较好的2组引物探针组。两组引物探针，分别对应于检测幽门螺杆菌的保守序列和耐药性基因序列，根据PCR扩增的原理，DNA聚合酶对引物与模板的3端的互补配对要求最高，因此其中用于检测耐药性基因的反向引物的3端的第一个碱基为耐药性基因突变位点对应的碱基，以最大程度的避免误检。

引物探针组1：

F1(SEQ ID NO.4)：TCCAACCAGATATAGCCACTAGCA；

R1(SEQ ID NO.5)：TTACCCCTTTCATCAAGCAAATC；

P1(SEQ ID NO.6)：CACCCACATACAAGGCTTACCGCCTG。

引物探针组2：

F2(SEQ ID NO.7)：TCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAA；

R2(SEQ ID NO.8)：AACAGAAACATCAAGGGTGGTATCC；

P2(SEQ ID NO.9)：CTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTACT。

实施例2检验两组引物探针在相同反应体系浓度等条件下的扩增效率

实验方法

本实施例的检测方法qPCR，反应体系如下表1所示。

表1：扩增效率比较实验反应体系表

分别采用引物探针组1和引物探针组2进行qPCR扩增，并检测扩增曲线和扩增标准曲线、统计扩增效果。

实验结果

如图1、2所示，为引物探针组1进行qPCR扩增的扩增曲线和扩增标准曲线。

如图3、4所示，为引物探针组2进行qPCR扩增的扩增曲线和扩增标准曲线。

如表2所示，为实验结果统计表。

表2扩增效率比较实验结果统计表

由扩增标准曲线实验结果知，在相同条件下，引物探针组1的扩增效率为116.5％，引物探针组2的扩增效率为104.5％，在该反应条件下，两组引物探针均有着较好的扩增效率，均适合用于临床检验。

实施例3两组引物探针的精密度检测

实验方法

本实施例的检测方法qPCR，反应体系如下表3所示。

表3qCPR反应的反应体系表

引物探针组1、引物探针组2进行qPCR扩增，并进行精密度检测扩增曲线、统计扩增结果。

实验结果

如图5、6所示，为引物探针组1的qPCR扩增的扩增曲线及内标扩增曲线。

如图7、8所示，为引物探针组2的qPCR扩增的扩增曲线及内标扩增曲线。

如图表4所示，为精密度检测的qPCR反应结果表。

表4精密度检测结果统计表

由精密度检测的实验结果知，引物探针组1的检测CV值为0.5407％，引物探针组2的检测CV值为0.7042％，两组引物探针都很稳定，均适用于临床检测。

实施例4引物探针1的最低检测限

实验方法

本实施例的检测方法qPCR，反应体系如下表7所示。

表7qCPR反应的反应体系表

引物探针组1进行qPCR扩增，并进行最低检测限检测扩增曲线、统计扩增结果。

实验结果

如图9、10所示，为引物探针组1进行qPCR扩增的扩增曲线和内标通道结果图。

如表6所示，为最低检测限检测结果统计表。

表6最低限检测的qPCR反应结果表

由最低检测限的实验结果知，在极低的模板浓度条件下，引物探针组1依旧能部分检出或未检出，对于极低浓度的样本条件，引物探针组1拥有较好的检测结果。

实施例5引物探针组2对非耐药性基因检测

本实施例的检测方法qPCR，反应体系如下表7所示。

表7qCPR反应的反应体系表

引物探针组2进行qPCR扩增，并进行最低检测限检测扩增曲线、统计扩增结果。

实验结果

如图11、12所示，为引物探针组2进行qPCR扩增的扩增曲线和内标通道结果图。

如表8所示，为引物探针组2对非耐药性基因检测qPCR反应结果表。

表8对非耐药性基因检测qPCR反应结果表

通过对非耐药性基因检测的实验结果知，引物探针组2对非耐药性基因均未检出，说明引物探针组2具有较好的特异性。

实施例6临床样本的qPCR检测结果

实验方法

本实施例的检测方法qPCR，反应体系如下表9所示。

表9临床样本检测反应体系表

引物探针组1、引物探针组2对临床样本进行qPCR扩增，并检测扩增曲线、统计扩增结果。

实验结果

如图13、14所示，为引物探针组1对临床样本进行qPCR扩增的扩增曲线和内标通道结果图。

如图15、16所示，为引物探针组2对临床样本进行qPCR扩增的扩增曲线和内标通道结果图。

如表10、11所示，为临床样本检测和内标结果统计表。

表10：临床样本检测结果表

表11临床样本检测内标结果表

临床结果显示，引物探针组1和引物探针组2对临床样本的检测结果均准确，所以这两个探针组适合用于对幽门螺杆菌及其耐药性基因的检测。

在上述说明书的描述过程中：

术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。

最后应说明的是：

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；

尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。