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用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用

文献发布时间：2023-06-19 11:30:53

技术领域

本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的检测，具体涉及一种用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV）感染引起的一种热性、急性且潜伏性极强的传染病。自1995年Miller首次在美国报道该病以来，IBR已呈现出全球性流行的态势，这给世界养牛业造成了巨大的经济损失。IBRV的主要危害性在于病毒在侵入宿主后，可潜伏感染于宿主的神经节中，导致病牛终生带毒，对该病的防控带来了巨大的挑战。鉴于其危害性，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类传染病，我国亦将其列为二类传染病。临床诊断是评估免疫效果、监测牛群健康和诊断疾病的必要手段，因此加强诊断技术的相关研究是势在必行的，也是至关重要的。

为有效防控IBR，现已有多种IBRV诊断技术，主要可概括为病原学诊断和血清学检测，其中血清学检测是应用最为广泛的诊断技术。血清学检测技术主要包括中和试验和ELISA等。中和试验被誉为实验室诊断IBR的金标准，但是该方法存在试验周期长、操作繁琐、安全性低等缺点。相比之下，ELISA表现出高敏感性、高特异性、快速性和简便性等优点，而受到广大诊断研发工作者的青睐。在ELISA各项检测技术中，OIE着重推荐阻断ELISA方法。现有的ELISA试剂盒可检测IBRV抗体，但不能检测IBRV中和抗体，因此无法替代中和试验。为了快速、准确地评价动物的抗病能力和疫苗免疫效果，急需开发一种能够检测IBRV中和抗体的ELISA试剂盒。

发明内容

针对IBR防控需求，我们对IBRV的gD基因序列进行分析，设计得到截短的gD基因，并采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统进行高效分泌表达，获得了截短的gD蛋白，并利用截短的gD蛋白筛选得到具有中和活性的抗IBRV单抗。

本发明提供一种抗牛传染性鼻气管炎病毒的具有中和活性的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 21015的杂交瘤细胞所分泌。

本发明还提供分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.21015。

本发明还提供用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的试剂盒，其包含所述的抗牛传染性鼻气管炎病毒的具有中和活性的单克隆抗体。

优选地，所述试剂盒还包含牛传染性鼻气管炎病毒的截短的gD蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

优选地，所述试剂盒还包含酶标板；所述截短的gD蛋白被预先包被在酶标板上或临用前包被在酶标板上。

优选地，所述截短的gD蛋白在酶标板上的包被量为0.25～0.5μg/孔。

优选地，所述截短的gD蛋白的包被液为0.1M，pH8.5的Tris-HCL缓冲液。

优选地，所述单克隆抗体的工作浓度为0.54～2.15μg/mL。

优选地，所述试剂盒还包含封闭液、洗涤液、显色液和终止液；所述封闭液为5%鸡血清。

我们将截短的gD蛋白作为包被抗原，将所述单克隆抗体作为检测抗体，通过优化抗原包被量、包被条件、封闭条件、抗体使用量和血清稀释度，并确定试验成立条件和试验的cut-off值，建立了一种可检测牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的阻断ELISA方法。所述方法包括如下步骤：（1）用0.1M pH8.5 Tris-HCL缓冲液溶解所述截短的gD蛋白，然后加入酶标板中，蛋白包被量为0.25～0.5μg/孔，孵育；洗酶标板；（2）加入5%鸡血清，封闭；洗酶标板；（3）将待检血清样品稀释2倍后，加入酶标板中，孵育；洗酶标板；（4）使所述单克隆抗体带上显色标记，然后配制成0.54～2.15μg/mL的抗体溶液，加入酶标板中，孵育；洗酶标板；（5）加入显色液显色；（6）加入终止液，轻轻混匀后在酶标仪中读取450nm处的吸光值；（7）样品孔的OD450与阴性对照孔的OD450的比值为S/N值；若S/N值≥0.885，则样品中不含有牛传染性鼻气管炎病毒的抗体；若S/N值﹤0.885，则样品中含有牛传染性鼻气管炎病毒的抗体。

在阻断ELISA方法的开发过程中，我们尝试了多种gD蛋白的改造，实验前期分别对IBRV gD基因（GenBank登录号：MH751901.1）的22-588bp、363-1050bp、543-1251bp进行蛋白表达，利用间接Elisa方法对三个蛋白进行检测，结果显示这三个蛋白均不能完全区分IBRV的标准阳性血清和标准阴性血清。经过不断改造和筛选，最终获得氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示的截短的gD蛋白，该蛋白能够准确区分IBRV的标准阳性血清和标准阴性血清。然后我们用截短的gD蛋白筛选出具有中和活性、能够与截短的gD蛋白配对用于阻断ELISA方法检测IBRV抗体的单克隆抗体。分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株的编号为3E8，其保藏号为CGMCC No. 21015。

本发明提供的试剂盒及阻断ELISA方法，具有以下优点：

（1）特异性强：采用本发明的单克隆抗体和截短的gD蛋白（也称为重组gD蛋白），通过阻断ELISA法检测牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫、牛副结核和牛病毒性腹泻以及IBRV抗体阳性血清，结果显示，除IBRV以外，其余4种血清均表现出明显的阴性反应，表明本发明的单克隆抗体与这4种病原无交叉反应，特异性好。

（2）敏感性好：采用本发明的单克隆抗体和重组gD蛋白，通过阻断ELISA法对样品盘中的40份血清和30份临床感染IBRV阳性血清进行检测，阳性检出率为100%，阴性检出率为100%。

（3）灵敏度高：将IBRV抗体阳性血清按1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024进行稀释，采用本发明的阻断ELISA方法和中和试验分别对稀释的IBRV抗体阳性血清进行检测。本发明的方法可检测到1：256的稀释度，中和试验可检测到1：32的稀释度。

（4）重复性好：用本发明的阻断ELISA方法将5份血清在同一块酶标板和三块不同的酶标板间重复检测。批间S/N值的变异系数为2.69%-8.3%，平均值为4.16%，批内S/N值的变异系数为2.9%-4.6%，平均值为3.64%。

（5）与其他方法的一致性好：分别使用中和试验、本发明的阻断ELISA方法和美国IDEXX IBRV gE抗体检测试剂盒对715份牛血清进行检测。本发明的方法与商业试剂盒的总符合率为93.85%，与中和试验的总符合率为99.58%。

采用本发明的试剂盒，通过阻断ELISA方法检测IBRV中和抗体，可替代中和试验成为一种快速、灵敏的评价疫苗免疫效果的新方法。我们对北京市大地群生牛场采集的不同免疫阶段的59份健康免疫牛的血清分别进行中和试验和阻断ELISA方法检测，通过比较这些血清的中和效价和阻断ELISA方法的S/N值之间的关系，建立了阻断ELISA的S/N值与血清中和效价log2值的函数关系式：y = 9.3161e

本发明提供的杂交瘤细胞已进行专利保藏，保藏信息如下：

保藏名称：3E8

分类命名：杂交瘤细胞

保藏日期：2020年11月30日

保藏编号：CGMCC No. 21015

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1.重组穿梭杆粒鉴定图；1：gD引物鉴定结果；2：PUC/M13引物鉴定结果。

图2. 重组gD蛋白的间接免疫荧光鉴定；A. SF9细胞对照；B.接种重组杆状病毒的SF9细胞。

图3. 重组gD蛋白的Western blot分析 1：正常SF9细胞培养上清；2：正常SF9细胞沉淀；3：重组杆状病毒SF9细胞培养上清；4：重组杆状病毒SF9细胞沉淀。

图4. 重组gD蛋白的SDS-PAGE分析；M：180kDa蛋白 marker；1：High Five昆虫细胞空白对照；2：细胞培养上清；3：流穿峰；4：20mM咪唑洗杂峰；5：50mM咪唑洗杂峰；6：400mM咪唑洗杂峰；7：浓缩后的gD蛋白。

图5. 单抗纯化结果；1：单抗3E8；2：单抗4F12；3：单抗1B4。

图6. 单抗的Western blot鉴定；A：单抗3E8与 IBRV反应；B：单抗4F12与IBRV反应；C：单抗1B4与IBRV反应。

图7. 单抗的间接免疫荧光鉴定；A：单抗1B4检测感染IBRV的MDBK；B：单抗3E8检测感染IBRV的MDBK；C：单抗4F12检测感染IBRV的MDBK；D：小鼠阴性血清检测感染IBRV的MDBK。

图8. 直接ELISA测定酶标单抗HRP-3E8的效价。

图9. 酶标单抗HRP-3E8工作浓度的选择。

图10. 阻断ELISA方法的最佳包被液（N/P值）；其中包被液1为0.1M pH8.5的Tris-HCL缓冲液，包被液2为0.1M pH8.0的Tris-HCL缓冲液，包被液3为0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液，包被液4为0.1M pH5.0的柠檬酸盐缓冲液，包被液5为0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液。

图11. 阻断ELISA方法的最佳封闭液（N/P值）；其中封闭液1为5%鸡血清，封闭液2为5%猪血清，封闭液3为10%马血清，封闭液4为1%明胶，封闭液5为5%羊血清，封闭液6为3%鸡蛋清白蛋白。

图12. 阻断ELISA方法的最佳封闭时间选择（N/P值）。

图13. 阻断ELISA方法的最佳血清稀释度选择（N/P值）。

图14. 标准阳性血清和标准阴性血清的A值正态分布图；A：标准阳性血清A值分布图；B：标准阴性血清A值分布图。

图15. 阻断ELISA临界值ROC曲线。

图16. 阻断ELISA方法的交叉反应性试验。

图17. 血清中和效价的log2值与S/N值的函数关系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

细胞：SF9细胞、High Five细胞、MDBK细胞、骨髓瘤细胞SP2/0细胞由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供，也可商购获得。

病毒：牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供，已知毒株，记载在Xu J, Zhang X, Zhou S, Shen J, Yang D, Wu J, Li X, Li M,Huang X, Sealy JE, Iqbal M, Li Y. A DNA aptamer efficiently inhibits theinfectivity of Bovine herpesvirus 1 by blocking viral entry. Sci Rep. 2017Sep 18;7(1):11796. doi: 10.1038/s41598-017-10070-1. PMID: 28924154; PMCID:PMC5603541.中。该毒株本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

动物：BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

血清：IBRV标准阳性血清和标准阴性血清购自中国兽医监察所；715份牛血清由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心收集；马阴性血清购自索莱宝公司；猪特级血清、羊阴性血清购自康源生物公司；鸡阴性血清由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心制备；牛布鲁氏杆菌阳性血清、牛口蹄疫阳性血清、牛副结核阳性血清和牛病毒性腹泻阳性血清均由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心保存。

试剂耗材：胶回收试剂盒，购自美国Omega Bio-Tek公司，货号OMEGA.D2500-01。pFastBac

若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

实施例1. 重组gD蛋白及抗IBRV单克隆抗体的制备

1 重组gD蛋白的制备

1.1 基因及引物设计

从GenBank数据库下载IBRV gD基因序列（基因序列登录号：MH751901.1），利用在线分析网站（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析并预测该序列的跨膜区，设计出截短的gD基因序列（SEQ ID NO: 1），其编码截短的gD蛋白（SEQ ID NO: 2）。为促使截短的gD蛋白能够在昆虫细胞中分泌表达后进行蛋白纯化，需在蛋白的C端人为引入6×His序列。将优化后的gD基因序列（SEQ ID NO: 3）交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。使用Oligo7.0软件设计截短的gD基因的特异性引物（Gd-F/ Gd-R），并在上下游分别引入限制性酶切位点Nde Ⅰ（CATATG）和Xho Ⅰ（CTCGAG），同时合成通用引物PUC/M13（F/R），由北京擎科生物科技有限公司进行引物合成。

表1 引物序列表

1.2 目的基因的扩增

用TAKARA公司的Prime STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer酶扩增截短的gD基因，PCR反应体系为：

PCR反应程序参考产品说明书，退火温度为65℃。反应结束后，取PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测。使用胶回收试剂盒（Omega Bio-Tek，OMEGA.D2500-01）按照试剂盒说明书的操作提示对目的片段进行回收，并测定浓度。

1.3 重组供体质粒的构建及鉴定

1.3.1 载体/gD基因片段双酶切

使用限制性内切酶Xho I和Nde I分别对载体pFastBac

体系混匀后置于37℃恒温水浴中反应2h，凝胶电泳检测酶切结果，使用胶回收试剂盒（Omega Bio-Tek，OMEGA.D2500-01）参照试剂盒说明书对目的片段进行回收并测定浓度。

1.3.2连接

将酶切后回收的gD基因片段和pFastBac

1.3.3 连接产物的转化

将1.3.2获得的连接产物置于冰上冷却，然后将其全部转化至Trans5α克隆感受态细胞（全式金）中。次日挑取单个菌落，参照步骤1.2中的反应体系及程序进行PCR鉴定。将鉴定结果为阳性的菌液送至北京擎科生物科技有限公司测序。使用质粒提取试剂盒（天根，DP103）按照说明书提取质粒，质粒命名为gD-pFast Bac

1.4 重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-gD的构建与鉴定

1.4.1 重组供体质粒转化感受态细胞

将提取的供体质粒gD-pFast Bac

1.4.2 重组穿梭杆粒的提取

将1.4.1中获得的阳性菌扩大培养后，采用Invitrogen的Pure Link Hi PurePlasmid DNA Purification Kits试剂盒（K2100）按照试剂盒说明书提取重组穿梭杆粒。

1.4.3 重组穿梭杆粒的鉴定

利用PUC/M13（F/R）引物和gD特异引物（Gd-F/Gd-R）对提取的重组穿梭杆粒进行PCR鉴定，结果如图1所示。鉴定正确的重组穿梭杆粒命名为Bacmid-gD。

1.5 重组杆状病毒rBac-gD的拯救

1.5.1 重组杆状病毒质粒转染SF9细胞

利用Invitrogen公司的ExpiFectamine Sf Transfection Reagent转染试剂盒（货号：A38915）将重组杆粒转染至SF9细胞，操作步骤如下：在6孔板中按照0.8×10

1.5.2 重组杆状病毒的传代

将长势良好的SF9细胞（细胞数约为1.2×10

1.6 截短的gD基因在SF9细胞中的表达与检测

1.6.1 重组gD蛋白的间接免疫荧光鉴定

将P2代毒接种于六孔板，感染单层生长的SF9细胞，27℃避光培养72小时，当细胞病变约为80%时，吸弃培养基后用PBST洗5次；4%细胞组织固定液（北京索莱宝，No.P1110）固定8min后，PBST洗5次；加0.1%Triton 100（PBS稀释）透化处理20min，PBST洗5次；加含5%BSA的PBST于25℃封闭2h，弃掉封闭液加1:5000倍稀释的6×His单抗（abcam，ab18184），37℃孵育1h后用PBST洗5次；加入1:200倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG（Invitrogen，A32723），室温避光孵育1h，PBST洗5次；荧光显微镜下观察并拍照（图2）。

1.6.2 重组gD蛋白的Western blot分析

将P2代毒感染单层生长的SF9细胞，待细胞病变约为80%时，将细胞悉数吹下，经1000rpm离心6min后分别收取细胞培养上清和细胞沉淀。细胞沉淀用160µL灭菌水重悬，与蛋白上样缓冲液混合沸水浴10min后，迅速冰浴5min。SDS-PAGE结束后，按照常规转印方法进行转印。转移完毕后PVDF膜用含5%脱脂奶的PBST溶液封闭2h；将IBRV标准阳性血清用PBST按1: 1000稀释后作为一抗，25℃孵育2h，膜用PBST洗5次，每次5min；将HRP标记山羊抗牛IgG（Sigma，SAB3700005）用PBST按1: 10000倍稀释后作为二抗，25℃孵育2h，膜用PBST洗5次，每次5min；化学发光并拍照保存（图3）。

1.7 重组gD蛋白的纯化、浓缩

在1L的三角摇瓶中接入300mL密度为1.0×10

2. 抗IBRV单克隆抗体制备

2.1 免疫原的制备

先准备好单层生长的MDBK细胞，用含1% IBRV的无血清培养基感作1h，随后换成含2%（v/v）FBS的维持液，37℃培养2-3天。当细胞CPE（致细胞病变效应）达到80%左右时，将其放于-80℃冰箱中反复冻融三次，离心收集上清液。后续采用蔗糖梯度密度离心进行病毒浓缩，并测定抗原浓度。

2.2 动物免疫

取纯化的牛传染性鼻气管炎病毒液进行Western blot鉴定。将鉴定无误的病毒液作为免疫原与弗氏佐剂等体积乳化，对BALB/c小鼠进行免疫，具体免疫程序如下表。

表2 免疫程序

2.3 杂交瘤筛选方法的建立

2.3.1 抗IBRV阳性和阴性血清的制备

在第三次免疫后5天，对免疫组小鼠进行眼球采血，37℃放置1h后，4℃ 3000rpm离心15min，吸取上清分装保存于-40℃冰箱，用作筛选杂交瘤细胞的阳性对照；对同时购买的未免疫的小鼠进行采血，37℃放置1h后，4℃ 3000rpm离心15min，吸取上清分装保存于-40℃冰箱，用作筛选杂交瘤细胞的阴性对照。

2.3.2 间接ELISA方法的建立

用棋盘法进行最佳抗原、最佳抗体使用量的标定。间接ELISA方法如下：

包被：将纯化的重组gD蛋白（初始浓度为2mg/mL）以5μg/ml、2.5μg/ml一直倍比稀释至0.1562μg/ml后，按照每孔100μL加入酶标板，最后一行加入PBST作为抗原阴性对照，37℃孵育1h后，4℃过夜。

封闭：洗板机洗5次后，每孔加入300μL 5%的脱脂奶（PBST稀释），37℃封闭2h。

孵一抗：用PBST对三免后小鼠的阳性及阴性血清依次从1: 400、1: 800一直倍比稀释至1: 12800，洗板后100μL/孔，37℃孵育1h。

孵二抗：用PBST将HRP标记的山羊抗鼠IgG（Sigma，A9309）进行1:10000倍稀释，洗板后100μL/孔，37℃孵育1h。

显色：洗板后加入TMB显色液100μL/孔，37℃避光反应15min，加入50μL 2M硫酸终止。读取OD450的吸光值。

选取OD450值最接近1.0的孔所对应的的抗原、抗体浓度为最佳抗原包被浓度和最佳阳性血清稀释度。结果如表3所示，抗原稀释度1:6400，阳性血清稀释度1:1600时，OD450最接近于1.0，且P/N值最大。因此最佳抗原包被浓度为0.625μg/mL，最佳血清稀释度为1:6400。

表3 包被抗原、血清的最适工作浓度测定

注：P 代表阳性血清；N代表阴性血清。

2.4 分泌gD蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆

2.4.1 小鼠血清效价测定

在第四次免疫后5天，对免疫组小鼠进行眼球采血，37℃放置1h后，4℃ 3000rpm离心15min，吸取上清分装保存于-40℃冰箱。将血清从1：5×10

表4 小鼠血清抗体效价测定

2.4.2 细胞融合

超净台内无菌环境下取免疫的BALB/c小鼠的脾脏研制成脾细胞悬液。将脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0细胞按5：1的细胞数量比在50mL离心管中混合，1000rpm离心10min，弃上清，用不含血清的DMEM（Gibco，C11995500CP）重悬细胞，并再次离心，除尽上清。轻轻将细胞拍散，将离心管置于37℃的水浴中。用2.5mL注射器将1mL PEG-1500在60s的时间内加入到细胞沉淀上；然后在60s内将1mL预热至37℃的DMEM培养基滴入细胞悬液中；在180s内将3mL预热至37℃的DMEM培养基滴入细胞悬液中；最后在上述离心管中缓慢加入37℃预热的DMEM培养基10 mL，37℃水浴10min；1000 rpm离心10min，弃上清；用适量HAT培养基（Sigma，H0262）将细胞重悬后，将其加入96孔板中，置于37℃的二氧化碳培养箱培养。整个融合过程中动作需要绝对轻柔，且全程需在37℃水浴中进行。

2.4. 3阳性杂交瘤细胞株的筛选

分别在融合后的第7天和第10天对融合后的细胞进行半换液和全换液。在全换液后的第三天，用间接ELISA方法筛选可分泌抗gD蛋白抗体的杂交瘤细胞。对在第一次筛得的阳性孔全换液，进行第二次筛选。将第二次筛选仍为阳性的孔扩大培养并冻存，同时连续进行3～5次亚克隆，直至阳性率为100%，将阳性细胞株（3E8／4F12／1B4）冻存于液氮罐。

2.5 腹水的制备及单抗纯化

向SPF级Balb/C小鼠腹腔注射1 mL高压灭菌的液体石蜡致敏，7天后腹腔注射1.0×10

2.6 单抗的ELISA效价测定

将杂交瘤细胞上清（3E8／4F12／1B4）用PBST从1：100倍比稀释到1：2.048×10

表5 杂交瘤上清ELISA效价测定

表6 腹水ELISA效价测定

2.7 单抗的中和效价测定

将单抗于56 ℃金属浴灭活30 min后做2倍倍比稀释，分别与100 TCID50（半数组织培养感染剂量）的IBRV等体积混合，置于37 ℃的CO

2.8 单抗的Western blot鉴定

将纯化好的IBRV与蛋白上样缓冲液混匀，煮沸后进行SDS-PAGE，经常规湿转的方法将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜上。PVDF膜用5%的脱脂奶室温封闭2 h；加单克隆抗体1B4、3E8和4F12（1:1000），室温孵育2 h，膜用PBST洗5次，每次5min；将HRP标记山羊抗鼠IgG（Sigma，A9309）按照1: 10000倍稀释（稀释液为PBST）后作为二抗，25℃孵育2h，膜用PBST洗5次5min；化学发光并拍照保存（图6）。

2.9 单抗的间接免疫荧光鉴定

向六孔板中加入高压灭菌过的飞片和适量的MDBK细胞悬液，37℃ CO

2.10 最佳阻断单抗筛选

采用阻断ELISA方法测定单抗1B4、3E8和4F12与IBRV标准阳性血清和标准阴性血清的结合阻断率，计算N/P值，N/P值最大的一株单抗即为建立阻断ELISA方法的最佳单抗。方法如下：用纯化的重组gD蛋白包被96孔酶标板；封闭后将IBRV标准阴性血清和标准阳性血清分别按1:1的体积比稀释后加入酶标板；以浓度相同的三株单抗为一抗；以HRP标记的山羊抗鼠IgG（Sigma，A9309）（用PBST按1:10000倍稀释）为二抗，最后加底物显色，计算N/P值。结果如表7所示，单抗1B4、3E8和4F12的N/P值分别为8.5、12.7和9.2，单抗3E8的N/P值与IB4和4F12的呈现出显著性差异（P＜0.05），说明单抗3E8的阻断活性最佳，可作为建立阻断ELISA方法的候选单抗，分泌该单抗的杂交瘤细胞已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No. 21015。

表7 单克隆抗体阻断活性鉴定结果

实施例2. 检测牛传染性鼻气管炎病毒的抗体的阻断ELISA方法的建立

1. 辣根过氧化物酶标记单抗

采用过碘酸钠法对单抗3E8进行辣根过氧化物酶（HRP）标记。

（1）称取5mg的HRP（SIGMA，SRE0082）溶解于1000 μL的双蒸水中，继续加入500 μL新配的0.1M NaIO

（2）加入500 μL新配的0.2M乙二醇（SIGMA，324558）溶液，混匀，4℃避光孵育30min。

（3）将5mg纯化的单抗3E8加入到上述溶液中，混匀后装入预先处理好的透析袋（北京索莱宝，MW14000），在0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液中过夜透析，透析期间换液三次。

（4）将透析完后的液体倒入新的离心管，并加入200μL新配的5mg/mL NaBH

（5）将上述液体倒入洁净烧杯中，并缓慢加入等体积的过饱和(NH

（6）将上述溶液装入透析袋中，0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液中过夜透析，中间换液三次。

（7）次日收集透析袋中液体，测定浓度，分装保存于30%的甘油溶液中。

2. 直接ELISA测定酶标单抗HRP-3E8的效价

（1）包被：将2mg/mL的重组gD蛋白用0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液进行1:6400倍稀释后，按照100μL/孔加到酶标板中，37℃孵育1h后4℃过夜。

（2）洗板：洗板机洗5次，每次每孔350μL PBST，并在吸水纸上拍尽孔内液体。

（3）封闭：每孔加入300μL 5%的脱脂奶（PBST稀释），37℃封闭2h后洗板。

（4）孵一抗：将标记好的单抗HRP-3E8从1:100、1:200一直倍比稀释至1:12800，每孔100μL，37℃孵育1h后洗板。

（5）显色：每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光显色15min。

（6）终止：每孔加入50μL 2M H

结果如图8所示，当酶标单抗HRP-3E8的滴度被定义为OD450nm值为0.2时，酶标单抗HRP-3E8的滴度为1:6400。滴度较高，可用于继续建立阻断ELISA方法。

3. 最佳抗原抗体使用量的确定

采用棋盘法确定重组gD蛋白和酶标单抗的最佳工作浓度。重组gD蛋白溶液（2mg/mL）从1:100、1:200一直倍比稀释到1:6400，单抗溶液从1:100、1:200一直倍比稀释到1:3200。做IBRV标准阳性血清和标准阴性血清的阻断ELISA方阵滴定。选择N/P值（N/P值是指阴性对照孔的OD

结果如表8所示，当抗原包被浓度为1:800倍稀释，即250ng/孔，且单抗3E8（初始浓度为1.72mg/mL）为1:1600倍稀释时，具有最高的N/P值，为10.62。在对单抗3E8完成HRP标记后，再次采用棋盘法确定酶标单抗HRP-3E8的最佳使用浓度。如图9所示，当将酶标单抗HRP-3E8（初始浓度为0.55mg/mL）按照1:500倍稀释时，具有最高的N/P值。综上，该阻断ELISA方法的最佳抗原使用量为250ng/孔，最佳酶标单抗HRP-3E8使用浓度为1:500。

表8 抗原包被浓度和单抗3E8工作浓度的选择

4. 包被液的优化

为探究最佳包被液，采用上述过程中确定好的最佳抗原包被量进行阻断ELISA，并设置以下5种抗原包被液：

0.1M pH8.5的Tris-HCL缓冲液：称取12.114g Tris，加入850mL蒸馏水，搅拌溶解，加入HCl调pH至8.50，然后加蒸馏水定容至1L，混匀。

0.1M pH8.0的Tris-HCL缓冲液：称取12.114g Tris，加入850mL蒸馏水，搅拌溶解，加入HCl调pH至8.00，然后加蒸馏水定容至1L，混匀。

0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液：称取80g NaCl，32.3g Na

0.1M pH5.0的柠檬酸盐缓冲液：称取12.044g柠檬酸钠二水合物，11.341g柠檬酸，加入800mL蒸馏水溶解混匀，用HCl调pH至5.0，最后加蒸馏水定容至1L，混匀。

0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液：称取无水碳酸钠63.6g，碳酸氢钠33.6g，加入蒸馏水混匀，定容至1L。

按照常规阻断ELISA方法进行操作，将重组gD蛋白（2mg/mL）用不同的包被液稀释后包板，250ng/孔。使用相同封闭液（5%鸡血清）做封闭处理后，检测IBRV标准阴阳性血清。酶标单抗HRP-3E8用最佳浓度（1.1μg/mL）。每组包被液设置一个重复，通过计算N/P值来确定最佳包被液。如图10所示，包被液2对应的N/P值最大，即说明此时对应的阻断率最大，所以确定阻断ELISA方法的最佳包被液为0.1M pH8.5 Tris-HCL缓冲液。

5. 封闭条件的优化

为探究最佳封闭液，采用最佳包被条件包被酶标板。将重组gD蛋白（2mg/mL）用0.1M pH8.5 Tris-HCL缓冲液进行稀释包板，250ng/孔。设置6种血清封闭液：3%（v/v）鸡蛋清白蛋白、5%（v/v）猪血清、10%（v/v）马血清、1%（v/v）明胶、5%（v/v）羊血清和5%（v/v）鸡血清。封闭液采用PBST配制。使用6种不同封闭液做封闭处理后，检测IBRV标准阴阳性血清。酶标单抗HRP-3E8用最佳浓度（1.1μg/mL）。按照常规阻断ELISA方法进行操作，每种封闭液重复一次，通过计算N/P值来确定最佳封闭液。结果如图11所示，封闭液1对应的N/P值最大，即此时对应的阻断率最大，所以确定阻断ELISA方法的最佳封闭液为5%鸡血清。

为探究最佳封闭时间，采用最佳包被条件包被酶标板，最佳封闭液封闭。将重组gD蛋白（2mg/mL）用0.1M pH8.5 Tris-HCL缓冲液稀释后包板，250ng/孔。使用5%鸡血清分别于37℃封闭1h、1.5h和2h后，检测IBRV标准阴阳性血清。酶标单抗HRP-3E8用最佳浓度（1.1μg/mL）。按照常规阻断ELISA方法进行操作，每种封闭时间重复一次，通过计算N/P值来确定最佳封闭时间。如图12所示，封闭2h时对应的N/P值最大，即此时对应的阻断率最大，所以阻断ELISA方法的最佳封闭时间为37℃封闭2h。综上，最佳封闭条件为使用5%鸡血清37℃封闭2h。

6. 血清最佳稀释度

为探究血清最佳稀释度，将重组gD蛋白（2mg/mL）用0.1M pH8.5 Tris-HCL缓冲液稀释后包板，250ng/孔。使用5%鸡血清37℃封闭2h。用PBST将IBRV标准阳性血清和IBRV标准阴性血清按照1:1、1:5、1:10、1:20、1:40稀释，100微升/孔，置于37℃孵育1h；酶标单抗HRP-3E8用最佳浓度（1.1μg/mL）。按照常规阻断ELISA方法进行操作，每种血清最佳稀释度重复一次，通过计算N/P值来确定最佳血清最佳稀释度。结果如图13所示，血清稀释比为1:2时对应的N/P值最大，即此时对应的阻断率最大，所以阻断ELISA方法的最佳血清稀释比为1:2。

7. 试验成立条件的确定

为评判每次试验的有效性，本研究采用上述摸索出来的最佳试验条件组建阻断ELISA方法，将IBRV标准阳性血清和标准阴性血清分别进行了48次检测。通过观测标准阴性血清和标准阳性血清A值（A值是指吸光度）的变化来制定阻断ELISA试验成立的条件。

本发明建立的阻断ELISA方法：

（1）包被：用0.1M pH8.5 Tris-HCL缓冲液将重组gD蛋白（2mg/mL）进行1:800倍稀释后，按照100μL/孔加入酶标板中，37℃孵育1h后4℃过夜包被。

（2）洗板：用洗板机洗5次，每次每孔加350μL PBST，洗完后在吸水纸上拍尽孔内残存的洗液。

（3）封闭：每孔300μL 5%（v/v）鸡血清（PBST稀释），37℃封闭2h。

（4）洗板：同（2）。

（5）加样：将待检血清（标准阳性血清／标准阴性血清）用PBST进行1:2稀释后，100μL/孔，37℃孵育1h。

（6）洗板：同（2）。

（7）一抗：将酶标单抗HRP-3E8（0.55mg/mL）用PBST进行1：500倍稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。

（8）洗板：同（2）。

（9）显色：加TMB单组份显色液，100μL/孔，37℃避光显色15min。

（10）终止：加2M H

结果如图14所示，对标准阴、阳性血清分别进行48次检测，所有检测A值均符合正态分布，所以我们选定当阳性对照血清A值≤0.2，阴性对照血清A值≥0.9，试验结果有效。

8. 阻断ELISA临界值的确定

对北京市农林科学院畜禽疫病研究中心收集的715份牛血清进行中和试验，确定血清中是否含有IBRV中和抗体。中和试验步骤如下：

（1）提前一天将MDBK细胞传至96孔板，以保证试验用细胞处于对数生长期。

（2）将血清置于56℃水浴灭活30分钟。

（3）用无血清DMEM将待检血清和IBRV标准阴性血清和标准阳性血清从1:4、1:8依次稀释至1:256，分别将待检血清和标准阴、阳性血清加到96孔细胞培养板孔中，每孔60 μl，每组重复2孔，最后一行加待检血清做血清毒性对照。

（4）每孔加200TCID50/100 μl的病毒悬液60 μl。在血清毒性对照孔中加入60μl无血清DMEM代替病毒稀释液。

（5）用无血清DMEM将100TCID50/100 μl的病毒液做3次10倍连续稀释，每一个稀释度4孔，每孔加病毒悬液60 μl，做病毒回归对照。

（6）将培养板置于37℃ CO

（7）吸取100 μl上述混合液，加入到单层生长的MDBK细胞中去，37℃孵育1小时后，用维持液替换掉孔中液体，37℃ CO

（8）用倒置显微镜观察细胞病变情况。检查回归滴度，病毒回归对照在100TCID50/100 μl和10TCID50/100 μl均出现病变，1TCID50/100μl孔半数细胞出现病变，0 TCID50/100μl孔未出现细胞病变。阴性血清对照均出现细胞病变，血清毒对照未出现病变。

结果表明，715份牛血清中，443份为IBRV抗体阳性，272份为IBRV抗体阴性。用我们建立的阻断ELISA方法对715份牛血清进行检测，并计算S/N值（S/N值是指：样品孔的OD450与阴性对照孔的OD450的比值）。通过绘制接受者操作特性曲线（Receiver operatingcharacteristic curve，ROC）来确定阻断ELISA方法最佳的cut-off值。一般来说，将约登指数最大时对应的临界值判定为诊断方法的cut-off值，约登指数=灵敏度+特异度—1。

利用本发明建立的阻断ELISA方法对715份牛血清进行检测，并计算S/N值。然后相对应地输入中和试验的定性结果，利用SPSS22.0软件绘制ROC曲线。如图15所示，曲线下面积为0.977，标准误差为0.006，95%的置信区间为0.965-0.989，P<0.001说明本发明建立的方法具有很高的准确度。根据ROC曲线各个切点的灵敏度和特异度—1，计算约登指数，约登指数最大的切点即为阻断ELISA的临界点。如表9，当cut-off值为0.885时，具有最大的约登指数0.88。因此，结果判定方法为：S/N≥0.885时为IBRV抗体阴性；S/N﹤0.885时为IBRV抗体阳性。

表9 ROC曲线的坐标

9. 阻断ELISA方法的特异性评定

挑选当前对养牛业危害比较严重的病原的标准阳性血清，与IBRV标准阳性血清和标准阴性血清同时进行阻断ELISA检测。按照“7. 试验成立条件的确定”中建立的阻断ELISA方法（即本发明的阻断ELISA方法）检测了5种牛病的阳性血清：牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫、牛副结核、牛病毒性腹泻以及IBRV，S/N≥0.885时为IBRV抗体阴性，S/N﹤0.885时为IBRV抗体阳性。结果如图16所示，除IBRV标准阳性血清以外，其余4种血清均表现出明显的阴性反应，说明本发明的阻断ELISA方法与检测的这4种病原无交叉反应，特异性好。

10. 阻断ELISA方法的敏感性评价

采用本发明的阻断ELISA方法对本研究中心保存的样品盘中的40份牛血清（10份IBRV抗体阴性血清、10份IBRV抗体弱阳性血清、10份IBRV抗体阳性血清、10份IBRV抗体强阳性血清）和30份临床感染IBRV抗体阳性的牛血清进行检测，S/N≥0.885时为IBRV抗体阴性，S/N﹤0.885时为IBRV抗体阳性。结果如表10所示，阳性检出率为100%（60/60），阴性检出率为100%（10/10）。

表10 本发明的阻断ELISA方法对样品盘和临床阳性血清的检测结果

注：表中NC

11. 阻断ELISA方法的灵敏度评价

将牛传染性鼻气管炎病毒抗体阳性血清按1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024进行稀释，同时采用本发明的阻断ELISA方法和中和试验（参照上述“8. 阻断ELISA临界值的确定”中的中和试验步骤）对稀释的牛传染性鼻气管炎病毒抗体阳性血清进行检测，确定本发明的阻断ELISA方法的灵敏度。如表11所示，本发明的阻断ELISA方法的灵敏度为1：256，中和试验可检测到1：32的稀释度。

表11 本发明的阻断ELISA方法的灵敏性试验

注：表中NC

12. 阻断ELISA方法的重复性评价

（1）批内重复：使用同批次包被重组gD蛋白的酶标板，检测3份IBRV标准阳性血清和2份IBRV标准阴性血清，每份血清做5个重复，通过计算S/N值、标准差和变异系数，评定阻断ELISA方法的批内重复性和板内重复性。

（2）批间重复：使用不同批次包被重组gD蛋白的酶标板，检测3份IBRV标准阳性血清和2份IBRV标准阴性血清，通过计算S/N值、标准差和变异系数，评定阻断ELISA方法的批间重复性。

通过比较3份阳性血清和2份阴性血清的S/N值来确定批间、批内的可变性。用本发明的阻断ELISA方法将5份血清在同一块酶标板和三块不同的酶标板间重复检测。结果如表12所示，批间S/N值的变异系数在2.69%-8.3%之间，平均值为4.16%，批内S/N值的变异系数在2.9%-4.6%，平均值为3.64%。以上数据说明本发明建立的阻断ELISA方法具有很好的重复性。

表12 本发明的阻断ELISA方法的重复性

13. 阻断ELISA方法的符合性评价

分别使用本发明的阻断ELISA方法和美国IDEXX IBRV gE抗体检测试剂盒（参照试剂盒说明书中的操作步骤）对715份牛血清进行检测，通过分析方法之间的总符合率及一致性来评价阻断ELISA方法的符合性。通过引入Kappa统计量来分析方法间的一致性，一般来说Kappa值越高，说明两种方法的一致性越好。本发明的阻断ELISA方法与商业试剂盒符合性比较结果如表13所示，两种方法的总符合率为93.85%，Kappa为0.992（P<0.001），说明两种方法具有很高的符合率。

表13 本发明的阻断ELISA方法与商业试剂盒的符合性比较

实施例3. 用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的抗体的ELISA试剂盒的制备

试剂盒组装：将重组gD蛋白（实施例1制备的重组gD蛋白）、酶标板、封闭液（鸡血清）、酶标单抗（实施例2制备的HRP标记的抗IBRV单抗，分泌该单抗的杂交瘤细胞的保藏号为CGMCC No. 21015）、TMB显色液、终止液（2M H

试剂盒的使用方法如下：

（1）包被：用0.1M pH8.5 Tris-HCL缓冲液配制浓度为2.5～5μg/mL的重组gD蛋白溶液，按照100μL/孔加入酶标板中，37℃孵育1h后4℃过夜包被。

（2）洗板：用洗板机洗5次，每次每孔加350μL PBST，洗完后在吸水纸上拍尽孔内残存的洗液。

（3）封闭：每孔加入300μL 5%（v/v）鸡血清（PBST稀释），37℃封闭2h。

（4）洗板：同（2）。

（5）加样：将待检血清样品用PBST进行1:2稀释后，100μL/孔，37℃孵育1h。

（6）洗板：同（2）。

（7）一抗：用PBST配制浓度为0.54～2.15μg/mL酶标单抗溶液，100μL/孔，37℃孵育1h。

（8）洗板：同（2）。

（9）显色：加TMB单组份显色液，100μL/孔，37℃避光显色15min。

（10）终止：加2M H

（11）结果判定：样品孔的OD450与阴性对照孔的OD450的比值为S/N值；若S/N值≥0.885，则样品中不含有牛传染性鼻气管炎病毒的抗体；若S/N值﹤0.885，则样品中含有牛传染性鼻气管炎病毒的抗体。

实施例4. 用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的阻断ELISA试剂盒的应用

1.阻断ELISA方法与中和试验符合性评价

分别使用中和试验（参照上述“8. 阻断ELISA临界值的确定”中的中和试验步骤）、本发明的阻断ELISA试剂盒（实施例3）对715份牛血清进行检测，通过分析方法之间的总符合率及一致性来评价阻断ELISA方法的符合性。结果如表14所示，两种方法的总符合率为99.58%，Kappa为0.991（P<0.001），说明两种方法具有很高的符合率。

表14 本发明的阻断ELISA方法与中和试验的符合性比较

2.对疫苗免疫效果的评价

分别使用中和试验（参照上述“8. 阻断ELISA临界值的确定”中的中和试验步骤）、本发明的阻断ELISA试剂盒（实施例3）对北京市大地群生牛场采集的不同免疫阶段的59份健康免疫牛的血清进行检测，通过比较这些血清的中和效价和阻断ELISA方法的S/N值之间的关系，来建立一套评价牛IBRV疫苗免疫效果的方案。

结果如图17所示，我们建立了阻断ELISA的S/N值与血清中和效价log2值的函数关系式：y = 9.3161e

以上实验中，建立阻断ELISA方法时最佳抗原抗体使用量、最佳包被条件、最佳封闭条件和血清稀释度的N/P值、评判试验成立条件的正态分布以及阻断ELISA评价中的特异性、灵敏度、敏感性、重复性和符合率均由Microsoft Excle’s CORREL计算并分析；单抗阻断活性的T检验、ROC曲线以及Kappa值的运算均由软件SPSS20计算。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用

<130> P200902-NLK

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1029

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgacgg tatacgtcga cccgccggcg tacccgatgc cgcgatacaa ctacactgaa 60

cgctggcaca ctaccgggcc cataccgtcg cccttcgcag acggccgcga gcagcccgtc 120

gaggtgcgct acgcgacgag cgcggcggcg tgcgacatgc tggcgctgat cgcagacccg 180

caggtggggc gcacgctgtg ggaagcggta cgccggcacg cgcgcgcgta caacgccacg 240

gtcatatggt acaagatcga gagcgggtgc gcccggccgc tgtactacat ggagtacacc 300

gagtgcgagc ccaggaagca ctttgggtac tgccgctacc gcacaccccc gttttgggac 360

agcttcctgg cgggcttcgc ctaccccacg gacgacgagc tgggactgat tatggcggcg 420

cccgcgcggc tcgtcgaggg ccagtaccga cgcgcgctgt acatcgacgg cacggtcgcc 480

tatacagatt tcatggtttc gctgccggcc ggggactgct ggttctcgaa actcggcgcg 540

gctcgcgggt acacctttgg cgcgtgcttc ccggcccggg attacgagca aaagaaggtt 600

ctgcgcctga cgtatctcac gcagtactac ccgcaggagg cacacaaggc catagtcgac 660

tactggttca tgcgccacgg gggcgtcgtt ccgccgtatt ttgaggagtc gaagggctac 720

gagccgccgc ctgccgccga tgggggttcc cccgcgccac ccggcgacga cgaggcccgc 780

gaggatgaag gggagaccga ggacggggca gccgggcggg agggcaacgg cggcccccca 840

ggacccgaag gcgacggcga gagtcagacc cccgaagcca acggaggcgc cgagggcgag 900

ccgaaacccg gccccagccc cgacgccgac cgccccgaag gctggccgag cctcgaagcc 960

atcacgcacc ccccgcccgc ccccgctacg cccgcggccc ccgacgccgt gccggtcagc 1020

gtcgggatc 1029

<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Thr Val Tyr Val Asp Pro Pro Ala Tyr Pro Met Pro Arg Tyr

1 5 10 15

Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr Gly Pro Ile Pro Ser Pro Phe

20 25 30

Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val Arg Tyr Ala Thr Ser Ala

35 40 45

Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala Asp Pro Gln Val Gly Arg

50 55 60

Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Thr

65 70 75 80

Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr

85 90 95

Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys His Phe Gly Tyr Cys Arg

100 105 110

Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe Leu Ala Gly Phe Ala Tyr

115 120 125

Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met Ala Ala Pro Ala Arg Leu

130 135 140

Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr Ile Asp Gly Thr Val Ala

145 150 155 160

Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala Gly Asp Cys Trp Phe Ser

165 170 175

Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys Phe Pro Ala

180 185 190

Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg Leu Thr Tyr Leu Thr Gln

195 200 205

Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile Val Asp Tyr Trp Phe Met

210 215 220

Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr

225 230 235 240

Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser Pro Ala Pro Pro Gly Asp

245 250 255

Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr Glu Asp Gly Ala Ala Gly

260 265 270

Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Asp Gly Glu Ser

275 280 285

Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly Ala Glu Gly Glu Pro Lys Pro Gly

290 295 300

Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Gly Trp Pro Ser Leu Glu Ala

305 310 315 320

Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Asp Ala

325 330 335

Val Pro Val Ser Val Gly Ile

340

<210> 3

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3