CMV的通过融合修饰的病毒样颗粒

本发明涉及一种植物病毒黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒，并且更具体地涉及包括嵌合CMV多肽的CMV的经修饰的VLP，所述嵌合CMV多肽包括在特定位置处插入到CMV多肽中的抗原多肽，并且进一步包括替代所述CMV多肽的N端区域的Th细胞表位。此外，这些经修饰的VLP优选地充当疫苗平台，用于产生针对融合到所述CMV多肽中的所述抗原多肽的免疫应答，特别是抗体应答。此外，本发明涉及经修饰的病毒样颗粒，所述经修饰的病毒样颗粒为花叶病毒样颗粒，其包括包含融合的抗原多肽的所述嵌合CMV多肽和不包括所述抗原多肽的另外的CMV蛋白。

背景技术

植物病毒及其衍生的病毒样颗粒(VLP)最近备受关注，这主要是由于植物作为用于生产VLP疫苗的经济且快速的替代性平台，这是因为其具有提供独特的转译后修饰、成本效益、有益的安全性、生产速度和可扩展性的能力(Chen Q和Lai H,《人类疫苗与免疫疗法(Human Vaccines&Immunotherapeutics)》(2013)9:26-49；Zeltins A,《分子生物技术(MolBiotechnol)》(2013)53:92-107)。此外，特别是植物病毒的VLP被认为是在其表面上呈递不同抗原的载体结构，旨在引发观察到的与感染性哺乳动物病毒类似的强免疫应答(Balke I等人,《先进药物递送评论(Adv.Drug Deliv.Rev.)》(2018)https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.08.007)。

黄瓜花叶病毒(CMV，雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)家族，黄瓜花叶病毒属)是一种线性正义等径植物病毒，具有很大的宿主范围。病毒基因组由三个单链RNA(RNA1、RNA2和RNA3)组成，外壳蛋白(CP)基因存在于基因组RNA3(约2200nt)和亚基因组RNA4(约1000nt)两者中。衣壳包括约25kDa的单个蛋白质种类的180个拷贝。从CMV已知有许多与宿主植物有关的变异症状相关联的不同菌株，如CMV-B菌株、CMV-C菌株、CMV-D菌株、CMV-L菌株、CMV-S菌株、CMV-T菌株、CMV-WL菌株、CMV-V菌株、CMV-Fny菌株、CMV-Ix菌株、CMV-Q菌株、CMV-R菌株等(Carrère I等人,《病毒学档案(Arch Virol)》(1999)144:1846-1857；Edwards MC等人,《植物病理学(Phytopathology)》81983)73:1117-1120；

近年来，已经描述了使用化学接头偶联技术在其表面上呈递不同抗原的基于CMVVLP的疫苗平台。所描述的CMV VLP衍生自具有插入的T细胞刺激性表位的CMV的经修饰的CP(A.Zeltins等人,《疫苗(Vaccines)》2(2017)30；WO2016/062720)。

CMV的嵌合形式也已被工程化，以充当呈递系统并在其外表面表达衍生自丙型肝炎病毒(HCV)的表位。详细地，CMV伪重组形式CMV-D/S已经被工程化以携带来自CMV-S菌株的基因组RNA3和来自CMV-D菌株的RNA1和RNA2。在接种之后，此系统在Xanthi烟草植物中出现了病毒症状，如轻度花叶和静脉清除。然后CP基因在不同位置处被工程化，以对丙型肝炎病毒(HCV)表位进行编码。所选肽是所谓的R9模拟表位，作为衍生自HCV包膜蛋白E2的许多高变区1(HVR1)序列的27个氨基酸的合成肽。考虑到以下重要因素，对R9模拟表位插入到CMV基因的插入点进行了选择：i)需要保护CMV外壳蛋白的N端区域(含有高浓度的碱性氨基酸)，被称为内部R结构域，参与蛋白质-RNA相互作用来稳定CMV(Wikoff WR等人,《病毒学(Virology)》(1997)232:91-97)，其特征是具有异常的N端螺旋以及衣壳中的另外的稳定作用(Smith TJ等人,《病毒杂志(J Virol)》(2000)74:7578-7686)；ii)外源表位的表面位置，以增加其推定的免疫原性能力的机会；iii)能够产生经修饰的克隆的诱变途径的可用性。基于这些考虑，已经在CMV-S RNA3的CP基因内的不同位置处进行了R9模拟表位的插入(AF063610,

此外，基于黄瓜花叶病毒的表达系统已被描述为针对阿尔茨海默氏病的潜在疫苗以及用于生产猪圆环病毒疫苗(Vitti A等人,《病毒方法杂志(J Virol Methods)》(2010)169:332-340；Gellert A等人,《公共科学图书馆综合(PloS ONE)》(2012)7(12):e52688)。详细地，创建了在CMV外壳蛋白(CP)基因的位置248、392或529中携带长度为不同的11到15个氨基酸的Aβ-衍生片段的嵌合构建体，并且病毒产物经证明能够在其自然宿主中复制。另一方面，将长度多达20个氨基酸的猪2型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白表位整合到黄瓜花叶病毒(CMV)-R菌株的植物病毒外壳蛋白中的氨基酸位置131之后。此插入点131到132定位在CMV CP的βE-αEF环的中间，并且得出的结论是此位置具有优势，优势在于插入的表位在CMVCP三聚体的中间形成一个三方基团，使更有效地产生抗体。

此外，也描述了CMV的嵌合病毒样颗粒(VLP)的产生，即使通过广泛使用的传统大肠杆菌表达系统表达CMV的病毒衣壳蛋白(CP)仅导致不溶性包涵体或极少量的可溶性蛋白(Xu Y等人,《化学通讯(Chem Commun)》(2008)49-51)。另一方面，从基于马铃薯X病毒(PVX)的载体表达的嵌合CMV外壳蛋白能够组装成VLP(Natilla,A等人,《病毒学档案》(2006)151:1373-1386；Natilla,A等人,《蛋白质表达和纯化(Protein Expression andPurification)》(2008)59:117-121；Chen Q和Lai H,《人类疫苗与免疫疗法》(2013)9:26-49)。嵌合CMV外壳蛋白包括新城疫病毒(NDV)的长度为17到25个氨基酸的表位，这些表位通过基因融合到CMV CP的对应于其氨基酸位置194到199的内部βH-βI(基序5)环中(He X等人,(1998)《普通病毒学杂志(J Gen Virol)》79:3145-3153)。

即使在基于VLP的疫苗开发过程中已取得进展，但仍需要另外的独特的VLP系统。具体地，疫苗在被免疫的受试者和个体中诱导通常跨越超过100倍的变异范围的变异抗体应答。另外，一些疫苗，如抗乙型肝炎疫苗经历一定数量的无应答者。无应答性与某些II类MHC分子相关联，并且据信未能诱导良好的T辅助(Th)细胞应答导致这些个体中不良抗体应答(Goncalves L等人,《病毒学(Virology)》(2004)326:20-28)。此外，老年人总体上抗体应答较差，并且Th细胞应答较差再次被认为是抗体应答效率低下的原因。因此，基本上在所有受试者和个体中诱导良好的Th细胞应答的疫苗是疫苗开发领域中的重要目标。此外，在疫苗构建过程期间还需要解决的另一个相关联的非常重要的问题是抗原空间构象。对于疫苗构建，重要的是在颗粒表面实现最佳的肽呈递而不影响整体病毒结构。这是显而易见的，因为仅在特殊情况下，VLP才能容纳长度超过50个或70个或者甚至更长的氨基酸的蛋白质结构域并保留典型的VLP形态(I.Balke等人,《先进药物递送评论》(2018),https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.08.007；I.Kalnciema等人,《分子生物技术(Mol.Biotechnol.)》52(2012)129-139)。

发明内容

现在惊奇地发现，可以将各种并且非常不同的长度和性质的抗原多肽插入已经通过掺入T辅助细胞表位而修饰的CMV多肽的特定位置处，并且所述所得融合蛋白仍然能够形成和组装成另外具有高免疫原性的经修饰的病毒样颗粒(VLP)。优选地并且进一步令人惊讶地，已经产生了花叶修饰的病毒样颗粒，其包括具有融合的抗原多肽的所述所描述的融合蛋白，并且进一步包括不具有此类融合的抗原多肽的CMV蛋白。发现这些花叶修饰的CMVVLP高度有益并且甚至允许掺入长度非常长的抗原多肽，如掺入长度最多超过200个氨基酸的抗原多肽。

在第一方面中，本发明提供了一种黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其包括至少一种融合蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括

a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：

(i)CMV多肽，其中所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；以及

(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，

其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；以及

(iii)T辅助细胞表位，其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，并且其中优选地所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12。

在另外的方面中，本发明提供了一种CMV的经修饰的VLP，其包括至少一种融合蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括

a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：

(i)CMV多肽，其中所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与所述外壳蛋白并且优选地与所述SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；以及

(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，

其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；以及

iii)第一氨基酸接头，优选地第一氨基酸接头和第二氨基酸接头，其中所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的N端处或C端处，并且其中优选地所述第一氨基酸接头选自由以下组成的组：

(a.)长度为n＝2-10的聚甘氨酸接头(Gly)

(b.)包括至少一个甘氨酸和至少一个丝氨酸的甘氨酸-丝氨酸接头(GS接头)，其中优选地所述GS接头的氨基酸序列为(GS)

(c.)包括至少一个Gly、至少一个Ser和选自Thr、Ala、Lys、Asp和Glu的至少一个氨基酸的氨基酸接头。

在另一方面中，本发明提供了一种黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其包括

(a)至少一种融合蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括

a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：

(i)CMV多肽，其中所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；以及

(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，

其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；以及

(b)至少一种CMV蛋白，其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述CMV蛋白任选地通过T辅助细胞表位修饰，其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV蛋白的N端区域，并且其中优选地所述CMV蛋白的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12。

随着本说明书继续，本发明的另外的方面和实施例将变得显而易见。

附图说明

图1：具有单切限制酶位点的pET-CMV-Ntt830-Ab36质粒图谱的描述。所有其它图谱(pET-CMV-Ntt830-Ab15；pET-CMV-Ntt830-Ab16；pET-CMV-Ntt830-Ab17)具有基本相同的序列和基因组织；其仅在对淀粉样蛋白(β)肽进行编码的核苷酸序列上不同。

图2A：衍生自CMV-Ntt830-Ab36表达的VLP的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，编号26620)；S-在蔗糖梯度(20-60％)之前在细胞提取物中在20℃下培养18小时后在大肠杆菌C2566细胞中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图2B：衍生自CMV-Ntt830-Ab15表达的VLP的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；S-在蔗糖梯度(20-60％)之前在细胞提取物中在20℃下培养18小时后在大肠杆菌C2566细胞中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图2C：衍生自CMV-Ntt830-Ab16表达的VLP的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；S-在蔗糖梯度(20-60％)之前在细胞提取物中在20℃下培养18小时后在大肠杆菌C2566细胞中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图2D：衍生自CMV-Ntt830-Ab17表达的VLP的纯化的SDS-PAGE凝胶分析法。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；S-在蔗糖梯度(20-60％)之前在细胞提取物中在20℃下培养18小时后在大肠杆菌C2566细胞中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图3A：衍生自CMV-Ntt830-Ab36的表达的经纯化的VLP的电子显微镜分析。白色水平条对应于100nm。

图3B：衍生自CMV-Ntt830-Ab15的表达的经纯化的VLP的电子显微镜分析。白色水平条对应于100nm。

图3C：衍生自CMV-Ntt830-Ab16的表达的经纯化的VLP的电子显微镜分析。白色水平条对应于100nm。

图3D：衍生自CMV-Ntt830-Ab17的表达的经纯化的VLP的电子显微镜分析。白色水平条对应于100nm。

图4：具有阿杜卡尼单抗(aducanumab)的可变区序列的单克隆抗体与CMV-Ntt830-Ab36 VLP、Aβ1-42肽以及与CMV-Ntt830 VLP的结合。

图5A：CMV-Ntt830-Ab16 VLP、CMV-Ntt830-Ab17 VLP和CMV-Ntt830-Ab36 VLP诱导识别全长Aβ1-42肽的抗体。

图5B：CMV-Ntt830-Ab36 VLP诱导识别阿尔茨海默氏病患者的脑斑块的抗体

图6：具有单切限制酶位点的pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt质粒图谱的描述。表达载体确保CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830同时合成。

图7A：对包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830的花叶VLP进行纯化的SDS-PAGE凝胶。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566/pETDu-CMVxArah202-CMVtt细胞中的总蛋白；S-蔗糖梯度之前的细胞提取物中的可溶性蛋白(20-60％)；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图7B：包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830的花叶VLP的纯化的蛋白质印记分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566/pETDu-CMVxArah202-CMVtt细胞中的总蛋白；S-蔗糖梯度之前的细胞提取物中的可溶性蛋白(20-60％)；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。对于蛋白质印迹，使用了针对Arah2的兔pAb(1:1000；Indoor生物科技公司(Indoor Biotechologies)，编号PA-AH2)。蛋白质印迹证实了CMV VLP级分中存在Ara-h202。星号(

图8A：包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830的花叶VLP的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)，1-经纯化的CMV-Ntt830 VLP(对照样品)2-经纯化的包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830的花叶VLP。

图8B：包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830的花叶VLP的纯化的电子显微镜分析。包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830的花叶VLP的纯化的电子显微镜图像。白色水平条对应于100nm。

图9：在用Ara-h202或包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830(CMV-M-Arah202)的花叶VLP免疫后14天，针对重组Ara-h202进行IgG的ELISA。

图10A：研究具有CMV-M-Arah202的疫苗接种对过敏性全身和局部反应的保护作用的实验设计

图10B：保护免受全身性和局部激发。用花生提取物进行全身性激发。

图10C：保护免受全身性和局部激发。用花生提取物进行皮肤点刺测试。

图11：具有单切限制酶位点的pET28-CMVBxFeld1-CMV-tt质粒图谱的描述。表达载体确保CMV-Ntt830-Feld12和未经修饰的CMVNtt830同时合成。

图12A：对包括CMV-Ntt830-Feld12和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-Fel)进行纯化的SDS-PAGE凝胶。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；0-在诱导之前的大肠杆菌C2566/pET28-CMVxFeld1-CMVtt细胞中的总蛋白；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566/pET28-CMVxFeld1-CMVtt细胞中的总蛋白。S-蔗糖梯度离心之前的细胞提取物中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图12B：包括CMV-Ntt830-Feld12和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-Fel)的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)，1-包括CMV-Ntt830-Feld12和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的经纯化的花叶VLP(即，CMV-M-Fel)。

图12C：包括CMV-Ntt830-Feld12和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-Fel)的纯化的电子显微镜分析。包括CMV-Ntt830-Feld12和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的经纯化的花叶VLP(即，CMV-M-Fel)的电子显微镜图像。白色水平条对应于100nm。

图13：CMV-M-Fel诱导抗Fel d1的有效抗体应答。抗Fel d1的IgG显示为在用Feld1、CMV-Ntt830-Feld12的VLP和包括CMV-Ntt830-Feld12和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-Fel)对原初小鼠进行免疫后14天在450nm处的吸光度。

图14A：研究具有CMV-M-Fel的疫苗接种对过敏性全身和局部反应的保护作用的实验设计。

图14B：CMV-M-Fel诱导针对Fel d1的全身性激发的保护作用。用3微克的Fel d1提取物、重组二聚体Fel d1静脉内进行激发。

图15：pET28-CMVB2x19nanp-CMVtt质粒图谱的描述。质粒用于表达包括CMV-Ntt830-19NANP和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-CSP)。

图16：包括CMV-Ntt830-19NANP和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-CSP)的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；S-在蔗糖梯度之前在细胞提取物中在20℃下培养18小时后在大肠杆菌C2566中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图17：经纯化的CMV-M-CSP花叶VLP的电子显微镜图像。白色水平条对应于100nm。

图18：含有具有克隆的α-突触核蛋白表位cDNA的CMVNtt830基因的pET-CMV-Ntt830-egy质粒克隆的描述。此质粒的详细描述是均具有基本相同的序列和基因组织的质粒克隆pET-CMV-Ntt830-egy、pET-CMV-Ntt830-kne和pET-CMV-Ntt830-mdv的描述；其仅在对α-水核蛋白肽变体进行编码的核苷酸序列上有所不同。

图19A：衍生自CMV-Ntt830-egy的表达的VLP的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566细胞中的总蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。

图19B：衍生自CMV-Ntt830-kne的表达的VLP的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566细胞中的总蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。

图19C：衍生自CMV-Ntt830-mdv的表达的VLP的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566细胞中的总蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。

图20A：经纯化的CMV-Ntt830和α-突触核蛋白肽融合VLP的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；1-经纯化的CMV-Ntt830B-mdv融合蛋白VLP；2-经纯化的CMV-Ntt830B-egy融合蛋白VLP；3-经纯化的CMV-Ntt830B-kne融合蛋白VLP；4-经纯化的CMV-Ntt830未经修饰的VLP。

图20B：经纯化的CMV-Ntt830B-egy融合蛋白VLP的电子显微镜图像。白色水平条对应于100nm。

图20C：经纯化的CMV-Ntt830B-kne融合蛋白VLP的电子显微镜图像。白色水平条对应于100nm。

图20D：经纯化的CMV-Ntt830B-kne融合蛋白VLP的电子显微镜图像。白色水平条对应于100nm。

图21A：pETDu-CMVB3d-CMVB3d-flIL5-CMVtt质粒图谱的描述。质粒用于表达包括CMV-Ntt830-fel-IL-5和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-fel-IL-5)。

图21B：pETDu-CMVB3d-CMVB3-flIL5-CMVtt质粒图谱的描述。质粒用于表达包括CMV-Ntt830-fel-IL-5

图22A：包括CMV-Ntt830-fel-IL-5和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-fel-IL-5)的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；0-在IPTG诱导之前的大肠杆菌C2566/pETDu-CMVB3d-flIL5-CMVtt细胞中的蛋白；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566/pETDu-CMVB3d-flIL5-CMVtt细胞中的总蛋白。S-蔗糖梯度(20-60％)之前的细胞提取物中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图22B：包括CMV-Ntt830-fel-IL-5和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-fel-IL-5

M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；0-在IPTG诱导之前的大肠杆菌C2566/pETDu-CMVB3-flIL5-CMVtt细胞中的蛋白；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566/pETDu-CMVB3-flIL5-CMVtt细胞中的总蛋白。S-蔗糖梯度(20-60％)之前的细胞提取物中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图23A：经纯化的CMV-M-fel-IL-5花叶VLP的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；1-在以13000rpm澄清之后的经纯化的可溶性CMV-M-fel-IL-5花叶VLP；2-在以13000rpm澄清之后的不溶性CMV-Ntt830-fel-IL-5/CMV-Ntt830。

图23B：经纯化的CMV-M-fel-IL-5花叶VLP的电子显微镜图像。水平条对应于200nm。

图23C：经纯化的CMV-M-fel-IL-5

M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；1-在以13000rpm澄清之后的经纯化的可溶性CMV-M-fel-IL-5

图23D：经纯化的CMV-M-fel-IL-5

图24：pETDu-CMVB3d-CMVB3d-2xflIL5-CMVtt质粒图谱的描述。质粒用于表达包括CMV-Ntt830-fel-IL-5和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-2xfel-IL-5)。

图25：包括CMV-Ntt830-2xfel-IL-5和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-2xfel-IL-5)的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；0-在IPTG诱导之前的大肠杆菌C2566/pETDu-CMVB3d-2xflIL5-CMVtt细胞中的蛋白；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566/pETDu-CMVB3d-2xflIL5-CMVtt细胞中的总蛋白。S-蔗糖梯度(20-60％)之前的细胞提取物中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图26A：经纯化的CMV-M-2xfel-IL-5花叶VLP的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；1-在以13000rpm澄清之后的经纯化的可溶性CMV-M-2xfel-IL-5花叶VLP；2-在以13000rpm澄清之后的不溶性CMV-Ntt830-2xfel-IL-5/CMV-Ntt830。

图26B：经纯化的CMV-M-2xfel-IL-5花叶VLP的电子显微镜图像。水平条对应于200nm。

图27：pETDu-CMVB3d-CMVB3d-cIL1b-CMVtt质粒图谱的描述。质粒用于表达包括CMV-Ntt830-cIL-1b和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-cIL-1b)。

图28：包括CMV-Ntt830-cIL-1b和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-cIL-1b)的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；0-在IPTG诱导之前的大肠杆菌C2566/pETDu-CMVB3d-cIL1b-CMVtt细胞中的蛋白；T-在20℃下培养18小时之后，大肠杆菌C2566/pETDu-CMVB3d-cIL1b-CMVtt细胞中的总蛋白。S-蔗糖梯度(20-60％)之前的细胞提取物中的可溶性蛋白；P-不溶性蛋白；1-6-蔗糖梯度级分(从管底部的60％到顶部的0％)。星号(

图29A：经纯化的CMV-M-cIL-1b花叶VLP的SDS-PAGE凝胶分析。M-蛋白质大小标志物PageRuler(赛默飞世尔科技公司，编号26620)；1-在以13000rpm澄清之后的经纯化的可溶性CMV-M-cIL-1b花叶VLP；2-在以13000rpm澄清之后的不溶性CMV-Ntt830-cIL-1b/CMV-Ntt830。

图29B：经纯化的CMV-M-cIL-1b花叶VLP的电子显微镜图像。水平条对应于200nm。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文中所描述和公开的实施例、优选实施例和非常优选的实施例应适用于所有方面以及其它实施例、优选实施例和非常优选的实施例，无论是否再次具体提及或为了简明起见避免重复。如本文所使用的，冠词“一个(a)”和“一种(an)”是指所述冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法宾语。除非上下文另外明确指出，否则如本文所使用的术语“或”应理解为意指“和/或”。

病毒样颗粒(VLP)：如本文所使用的，术语“病毒样颗粒(VLP)”是指非复制性或非感染性的、优选地为非复制性和非感染性的病毒颗粒，或者是指非复制或非感染性的、优选地为非复制和非感染性的结构，类似于病毒颗粒、优选地为病毒的衣壳。如本文所使用的，术语“非复制性”是指不能复制VLP包括的基因组。如本文所使用的，术语“非感染性”是指不能进入宿主细胞。根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非感染性的，因为其缺乏病毒基因组或基因组功能的全部或部分。根据本发明的病毒样颗粒可以含有与其基因组不同的核酸。重组产生的病毒样颗粒通常含有宿主细胞衍生的RNA。根据本发明的病毒样颗粒的典型且优选的实施例是由本发明的多肽构成的病毒衣壳。病毒样颗粒通常是由病毒外壳蛋白构成的大分子组装体，每个病毒样颗粒通常包括60、120、180、240、300、360或超过360个蛋白亚基。通常且优选地，这些亚基的相互作用导致具有固有的重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构的形成。病毒样颗粒的一个特征是其亚基的高度有序和重复排列。

CMV的经修饰的病毒样颗粒：术语“CMV的经修饰的病毒样颗粒”是指包括至少一种包括CMV多肽的融合蛋白的病毒样颗粒。通常且优选地，CMV的经修饰的病毒样颗粒类似于CMV的衣壳的结构。CMV的经修饰的病毒样颗粒是非复制性和/或非感染性的，并且缺少对CMV复制机制进行编码的至少一种或多种基因，并且通常还缺少对负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质进行编码的一种或多种基因。此定义还包含经修饰的病毒样颗粒，其中上述一种或多种基因仍然存在但无活性。优选地，非复制和/或非感染性的经修饰的病毒样颗粒通过重组基因技术获得，并且通常且优选地不包括病毒基因组。包括两个或更多个不同多肽的经修饰的病毒样颗粒被称为“花叶VLP”，并且特别地被本发明涵盖。花叶修饰的病毒样颗粒是本发明的非常优选的实施例和方面。因此，在一个实施例中，根据本发明的经修饰的病毒样颗粒包括至少两种不同种类的多肽，非常优选地，所述花叶VLP包括两种不同种类的根据本发明任选地经修饰的CMV多肽，从而产生花叶修饰的CMC VLP。优选地，CMV的经修饰的VLP是由根据本发明修饰的CMV多肽构成的大分子组装体，每个VLP通常包括180个此类蛋白质亚基。

多肽：如本文所使用的术语“多肽”是指由通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接的氨基酸单体构成的聚合物。其表示氨基酸的分子链，并不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质包含在多肽的定义内。如本文所使用的术语“多肽”还应通常且优选地指如之前定义的多肽，并且涵盖修饰，如转译后修饰，包含但不限于糖基化。在优选实施例中，如本文所使用的所述术语“多肽”应指如之前定义的多肽，并且不涵盖修饰，如转译后修饰，如糖基化。具体地，对于所述生物活性肽，所述修饰如所述糖基化甚至可以随后在体内例如通过细菌发生。

黄瓜花叶病毒(CMV)多肽，CMV多肽：如本文所使用的，术语“黄瓜花叶病毒(CMV)多肽”是指包括以下或优选地由以下组成的多肽：(i)黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白的氨基酸序列，或(ii)突变氨基酸序列，其中要突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变氨基酸序列和所述要突变的氨基酸序列，即，CMV的所述外壳蛋白显示出至少90％、优选地至少95％、进一步优选地至少98％、并且再更优选地至少99％的序列同一性。通常且优选地，CMV多肽能够通过自组装表达而形成CMV的病毒样颗粒。如本文所使用的，当在多肽上下文中提及时，术语“嵌合”是指包括来自两个或更多个不同来源的多肽组分的多肽。此术语进一步旨在赋予多肽组分结合或偶联在一起的特定方式，即分别通过融合键和肽键。因此，术语“嵌合CMV多肽”是如此定义的，并且尤其是根据本发明。

黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)：如本文所使用的，术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)”是指天然存在的黄瓜花叶病毒的外壳蛋白。由于黄瓜花叶病毒的宿主范围非常广，因此已知许多不同的CMV菌株和分离菌株，并且已经确定了所述菌株和分离菌株的外壳蛋白的序列，并且因此是本领域技术人员已知的。CMV的所述外壳蛋白(CP)的序列在已知数据库中有描述并可从中检索，如Genbank，

值得注意的是，这些菌株和分离菌株在不同的蛋白质结构域(包含外壳蛋白的N端)具有高度类似的外壳蛋白序列。特别地，所有完全测序的CMV分离菌株中有98.1％在其外壳蛋白序列的前28个氨基酸内共享超过85％的序列同一性，并且所有完全测序的CMV分离菌株中仍有79.5％在其外壳蛋白序列的前28个氨基酸内共享超过90％的序列同一性。

CMV多肽的N端区域：如本文所使用的术语“CMV多肽的N端区域”是指所述CMV多肽的N端，并且特别是指CMV的外壳蛋白的N端，或者是指所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的N端的区域，但以所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的N端的第二个氨基酸开始，如果所述CMV多肽或所述外壳蛋白包括N端甲硫氨酸残基。优选地，在所述CMV多肽或所述外壳蛋白包括N端甲硫氨酸残基的情况下，从实用的角度出发，根据本发明，通常将缺失对甲硫氨酸进行编码的起始密码子并将其添加到Th细胞表位的N端。进一步优选地，出于克隆目的，可以任选地将一个、两个或三个另外的氨基酸、优选地为一个氨基酸插入在所陈述甲硫氨酸与Th细胞表位之间。如本文所使用的术语“CMV多肽或CMV外壳蛋白的突变氨基酸序列的N端区域”是指所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N端，或者是指所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N端的区域，但以所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N端的第二个氨基酸开始，如果所述突变氨基酸序列包括N端甲硫氨酸残基。优选地，在所述CMV多肽或所述外壳蛋白包括N端甲硫氨酸残基的情况下，从实用的角度出发，通常将缺失编码甲硫氨酸的起始密码子并将其添加到Th细胞表位的N端。进一步优选地，出于克隆目的，可以任选地将一个、两个或三个另外的氨基酸、优选地为一个氨基酸插入在所陈述甲硫氨酸与Th细胞表位之间。

重组多肽：在本发明的上下文中，当在多肽的上下文中使用时，术语“重组”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得多肽。通常且优选地，重组多肽在原核表达系统中产生。对于技术人员显而易见的是，在原核表达系统如大肠杆菌中表达的重组产生的多肽可以包括N端甲硫氨酸残基。在重组多肽的成熟期间，通常将N端甲硫氨酸残基从表达宿主中的重组多肽上切割下来。然而，N端甲硫氨酸的切割可能不完整。因此，重组多肽的制剂可以包括具有和不具有N端甲硫氨酸残基的其它相同多肽的混合物。通常且优选地，重组多肽的制剂包括具有N端甲硫氨酸残基的少于10％、更优选地少于5％、并且仍更优选地少于1％的重组多肽。

重组修饰的病毒样颗粒：在本发明的上下文中，术语“重组修饰的病毒样颗粒”是指通过包括重组DNA技术的至少一个步骤的方法获得的经修饰的病毒样颗粒(VLP)。

突变氨基酸序列：术语“突变氨基酸序列”是指通过将一组确定的突变引入到要突变的氨基酸序列中而获得的氨基酸序列。在本发明的上下文中，所述要突变的氨基酸序列通常且优选地是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列。因此，突变氨基酸序列在至少一个氨基酸残基上与CMV的外壳蛋白的氨基酸序列不同，其中，所述突变氨基酸序列和所述要突变的氨基酸序列显示出至少90％的序列同一性。通常且优选地，所述突变氨基酸序列和所述要突变的氨基酸序列显示出至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选地，所述突变氨基酸序列和所述要突变的序列在至多11个、10个、9个、8个、7个、6个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基上不同，其中进一步优选地，所述差异选自插入、缺失和氨基酸交换。优选地，突变氨基酸序列与CMV的外壳蛋白的氨基酸序列在至少一个氨基酸上不同，其中优选地，所述差异是氨基酸交换。

对应于残基的位置…：氨基酸序列上与另一个氨基酸序列的给定残基相对应的位置可以通过序列比对来标识，通常并优选地使用BLASTP算法，最优选地使用标准设置。典型和优选标准设置为：预期阈值：10；字号：3；查询范围内的最大匹配数：0；矩阵：BLOSUM62；空位成本：存在11，扩展1；成分调整：条件成分评分矩阵调整。

序列同一性：基于两个序列的比对确定两个给定氨基酸序列的序列同一性。确定序列同一性的算法对技术人员是可用的。优选地，两个氨基酸序列的序列同一性是使用可公开获得的计算机同源程序，如“BLAST”程序(http://

氨基酸交换：术语氨基酸交换是指氨基酸序列中给定的氨基酸残基被具有不同化学结构的任何其它氨基酸残基，优选地被另一个蛋白原性氨基酸残基所交换。因此，与氨基酸的插入或缺失相反，氨基酸交换不改变所述氨基酸序列的氨基酸总数。

表位：术语表位是指抗原，优选地多肽的连续或不连续部分，其中所述部分可以在MHC分子的上下文中被抗体或T细胞受体特异性结合。关于抗体，特异性结合不包括非特异性结合，但不一定排除交叉反应性。表位通常在空间构象中包括5-20个氨基酸，这对于抗原位点是独特的。

T辅助(Th)细胞表位：如本文所使用的术语“T辅助(Th)细胞表位”是指能够被辅助Th细胞识别的表位。通常且优选地，如本文所使用的术语“Th细胞表位”是指能够与至少一种，优选地多于一种的MHC II类分子结合的Th细胞表位。确定肽序列是否为Th细胞表位的最简单方式是测量肽结合MHC II类分子的能力。这可以通过肽与已知的Th细胞表位肽与MHC II类分子的结合竞争的能力来测量。HLA-DR分子的代表性选择在例如Alexander J等人,《免疫学(Immunity)》(1994)1:751-761中有描述。Th细胞表位对MHC II类分子的亲和力应为至少10

抗原多肽：如本文所使用的，术语“抗原多肽”是指能够由抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子，如果其由MHC分子呈递。抗原多肽还能够被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，从而导致B和/或T淋巴细胞的活化。抗原多肽可以具有一个或多个表位(B-和T-表位)。如本文所使用的抗原多肽也可以是若干种单独的抗原多肽的混合物。本发明的多肽，特别是形成本发明的经修饰的病毒样颗粒的所述本发明融合蛋白包括抗原多肽。

花生过敏原：如本文所使用的，术语“花生过敏原”是指花生(Arachis hypogaea)种类的任何蛋白质及其同种型，显示对人引起过敏。优选地，如本文中所使用的，术语“花生过敏原”是指任何显示的花生过敏原及其同种型，如根据

Fel d1蛋白：如本文所使用的，术语“Fel d1蛋白”是指包括Fel d1的链1和Fel d1的链2或可替代地由其组成的蛋白质。优选地，Fel d1的链1和Fel d1的链2共价连接。在一个优选的实施例中，Fel d1的链1和Fel d1的链2通过至少一个二硫键连接。在另一个优选实施例中，链1和链2直接或通过间隔子融合，在这种情况下，所述Fel d1蛋白进一步包括间隔子或可替代地由其组成。优选地，如本文所定义的，Fel d1蛋白总共由至多300个、甚至更优选地至多200个氨基酸组成。通常且优选地，根据本发明的Fel d1蛋白能够在体内诱导产生与天然存在的Fel d1特异性结合的抗体。

Fel d1的链1：如本文所使用的，术语“Fel d1的链1”是指包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列或其同源序列或可替代地由其组成的多肽。如本文所使用的，术语“SEQ ID NO:76的同源序列”是指与SEQ ID NO:76的同一性大于80％、更优选地大于90％并且甚至更优选大于95％的多肽。如本文所使用的，术语“Fel d1的链1”也应指涵盖如本文所定义的Fel d1的链1的至少一个转译后修饰的多肽，包含但不限于至少一个糖基化的多肽。优选地，如本文所定义的，Fel d1的链1总共由至多130个、甚至更优选地至多100个氨基酸组成。

Fel d1的链2：如本文所使用的，术语“Fel d1的链2”是指包括SEQ ID NO:77、SEQID NO:78或SEQ ID NO:79的氨基酸序列或其同源序列或可替代地由其组成的多肽。如本文所使用的，术语“SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79的同源序列”是指与SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79的同一性大于80％、更优选地大于90％并且甚至更优选大于95％的多肽。如本文所使用的，术语“Fel d1的链2”也应指涵盖如本文所定义的Feld1的链2的至少一个转译后修饰的多肽，包含但不限于至少一个糖基化的多肽，优选地，如本文所定义的，Fel d1的链2总共由至多150个、甚至更优选地至多130个、仍更优选地至多100个氨基酸组成。

佐剂：如本文所使用的，术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激剂或允许在宿主中产生贮库的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物组合时，所述贮库可以提供甚至更强的免疫应答。优选的佐剂是完全和不完全的弗氏佐剂、含铝的佐剂、优选地氢氧化铝和经修饰的胞壁酰二肽。进一步优选的佐剂是矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基苯酚)以及人佐剂(如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌)。此类佐剂在本领域也是众所周知的。可以与本发明的组合物一起施用的另外的佐剂包含但不限于单磷酰基脂质免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可以包括这些物质的混合物。病毒样颗粒通常被描述为佐剂。然而，在本申请的上下文中使用的术语“佐剂”是指佐剂不是本发明的病毒样颗粒。而是“佐剂”涉及本发明的组合物、疫苗或药物组合物的另外的独特组分。

氨基酸接头：如本文所使用的术语“氨基酸接头”是指仅由氨基酸残基组成的接头。氨基酸接头的氨基酸残基由本领域已知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸、全L或全D或其混合物构成。氨基酸接头的氨基酸残基优选地是天然存在的氨基酸、全-L或全-D或其混合物。

GS接头：如本文所使用的，术语“GS接头”是指仅由甘氨酸残基和丝氨酸氨基酸残基组成的接头。根据本发明的GS接头包括至少一个甘氨酸残基和至少一个丝氨酸残基。通常且优选地，根据本发明的GS接头的长度为至多50个氨基酸，并且通常且进一步优选地，根据本发明的GS接头的长度为至多30个氨基酸。

GST接头：如本文所使用的，术语“GST接头”是指包括甘氨酸残基、丝氨酸残基和苏氨酸氨基酸残基、优选地由其组成的接头。根据本发明的GST接头包括至少一个甘氨酸残基、至少一个丝氨酸残基和至少一个苏氨酸残基。通常且优选地，根据本发明的GST接头的长度为至多50个氨基酸，并且通常且进一步优选地，根据本发明的GST接头的长度为至多30个氨基酸。

GSED接头：如本文所使用的，术语“GSED接头”是指包括甘氨酸残基、丝氨酸残基、谷氨酸残基和天冬氨酸氨基酸残基、优选地由其组成的接头。根据本发明的GSED接头包括至少一个甘氨酸残基、至少一个丝氨酸残基、至少一个谷氨酸残基和至少一个天冬氨酸残基。通常且优选地，根据本发明的GSED接头的长度为至多50个氨基酸，并且通常且进一步优选地，根据本发明的GSED接头的长度为至多30个氨基酸。

免疫刺激性物质：如本文所使用的，术语“免疫刺激性物质”是指能够诱导和/或增强免疫应答的物质。如本文所使用的，免疫刺激性物质包含但不限于toll样受体活化物质和诱导细胞因子分泌的物质。Toll样受体活化物质包含但不限于免疫刺激性核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白和免疫刺激性有机物质，如紫杉醇。

免疫刺激性核酸(ISS-NA)：如本文所使用的，术语免疫刺激性核酸是指能够诱导和/或增强免疫应答的核酸。免疫刺激性核酸包括核糖核酸，并且尤其是脱氧核糖核酸，其中核糖核酸和脱氧核糖核酸两者均可以为双链或单链。优选的ISS-NA是脱氧核糖核酸，其中进一步优选地，所述脱氧核糖核酸是单链的。优选地，免疫刺激性核酸含有至少一个包括未甲基化的C的CpG基序。非常优选的免疫刺激性核酸包括至少一个CpG基序，其中所述至少一个CpG基序包括至少一个CG二核苷酸或优选地由其组成，其中C是未甲基化的。优选地但非必须地，所述CG二核苷酸是回文序列的一部分。术语免疫刺激性核酸还指含有经修饰的碱基，优选地4-溴胞嘧啶的核酸。在本发明的上下文中特别优选的是能够刺激树突细胞中IFN-α产生的ISS-NA。可用于本发明目的的免疫刺激性核酸描述于例如WO2007/068747A1中。

寡核苷酸：如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指包括2个或更多个核苷酸，优选地约6个到约200个核苷酸，并且更优选地20个到约100个核苷酸，并且最优选地20个到40个核苷酸的核酸序列。非常优选地寡核苷酸包括约30个核苷酸，更优选地寡核苷酸包括正好30个核苷酸，并且最优选地寡核苷酸由正好30个核苷酸组成。寡核苷酸是多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，并且优选地选自(a)未经修饰的RNA或DNA，和(b)经修饰的RNA或DNA。修饰可以包括主链或核苷酸类似物。优选地，寡核苷酸选自由以下组成的组：(a)单链和双链DNA、(b)作为单链区和双链区的混合物的DNA、(c)单链和双链RNA、(d)作为单链区和双链区的混合物的RNA和(e)包括作为单链或更优选地双链DNA和RNA或单链区和双链区的混合物的杂交分子。优选的核苷酸修饰/类似物选自由以下组成的组：(a)肽核酸；(b)肌苷；(c)三苯甲基化碱基；(d)硫代磷酸酯；(e)硫代磷酸烷基酯；(f)5-硝基吲哚脱氧核糖基呋喃糖基；(g)5-甲基脱氧胞嘧啶；和(h)5,6-二氢-5,6-二羟基脱氧胸苷。硫代磷酸酯化的核苷酸在细胞或生物体中被保护免受降解，并且因此是优选的核苷酸修饰。仅由磷酸二酯结合的核苷酸组成的未经修饰的寡核苷酸通常比经修饰的核苷酸更具活性，并且因此在本发明的上下文中通常是优选的。最优选的是仅由磷酸二酯结合的脱氧核苷酸组成的寡核苷酸，其中进一步优选地，所述寡核苷酸是单链的。进一步优选的是能够刺激细胞(优选地，树突细胞)中的IFN-α产生的寡核苷酸。能够刺激细胞中IFN-α产生的非常优选的寡核苷酸选自A型CpG和C型CpG。进一步优选的是没有cap的RNA分子。

CpG基序：如本文所使用的，术语“CpG基序”是指核苷酸的模式，其包含未甲基化的中心CpG，即，未甲基化的CpG二核苷酸，其中C为未甲基化的，被至少一个碱基，优选地一个或两个核苷酸包围，侧接中心CpG(位于3'和5'一侧)。通常且优选地，如本文所使用的CpG基序包括未甲基化的CpG二核苷酸和在其5'和3'端的两个核苷酸或可替代地由其组成。不受理论的束缚，侧接CpG的碱基赋予CpG寡核苷酸很大一部分活性。

未甲基化的含CpG的寡核苷酸：如本文所使用的，术语“未甲基化的含CpG的寡核苷酸”或“CpG”是指含有至少一个CpG基序的寡核苷酸，优选地寡脱氧核苷酸。因此，CpG含有至少一个未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸。优选的CpG刺激/活化例如对脊椎动物骨髓源性细胞具有促有丝分裂作用，或诱导或增加其细胞因子的表达。例如，CpG可以用于活化B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞，如树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。优选地，CpG涉及寡脱氧核苷酸，优选地涉及单链寡脱氧核苷酸，其含有未甲基化的胞嘧啶，3'随后是鸟苷，其中所述未甲基化的胞嘧啶和所述鸟苷通过磷酸酯键连接，其中优选地所述磷酸酯结合是磷酸二酯结合或硫代磷酸酯结合，并且其中进一步优选地，所述磷酸酯键是磷酸二酯结合。CpG可以包含核苷酸类似物，如含有硫代磷酸酯键的类似物，并且可以是双链或单链的。通常，双链分子在体内更稳定，而单链分子则具有更高的免疫活性。优选地，如本文所使用的，CpG是长度为至少约十个核苷酸并且包括至少一个CpG基序的寡核苷酸，其中进一步优选地所述CpG的长度为10个到60个，更优选地15个到50个，仍更优选地20个到40个，仍更优选地约30个，并且最优选地正好30个核苷酸。CpG可以由甲基化和/或未甲基化的核苷酸组成，其中所述至少一个CpG基序包括至少一个CG二核苷酸，其中C是未甲基化的。CpG还可以包括甲基化和未甲基化的序列段，其中所述至少一个CpG基序包括至少一个CG二核苷酸，其中C是未甲基化的。非常优选地，CpG涉及单链寡脱氧核苷酸，其含有未甲基化的胞嘧啶，3'随后是鸟苷，其中所述未甲基化的胞嘧啶和所述鸟苷通过磷酸二酯结合连接。CpG可以包含核苷酸类似物，如含有硫代磷酸酯键的类似物，并且可以是双链或单链的。通常，如下文所指示的，磷酸二酯CpG是A型CpG，而磷酸硫酯稳定的CpG是B型CpG。在本发明的上下文中，优选的CpG寡核苷酸是A型CpG。

A型CpG：如本文所使用的，术语“A型CpG”或“D型CpG”是指包括至少一个CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)。A型CpG优先地刺激T细胞的活化和树突细胞的成熟，并能够刺激IFN-α的产生。在A型CpG中，至少一个CpG基序的核苷酸通过至少一个磷酸二酯键连接。A型CpG包括至少一个磷酸二酯键CpG基序，其可以在其5'端和/或优选地以及在其3'端侧接有硫代磷酸酯结合的核苷酸。优选地，CpG基序，并且特此优选地，CG二核苷酸及其包括至少一个、优选地两个核苷酸的直接侧接区域由磷酸二酯核苷酸构成。优选的A型CpG仅由磷酸二酯(PO)键核苷酸组成。通常且优选地，聚G基序包括至少一个、优选地至少三个、至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个Gs(鸟苷)、最优选地至少10个Gs或可替代地由其组成。优选地，本发明的A型CpG包括回文序列或可替代地由其组成。

包装的：如本文所使用的，术语“包装的”是指聚阴离子大分子或免疫刺激性物质分别相对于核心颗粒和VLP的状态。如本文所使用的，术语“包装的”包含可以是共价的结合，例如，通过化学偶联，或者是非共价的结合，例如，离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。术语还包含聚阴离子大分子的封闭物或部分封闭物。因此，聚阴离子大分子或免疫刺激性物质可以被VLP封闭，而没有实际的结合，特别是共价结合。在优选的实施例中，至少一种聚阴离子大分子或免疫刺激性物质最优选地以非共价方式包装在VLP内部。如果所述免疫刺激性物质是核酸，优选地是DNA，则术语“包装的”是指所述核酸不可用于核酸酶水解，优选地不可用于DNAse水解(例如，DNaseI或核酸酶)，其中优选地所述可及性是如WO2003/024481A2的实例11-17所描述的。

有效量：如本文所使用的，术语“有效量”是指实现期望的生物学作用所必需或足够的量。组合物或可替代地药物组合物的有效量将是达到此选择结果的量，并且此类量可以由本领域技术人员常规确定。优选地，如本文所使用的，术语“有效量”是指必需或有效地将所述至少一种花生过敏原的水平降低到使得由花生过敏引起的至少一种症状减轻的水平的量。优选地，如本文所使用的，术语“有效量”是指必需或有效地中和至少一种花生过敏原的活性的量。有效量可以根据所施用的特定组合物和受试者的体型而变化。本领域普通技术人员可以凭经验确定本发明的特定组合物的有效量，而不必进行过度的实验。

治疗：如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗的(treated)”或“治疗(treating)”是指预防和/或治疗。在一个实施例中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗的(treated)”或“治疗(treating)”是指治疗性治疗。在另一个实施例中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗的(treated)”或“治疗(treating)”是指预防性治疗。

在第一方面中，本发明提供了一种黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其包括至少一种融合蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，其中所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；以及(iii)T辅助细胞表位，其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，并且其中优选地所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12。在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽进一步包括第一氨基酸接头，优选地第一氨基酸接头和第二氨基酸接头，其中所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的N端处或C端处，并且其中所述第一氨基酸接头选自由以下组成的组：(a)长度为n＝2-10的聚甘氨酸接头(Gly)

已经发现优选的氨基酸接头，即GS接头或GSED接头有益于克服阻碍形成本发明的经修饰的VLP的组装过程的球形无序和/或克服本发明形成的经修饰的VLP之间的聚集趋势和/或增加甚至很长抗原多肽的插入的灵活性。在以下情况尤其如此，如果所述GS接头或GSED接头进一步用作第一氨基酸接头和第二氨基酸接头，并且再进一步地，如果所述第一氨基酸接头和所述第二氨基酸接头模拟没有所述插入的抗原多肽时存在的氨基酸序列情况，这对于本发明优选的CMV多肽特别有益。因此，已经发现模仿没有所述插入的抗原多肽存在的氨基酸序列情况对于抗原多肽的插入是特别有益的，所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；尤其是处于与SEQ ID NO:5的Ser(88)与Tyr(89)对应的位置之间。已发现在GS之后(即，分别在SEQ IDNO:62的位置84和SEQ ID NO:5的位置88之后)和YY之前(即，分别在SEQ ID NO:62的位置85和SEQ ID NO:5的位置89之前)通过优选地使用GS接头或GSED接头，并且特别是通过使用定位在抗原多肽的C端处并为以GS结束的GS接头或GSED接头的第二氨基酸接头的抗原多肽的插入特别有益。

在另外的方面中，本发明提供了一种CMV的经修饰的VLP，其包括至少一种融合蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，其中所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ IDNO:62；或与所述外壳蛋白，优选地与所述SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；以及(iii)第一氨基酸接头，优选地第一氨基酸接头和第二氨基酸接头，其中所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的N端处或C端处，并且其中优选地所述第一氨基酸接头选自由以下组成的组：(a)长度为n＝2-10的聚甘氨酸接头(Gly)

在另一方面中，本发明提供了一种黄瓜花叶病毒(CMV)的花叶修饰的病毒样颗粒(VLP)。在第一方面中，本发明提供了一种黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其包括以下：(a)至少一种融合蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，其中所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；以及(b)至少一种CMV蛋白，其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述CMV蛋白任选地通过T辅助细胞表位修饰，其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV蛋白的N端区域，并且其中优选地所述CMV蛋白的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12；其中优选地所述CMV蛋白包括SEQ ID NO:5，优选地由其组成。在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽进一步包括T辅助细胞表位，其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，并且其中优选地所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽进一步包括第一氨基酸接头，优选地第一氨基酸接头和第二氨基酸接头，其中所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的N端处或C端处，并且其中所述第一氨基酸接头选自由以下组成的组：(a)长度为n＝2-10的聚甘氨酸接头(Gly)

对于本发明的所有方面，所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ IDNO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间，所述插入与处于SEQ IDNO:62的位置84的所述丝氨酸(S)残基与SEQ ID NO:62的位置85的所述酪氨酸(Y)残基之间的插入对应。

本文中所描述和公开的实施例、优选实施例和非常优选的实施例应适用于所有方面以及其它实施例、优选实施例和非常优选的实施例，无论是否再次具体提及或为了简明起见避免重复。

在优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白的氨基酸序列或突变的氨基酸序列，优选地由其组成，其中要突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中CMV的所述突变氨基酸序列和所述外壳蛋白显示出至少90％、优选地至少95％、进一步优选地至少98％以及再更优选地至少99％的序列同一性；其中优选地所述突变氨基酸序列和所述要突变的氨基酸序列在至少一个和至多11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个氨基酸残基上不同，并且其中进一步优选地这些差异选自(i)插入、(ii)缺失、(iii)氨基酸交换以及(iv)(i)到(iii)的任何组合。

在优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少75％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少75％的序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。在优选实施例中，所述CMV多肽是CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地85％的序列同一性的氨基酸序列。在优选实施例中，所述CMV多肽是CMV的外壳蛋白或与SEQ IDNO:62具有至少90％、优选地95％的序列同一性的氨基酸序列。在优选实施例中，所述CMV多肽是CMV的具有SEQ ID NO:62的外壳蛋白。在优选实施例中，CMV的所述外壳蛋白包括SEQID NO:62。在优选实施例中，CMV的所述外壳蛋白由SEQ ID NO:62组成。在优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白。在优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白组成。在优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白，其中CMV的所述外壳蛋白包括SEQ ID NO:62。在优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白，其中CMV的所述外壳蛋白由SEQ IDNO:62组成。在优选实施例中，所述CMV多肽由CMV的外壳蛋白组成，其中CMV的所述外壳蛋白由SEQ ID NO:62组成。

在优选实施例中，所述CMV多肽包括SEQ ID NO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:63具有至少75％的序列同一性。在优选实施例中，所述CMV多肽包括SEQ ID NO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:63具有至少80％的序列同一性。在优选实施例中，所述CMV多肽包括SEQ ID NO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:63具有至少85％的序列同一性。在优选实施例中，所述CMV多肽包括SEQ ID NO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ IDNO:63具有至少90％的序列同一性。在优选实施例中，所述CMV多肽包括SEQ ID NO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:63具有至少95％的序列同一性。在优选实施例中，所述CMV多肽包括SEQ ID NO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:63具有至少98％的序列同一性。在优选实施例中，所述CMV多肽包括SEQ IDNO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:63具有至少99％的序列同一性。

在优选实施例中，所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；或者(ii)与SEQID NO:62具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中如(i)或(ii)中定义的所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:63具有至少90％的序列同一性。在优选实施例中，所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；或者(ii)与SEQ ID NO:62具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中如(i)或(ii)中定义的所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:63或氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:63具有至少95％的序列同一性。在优选实施例中，所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；或者(ii)与SEQ ID NO:62具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中如(i)或(ii)中定义的所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:63。

在优选实施例中，经替代的所述N端区域的氨基酸数量等于或小于所述T辅助细胞表位组成的氨基酸数量。在优选实施例中，所述CMV多肽的所述经替代的N端区域由5到15个连续氨基酸组成。在优选实施例中，所述CMV多肽的所述经替代的N端区域由9到14个连续氨基酸组成。在优选实施例中，所述CMV多肽的所述经替代的N端区域由11到13个连续氨基酸组成。在优选实施例中，所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12。在优选实施例中，所述T辅助细胞表位是通用的T辅助细胞表位。在优选实施例中，所述T辅助细胞表位由至多20个氨基酸组成。

在本发明的优选实施例中，Th细胞表位选自HA 307-319(SEQ ID NO:67)、HBVnc50-69(SEQ ID NO:68)、TT 830-843(SEQ ID NO:64)、CS 378-398(SEQ ID NO:69)、MT17-31(SEQ ID NO:70)、TT 947-967(SEQ ID NO:71)和PADRE(SEQ ID NO:65)。在非常优选的实施例中，所述Th细胞表位是衍生自破伤风毒素的Th细胞表位或PADRE序列。在优选实施例中，所述T辅助细胞表位衍生自人疫苗。在非常优选的实施例中，所述Th细胞表位是衍生自破伤风毒素的Th细胞表位。在优选实施例中，所述Th细胞表位是PADRE序列。在非常优选的实施例中，所述Th细胞表位包括SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在非常优选的实施例中，所述Th细胞表位由SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成。在非常优选的实施例中，所述Th细胞表位包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在优选实施例中，所述Th细胞表位由SEQ ID NO:64的氨基酸序列组成。在非常优选的实施例中，所述Th细胞表位包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在非常优选的实施例中，所述Th细胞表位由SEQ IDNO:65的氨基酸序列组成。

在优选实施例中，所述CMV多肽包括CMV的外壳蛋白的氨基酸序列或优选地由其组成，其中所述氨基酸序列包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62或与SEQ ID NO:62具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述氨基序列包括SEQ ID NO:63，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述经取代的N端区域由11到13个连续氨基酸组成，优选地11个连续氨基酸，并且其中进一步优选地所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12。

在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽包括SEQ ID NO:66的氨基酸序列。

在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:66的氨基酸序列，其中所述抗原多肽插入到SEQ ID NO:5的所述嵌合CMV多肽中以处于SEQ ID NO:5的位置88与位置89的氨基酸残基之间，或者其中所述抗原多肽插入到SEQ ID NO:66的所述嵌合CMV多肽中以处于SEQ ID NO:66的位置86与位置87的氨基酸残基之间。

在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽包括SEQ ID NO:66的氨基酸序列，其中所述抗原多肽插入到SEQ ID NO:66的所述嵌合CMV多肽中以处于SEQ ID NO:66的位置86与位置87的氨基酸残基之间。

在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列，其中所述抗原多肽插入到SEQ ID NO:5的所述嵌合CMV多肽中以处于SEQ ID NO:5的位置88与位置89的氨基酸残基之间。

在优选实施例中，所述嵌合CMV多肽进一步包括第一氨基酸接头，其中所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的N端处或C端处，并且其中所述第一氨基酸接头选自由以下组成的组：(a)长度为n＝2-10的聚甘氨酸接头(Gly)

在优选实施例中，所述第一氨基酸接头的长度为至多30个氨基酸。在优选实施例中，所述第一氨基酸接头的长度为至多20个氨基酸。在优选实施例中，所述第一氨基酸接头的长度为至多15个氨基酸。在优选实施例中，所述第二氨基酸接头的长度为至多30个氨基酸。在优选实施例中，所述第二氨基酸接头的长度为至多20个氨基酸。在优选实施例中，所述第二氨基酸接头的长度为至多15个氨基酸。在优选实施例中，所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的N端处。在优选实施例中，所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的C端处。在优选实施例中，所述嵌合CMV多肽进一步包括第二氨基酸接头。在优选实施例中，所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的N端处。在优选实施例中，所述第二氨基酸接头定位在所述抗原多肽的C端处。在优选实施例中，所述嵌合CMV多肽包括第一氨基酸接头和第二氨基酸接头。在优选实施例中，所述第一氨基酸接头定位在所述抗原多肽的N端处，并且所述第二氨基酸接头定位在所述抗原多肽的C端处。在优选实施例中，所述第一氨基酸接头选自由以下组成的组：(a)长度为n＝2-10的聚甘氨酸接头(Gly)

在优选实施例中，所述第二氨基酸接头选自由以下组成的组：(a)长度为n＝2-10的聚甘氨酸接头(Gly)

在优选实施例中，所述第二氨基酸接头是包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少Thr的氨基酸接头(GST接头)，在另外的优选实施例中，所述第二氨基酸接头是包括至少一个Gly、至少一个Ser、至少一个谷氨酸和至少天冬氨酸的氨基酸接头(GSED接头)，在优选实施例中，所述第二氨基酸接头是包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少Thr的氨基酸接头(GST接头)，并且所述第二氨基酸接头在其N端处具有Gly-Ser。在另外的优选实施例中，所述第二氨基酸接头是包括至少一个Gly、至少一个Ser、至少一个谷氨酸和至少天冬氨酸的氨基酸接头(GSED接头)，并且所述第二氨基酸接头在其N端处具有Gly-Ser。在优选实施例中，所述第二氨基酸接头是包括至少一个甘氨酸和至少一个丝氨酸的(GS接头)、包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少Thr的氨基酸接头(GST接头)或包括至少一个Gly、至少一个Ser、至少一个谷氨酸和至少天冬氨酸的氨基酸接头(GSED接头)并且所述第二氨基酸接头在其N端处具有Gly-Ser。在另外的优选实施例中，所述第二氨基酸接头是GSED接头，其中所述GSED接头的氨基酸序列为(DED)

在优选实施例中，所述第一氨基酸接头和所述第二氨基酸接头独立地选自由以下组成的组：(a)长度为n＝2-10的聚甘氨酸接头(Gly)

在优选实施例中，所述第一氨基酸接头和所述第二氨基酸接头独立地是包括至少一个Gly、至少一个Ser、至少一个谷氨酸和至少天冬氨酸的GSED接头(GSED接头)，并且所述第二氨基酸接头在其N端处具有Gly-Ser。在另外的优选实施例中，所述第一氨基酸接头和所述第二氨基酸接头独立地是GSED接头，其中所述GSED接头独立地具有氨基酸序列(DED)

在另外的优选实施例中，所述第一氨基酸接头和所述第二氨基酸接头独立地是GSED接头，其中所述GSED接头独立地具有氨基酸序列(DED)

在另外的优选实施例中，所述第一氨基酸接头和所述第二氨基酸接头独立地是GSED接头，并且所述GS接头的氨基酸序列选自SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127。

在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中以处于SEQ ID NO:5的所述CMV多肽的氨基酸残基88(Ser)与氨基酸残基89(Thr)之间。

在非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中以处于SEQ ID NO:5的所述CMV多肽的氨基酸残基88(Ser)与氨基酸残基89(Thr)之间，并且所述嵌合CMV多肽进一步包括第一氨基酸接头和第二氨基酸接头，其中所述第一氨基酸接头和所述第二氨基酸接头独立地是包括至少一个甘氨酸和至少一个丝氨酸的甘氨酸-丝氨酸接头(GS接头)，并且其中所述第二氨基酸接头在其N端处具有Gly-Ser序列。

在一方面中和优选实施例中，本发明提供了花叶病毒样颗粒。因此，在优选实施例中，CMV的所述经修饰的VLP进一步包括至少一种CMV蛋白，其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或优选地由其组成，其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、再进一步优选地至少90％、再更优选地至少95％、仍进一步优选地至少98％以及仍再进一步更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在优选实施例中，CMV的所述经修饰的VLP进一步包括至少一种CMV蛋白，其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少75％、优选地至少85％的序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述CMV蛋白任选地通过T辅助细胞表位修饰，并且其中优选地CMV的所述外壳蛋白包括SEQ ID NO:62。

在优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少75％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白或与SEQ ID NO:62具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白。在优选实施例中，所述CMV蛋白由CMV的外壳蛋白组成。在优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白，其中CMV的所述外壳蛋白包括SEQ ID NO:62。在优选实施例中，所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白，其中CMV的所述外壳蛋白由SEQ ID NO:62组成。在优选实施例中，所述CMV蛋白由CMV的外壳蛋白组成，其中CMV的所述外壳蛋白由SEQ ID NO:62组成。在另一个优选实施例中，所述CMV蛋白通过T辅助细胞表位修饰，其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV蛋白的N端区域，在另一个优选实施例中，所述CMV蛋白的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12。在非常优选的实施例中，所述CMV蛋白包括SEQ ID NO:5。在非常优选的实施例中，所述CMV蛋白由SEQ ID NO:5组成。

在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少3个氨基酸。在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少3个氨基酸并且至多225个氨基酸。在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少3个氨基酸并且至多200个氨基酸。在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少40个氨基酸。在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少40个氨基酸并且至多225个氨基酸，优选地至多200个氨基酸。在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少50个氨基酸。在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少50个氨基酸并且至多200个氨基酸。在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少70个氨基酸。在优选实施例中，所述抗原多肽的长度为至少70个氨基酸并且至多200个氨基酸。

在优选实施例中，所述抗原多肽是衍生自由以下组成的组的多肽：(a)过敏原；(b)病毒；(b)细菌；(c)寄生虫；(d)肿瘤；(e)自体分子；(h)激素；(i)细胞因子；(k)趋化因子；(l)生物活性肽。

在另一个优选实施例中，所述抗原多肽是过敏原、自体抗原、肿瘤抗原或病原体的多肽。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是过敏原，其中优选地所述过敏原衍生自由以下组成的组：(a)花粉提取物；(b)灰尘提取物；(c)尘螨提取物；(d)真菌提取物；(e)哺乳动物表皮提取物；(f)羽毛提取物；(g)昆虫提取物；(h)食物提取物；(i)毛发提取物；(j)唾液提取物；以及(k)血清提取物。在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是过敏原，其中所述过敏原选自由以下组成的组：(a)树木；(b)草；(c)屋尘；(d)屋尘螨；(e)曲霉菌；(f)动物毛发；(g)动物羽毛；(h)蜂毒；(i)动物产物；(j)植物产物；(k)动物皮屑；(l)花生过敏原。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是衍生自过敏原的重组多肽，所述过敏原选自由以下组成的组：(a)蜂毒磷脂酶A2；(b)豚草花粉Amb a 1；(c)桦木花粉Bet v I；(d)白面大黄蜂毒液5DoI m V；(e)屋尘螨Der p 1；(f)屋尘螨Der f 2；(g)屋尘螨Der p 2；(h)尘螨Lep d；(i)真菌过敏原Alt a 1；(j)真菌过敏原Asp f 1；(k)真菌过敏原Asp f 16；(l)花生过敏原；(m)猫过敏原d1；(n)犬过敏原Can f1、Can f2；(o)花生源性过敏原；或(p)日本柳杉(Japanese cedar)过敏原Cry J2。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是重组过敏原，其中所述过敏原选自由以下组成的组：(a)蜂毒磷脂酶A2；(b)豚草花粉Amb a 1；(c)桦木花粉Bet v I；(d)白面大黄蜂毒液5DoI m V；(e)屋尘螨Der p 1；(f)屋尘螨Der f 2；(g)屋尘螨Der p 2；(h)尘螨Lepd；(i)真菌过敏原Alt a 1；(j)真菌过敏原Asp f 1；(k)真菌过敏原Asp f 16；(l)花生过敏原；(m)猫过敏原d1；(n)犬过敏原Can f1、Can f2；(o)花生源性过敏原；或(p)日本柳杉(Japanese cedar)过敏原Cry J2。

在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是花生过敏原。优选地，所述抗原多肽是花生过敏原，其包括选自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在非常优选的实施例中，所述花生过敏原包括以下或优选地由以下组成：具有选自SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的蛋白质；或具有与SEQ ID NO:27、SEQID NO:72或SEQ ID NO:73具有至少90％、优选地至少92％、进一步优选地至少95％以及再进一步优选地至少98％的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在另外的非常优选的实施例中，所述花生过敏原包括以下或优选地由以下组成：具有选自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的蛋白质；或具有与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:72或SEQ IDNO:73具有至少90％、优选地至少92％、进一步优选地至少95％以及再进一步优选地至少98％的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在另外的非常优选的实施例中，所述花生过敏原包括具有选自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的蛋白质。在另外的非常优选的实施例中，所述花生过敏原由具有选自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的蛋白质组成。在另外的非常优选的实施例中，所述花生过敏原包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在另外的非常优选的实施例中，所述花生过敏原由SEQID NO:27的氨基酸序列组成。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ IDNO:27的氨基酸序列。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是花生过敏原；并且其中所述花生过敏原包括选自以下的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:27；(b)SEQ ID NO:72；(c)SEQ ID NO:73，并且其中优选地所述花生过敏原包括SEQ ID NO:27，优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是花生过敏原；并且其中所述花生过敏原包括SEQ ID NO:27或优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ IDNO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:29组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其用于治疗过敏的方法，优选地花生过敏反应。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白并且进一步包括至少一种CMV蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ IDNO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是花生过敏原；并且其中所述花生过敏原包括SEQ ID NO:27或优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成；并且其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白，优选地由其组成，优选地SEQ ID NO:62，并且其中所述CMV蛋白任选地通过T辅助细胞表位修饰，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV蛋白的N端区域，其中所述CMV蛋白的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:29组成，并且所述CMV蛋白由SEQ ID NO:5组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其用于治疗过敏的方法，优选地花生过敏反应。

在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是衍生自日本柳杉Cry J 2的过敏原。优选地，所述抗原多肽衍生自SEQ ID NO:74的日本柳杉Cry J 2。优选地，所述抗原多肽衍生自日本柳杉Cry J 2，并包括SEQ ID NO:74的氨基酸序列。

在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是衍生自豚草花粉Amb a1的过敏原。优选地，所述抗原多肽衍生自SEQ ID NO:75的豚草花粉Amb a 1。优选地，所述抗原多肽衍生自豚草花粉Amb a1，并包括SEQ ID NO:75的氨基酸序列。

在本发明的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是衍生自猫过敏原Fel d1的过敏原。家猫(家猫(Felis domesticus))是室内过敏原的重要来源(Lau,S.等人,(2000)《柳叶刀(Lancet)》356,1392-1397)。症状的严重程度从相对轻度的鼻炎和结膜炎到可能危及生命的哮喘发作。尽管患者有时会对猫皮屑和毛发中的若干种不同分子敏感，但主要的过敏原是Fel d1。在许多研究中都强调了此过敏原的重要性。实际上，超过80％的猫过敏患者对此强效的过敏原表现出IgE抗体(van Ree,R.等人,(1999)《过敏和临床免疫学杂志(J.Allergy Clin Immunol)》104,1223-1230)。Fel d1是一种35-39kDa的酸性糖蛋白，含有10-20％的N-连接的碳水化合物，并且存在于猫的毛发、唾液和泪腺中。其是由两个非共价连接的异源二聚体形成的。每个异源二聚体由分别由不同的基因编码的一个70个残基肽(称为“链1”)和一个78、85、90或92个残基肽(称为“链2”)组成(参见Duffort,O.A.等人,(1991)《分子免疫学(Mol Immunol)》28,301-309；Morgenstern,J.P.等人,(1991)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》88,9690-9694和Griffith,I.J.等人,(1992)《基因(Gene)》113,263-268)。已经描述了Fel d1的若干种重组构建体(Vailes LD等人,《过敏与临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol)》(2002)110:757-762；

因此，在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是rFel d1。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是Fel d1蛋白，其中所述Fel d1蛋白是包括Fel d1的链1和Fel d1的链2的融合蛋白，其中Fel d1的所述链2直接通过一个肽键或通过间隔子通过其C端与Fel d1的所述链1的N端融合，其中所述间隔子由具有1到20个氨基酸残基的氨基酸序列组成，其中优选地所述间隔子由具有10到20个氨基酸残基的氨基酸序列组成。非常优选地，所述间隔子由15个氨基酸残基的氨基酸序列组成，并且进一步优选地所述间隔子具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是Fel d1蛋白，其中所述Fel d1蛋白是包括Fel d1的链1和Fel d1的链2的融合蛋白，其中Fel d1的所述链1直接通过一个肽键或通过间隔子通过其C端与Fel d1的所述链2的N端融合，其中所述间隔子由具有1到20个氨基酸残基的氨基酸序列组成，其中优选地所述间隔子由具有10到20个氨基酸残基的氨基酸序列组成。优选地，Fel d1的所述链1包括SEQ ID NO:76的序列或其同源序列，其中所述同源序列与SEQ ID NO:76的同一性大于90％、或者甚至更优选地大于95％。进一步优选地，Fel d1的所述链2包括SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79的序列或其同源序列，其中所述同源序列与SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79的同一性大于90％以及甚至更优选地大于95％。

在非常优选的实施例中，所述抗原多肽是包括选自以下的氨基酸序列的Fel d1蛋白：(a)SEQ ID NO:38；(b)SEQ ID NO:80；或(c)SEQ ID NO:81。在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:38，优选地由其组成。在非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:80，优选地由其组成。在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:81，优选地由其组成。

在另外的非常优选的实施例中，所述Fel d1蛋白包括选自(a)SEQ ID NO:38；(b)SEQ ID NO:80；(c)SEQ ID NO:81的氨基酸序列。

在另一个非常优选的实施例中，所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列，优选地由其组成。在另一个非常优选的实施例中，所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO:80的氨基酸序列，优选地由其组成。在另一个非常优选的实施例中，所述Fel d1蛋白包括SEQ IDNO:81的氨基酸序列，优选地由其组成。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Fel d1蛋白；并且其中所述Fel d1蛋白包括选自以下的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:38；(b)SEQ ID NO:80；(c)SEQ ID NO:81，并且其中优选地所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO:38，优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Fel d1蛋白；并且其中所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO:38或优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ IDNO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:39组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗过敏的方法中使用，优选地猫过敏。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白并且进一步包括至少一种CMV蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ IDNO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Fel d1蛋白；并且其中所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO:38或优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成；并且其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白，优选地由其组成，优选地SEQ ID NO:62，并且其中所述CMV蛋白任选地通过T辅助细胞表位修饰，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV蛋白的N端区域，其中所述CMV蛋白的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:39组成，并且所述CMV蛋白由SEQ ID NO:5组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗过敏的方法中使用，优选地猫过敏。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是肿瘤抗原，其中优选地所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：(a)乳腺癌细胞的多肽；(b)肾癌细胞的多肽；(c)前列腺癌细胞的多肽；(d)皮肤癌细胞的多肽；(e)脑癌细胞的多肽；以及(f)白血病细胞的多肽。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是选自由以下组成的组的肿瘤抗原：(a)Her2；(b)神经节苷脂GD2；(c)EGF-R；(d)癌胚抗原(CEA)；(e)CD52；(f)CD21；(g)人黑素瘤gp100；(h)人黑素瘤melanA/MART-1；(i)人黑素瘤melanA/MART-1类似物；(j)酪氨酸酶；(k)NA17-A nt；(l)MAGE3；(m)p53蛋白；以及(n)(a)到(m)的肿瘤抗原中的任何肿瘤抗原的抗原片段。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是选自由以下组成的组的多肽：(a)IgE；(b)IL-6；(c)核因子kB配体的受体活化剂(RANKL)；(d)血管内皮生长因子(VEGF)；(e)血管内皮生长因子受体(VEGF-R)；肝细胞生长因子(HGF)；(f)白介素-1α；(g)白介素-1β；(h)白介素-5；(i)白介素-8；(j)白介素-13；(k)白介素-15；(l)白介素-17(IL-17)；(m)IL-23；(n)饥饿素；(o)血管紧张素；(p)趋化因子(C-C基序)(CCL21)；(q)趋化因子(C-X基序)(CXCL12)；(r)基质细胞源性因子1(SDF-I)；(s)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；(t)单核细胞趋化蛋白1(MCP-I)；(u)内皮糖蛋白；(v)抵抗素；(w)促性腺激素释放激素(GnRH)；(x)生长激素释放(GHRH)；(y)促黄体激素释放激素(LHRH)；(z)促甲状腺激素释放激素(TRH)；(aa)巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)；(bb)葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)；(cc)嗜酸性粒细胞趋化因子；(dd)缓激肽；(ee)Des-Arg缓激肽；(ff)B淋巴细胞趋化蛋白(BLC)；(gg)巨噬细胞集落刺激因子M-CSF；(hh)肿瘤坏死因子α(TNFα)；(ii)淀粉样β肽(Aβ1-42)；(jj)淀粉样β肽(Aβ3-6)；(kk)人IgE；(ii)CCR5细胞外结构域；(mm)CXCR4细胞外结构域；(nn)胃泌素；(oo)CETP；(pp)C5a；(qq)表皮生长因子受体(EGF-R)；(rr)CGRP；(ss)α-突触核蛋白；(tt)降钙素基因相关肽(CGRP)；(uu)糊精；(vv)肌生长抑制素；(ww)白介素-4；(xx)胸腺基质淋巴细胞生成素；(yy)白介素-33；(zz)白介素-25；(aaa)白介素-13或(bbb)多肽(a)到(aaa)中任一项的片段；以及(ccc)多肽(a)到(aaa)中任一项的抗原突变体或片段。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是自体抗原，其中所述自体抗原是选自由以下组成的组的多肽：(a)IgE；(b)IL-6；(c)核因子kB配体的受体活化剂(RANKL)；(d)血管内皮生长因子(VEGF)；(e)血管内皮生长因子受体(VEGF-R)；肝细胞生长因子(HGF)；(f)白介素-1α；(g)白介素-1β；(h)白介素-5；(i)白介素-8；(j)白介素-13；(k)白介素-15；(l)白介素-17(IL-17)；(m)IL-23；(n)饥饿素；(o)血管紧张素；(p)趋化因子(C-C基序)(CCL21)；(q)趋化因子(C-X基序)(CXCL 12)；(r)基质细胞源性因子1(SDF-I)；(s)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；(t)单核细胞趋化蛋白1(MCP-I)；(u)内皮糖蛋白；(v)抵抗素；(w)促性腺激素释放激素(GnRH)；(x)生长激素释放(GHRH)；(y)促黄体激素释放激素(LHRH)；(z)促甲状腺激素释放激素(TRH)；(aa)巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)；(bb)葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)；(cc)嗜酸性粒细胞趋化因子；(dd)缓激肽；(ee)Des-Arg缓激肽；(ff)B淋巴细胞趋化蛋白(BLC)；(gg)巨噬细胞集落刺激因子M-CSF；(hh)肿瘤坏死因子α(TNFα)；(ii)淀粉样β肽(Aβ1-42)；(jj)淀粉样β肽(Aβ3-6)；(kk)人IgE；(ii)CCR5细胞外结构域；(mm)CXCR4细胞外结构域；(nn)胃泌素；(oo)CETP；(pp)C5a；(qq)表皮生长因子受体(EGF-R)；(rr)CGRP；(ss)α-突触核蛋白；(tt)降钙素基因相关肽(CGRP)；(uu)糊精；(vv)肌生长抑制素；(ww)白介素-4；(xx)胸腺基质淋巴细胞生成素；(yy)白介素-33；(zz)白介素-25；(aaa)白介素-13或(bbb)多肽(a)到(aaa)中任一项的片段；以及(ccc)多肽(a)到(aaa)中任一项的抗原突变体或片段。

在优选实施例中，所述抗原多肽是白介素17(IL-17)，优选地人IL-17。白介素17是T细胞源性细胞因子，其在多种细胞类型中诱导促炎性介质的释放。异常Th17应答和IL-17的过度表达与许多自身免疫性病症有关，包含类风湿性关节炎和多发性硬化症。已经证明阻断IL-17的分子(如IL-17特异性单克隆抗体)有效改善动物模型中的疾病。此外，最近已经提出了使用与重组IL-17缀合的病毒样颗粒来靶向IL-17的主动免疫(

在另一个优选实施例中，所述抗原多肽是IL-5，优选地人IL-5。在再一个另外的优选实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:83，或优选地由其组成。此外，本发明的经修饰的VLP在治疗动物或人的炎性疾病的方法中使用，优选地慢性炎性疾病。优选地，所述炎性疾病选自RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩氏病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)，并且其中进一步优选地所述抗原多肽包括SEQ ID NO:83或优选地由其组成。

在另一个优选实施例中，所述抗原多肽是犬IL-5。在再一个另外的优选实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:84，或与SEQ ID NO:84具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:84或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:84组成。

在另一个优选实施例中，所述抗原多肽是猫IL-5。在非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:125、SEQ ID:141或与SEQID NO:85、SEQ ID NO:125、SEQ ID:141的序列同一性为至少90％、优选地至少92％、进一步优选地至少95％以及再进一步优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:125或SEQ ID:141。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:125或SEQ ID:141组成。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQID NO:85或与SEQ ID NO:85的序列同一性为至少90％、优选地至少92％、进一步优选地至少95％以及再进一步优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:125或与SEQ IDNO:125的序列同一性为至少90％、优选地至少92％、进一步优选地至少95％以及再进一步优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:85或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:85组成。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:125。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:125组成。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽包括选自以下的氨基酸序列：(a)SEQ IDNO:85；(b)SEQ ID NO:125；(c)SEQ ID NO:141，并且其中优选地所述抗原多肽包括SEQ IDNO:125，优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽包括SEQ ID NO:125，优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:139组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:128组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:132组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其用于在治疗动物或人的炎性疾病的方法中使用，优选地慢性炎性疾病。优选地，所述炎性疾病选自RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩氏病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白并且进一步包括至少一种CMV蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ IDNO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽包括SEQ ID NO:125，优选地由其组成，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ IDNO:64，优选地由其组成；并且其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白，优选地由其组成，优选地SEQ ID NO:62，并且其中所述CMV蛋白任选地通过T辅助细胞表位修饰，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV蛋白的N端区域，其中所述CMV蛋白的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:128组成，并且所述CMV蛋白由SEQ ID NO:5组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ IDNO:132组成，并且所述CMV蛋白由SEQ ID NO:5组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其用于在治疗动物或人的炎性疾病的方法中使用，优选地慢性炎性疾病。优选地，所述炎性疾病选自RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩氏病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是IL-4，优选地人Il-4。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:86，或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:86组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是犬IL-4。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:87，或与SEQ IDNO:87具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:87或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:87组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是猫IL-4。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:88，或与SEQ IDNO:88具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:88或优选地由其组成。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:88或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:88组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是IL-13，优选地人IL-13。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:89，或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:89组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是犬IL-13。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:90，或与SEQ IDNO:90具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:90或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:90组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是猫IL-13。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:91，或与SEQ IDNO:91具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:91或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:91组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是马IL-13。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:92，或与SEQ IDNO:92具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:92或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:92组成。

在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是TNFα。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是IL-1α，优选地人IL-1α。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:93，或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:93组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是犬IL-1α。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:94，或与SEQ IDNO:94具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:94或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:94组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是猫IL-1α。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:95，或与SEQ IDNO:95具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:95或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:95组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是马IL-1α。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:96，或与SEQ IDNO:95具有至少90％、优选地至少96％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:96或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:96组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是IL-33，优选地人IL-33。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:97，或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:97组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是犬IL-33。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:98，或与SEQ IDNO:95具有至少90％、优选地至少98％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:98或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:98组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是猫IL-33。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:99，或与SEQ IDNO:95具有至少90％、优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:99或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:99组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是马IL-33。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:100，或与SEQ IDNO:90具有至少95％、优选地至少100％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:100或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:100组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是IL-25，优选地人IL-25。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:101，或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:101组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是犬IL-25。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:102，或与SEQ IDNO:90具有至少95％、优选地至少102％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:102或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:102组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是猫IL-25。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:103，或与SEQ IDNO:90具有至少95％、优选地至少103％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:103或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:103组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是马IL-25。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:104，或与SEQ IDNO:90具有至少95％、优选地至少104％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:104或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:104组成。

在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是IL-1β，优选地人IL-1β。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:105，或优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是犬IL-1β。在非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144或与SEQID NO:134、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144的序列同一性为至少90％、优选地至少92％、进一步优选地至少95％以及再进一步优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:143、SEQ IDNO:144。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144组成。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:134或与SEQ ID NO:134的序列同一性为至少90％、优选地至少92％、进一步优选地至少95％以及再进一步优选地至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:135或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:135组成。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽包括选自以下的氨基酸序列：(a)SEQ IDNO:134；(b)SEQ ID NO:143；(c)SEQ ID NO:144，并且其中优选地所述抗原多肽包括SEQ IDNO:134，优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽包括SEQ ID NO:134，优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:135组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其用于在治疗动物或人的炎性疾病的方法中使用，优选地慢性炎性疾病。优选地，所述炎性疾病选自RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩氏病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白并且进一步包括至少一种CMV蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ IDNO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽包括SEQ ID NO:134，优选地由其组成，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ IDNO:64，优选地由其组成；并且其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白，优选地由其组成，优选地SEQ ID NO:62，并且其中所述CMV蛋白任选地通过T辅助细胞表位修饰，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV蛋白的N端区域，其中所述CMV蛋白的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:135组成，并且所述CMV蛋白由SEQ ID NO:5组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗炎性疾病的方法中使用。

在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是猫IL-1β。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:145，或优选地由其组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是IL-31，优选地人IL-31。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:106，或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:106组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是犬IL-31。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:107，或与SEQ IDNO:107具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:107或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:107组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是猫IL-31。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:108，或与SEQ IDNO:108具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:108或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:108组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是马IL-31。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:109，或与SEQ IDNO:109具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:109或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:109组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是胸腺基质淋巴细胞生成素(TLSP)，优选地人胸腺基质淋巴细胞生成素(TLSP)。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:110，或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:110组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是犬TLSP。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:111，或与SEQ IDNO:111具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:111或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:111组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是猫TLSP。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:112，或与SEQ IDNO:112具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:112或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:112组成。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是马TLSP。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:113，或与SEQ IDNO:113具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:113或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ IDNO:113组成。

在再一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是IgE或包括在IgE中的肽或结构域。

在再一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是衍生自Aβ-1-42(SEQ ID NO:114)的N端的肽，特别是Aβ-1-42(SEQ ID NO:114)的长度为至多7个连续氨基酸的片段，优选地Aβ-1-42(SEQ ID NO:114)的长度为至多6个连续氨基酸的片段。

因此，在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽选自Aβ-1-6(SEQ ID NO:1)、Aβ-1-7(SEQ ID NO:2)、Aβ-3-6(SEQ ID NO:3)、Aβ-1-5(SEQ ID NO:4)、Aβ-2-6(SEQ ID NO:115)或Aβ-3-7(SEQ ID NO:116)。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是Aβ-1-6(SEQ ID NO:1)。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是Aβ-1-7(SEQ ID NO:2)。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是Aβ-3-6(SEQ ID NO:3)。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是Aβ-1-5(SEQ ID NO:4)。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是Aβ-2-6(SEQ ID NO:115)。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是Aβ-3-7(SEQ ID NO:116)。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Aβ-1-6(SEQ ID NO:1)；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗阿尔茨海默氏病的方法中使用。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Aβ-1-6(SEQ ID NO:1)；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:6组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗阿尔茨海默氏病的方法中使用。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Aβ-1-7(SEQ ID NO:2)；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗阿尔茨海默氏病的方法中使用。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Aβ-1-7(SEQ ID NO:2)；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:7组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗阿尔茨海默氏病的方法中使用。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Aβ-3-6(SEQ ID NO:3)；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗阿尔茨海默氏病的方法中使用。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Aβ-3-6(SEQ ID NO:3)；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:8组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗阿尔茨海默氏病的方法中使用。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Aβ-1-5(SEQ ID NO:4)；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗阿尔茨海默氏病的方法中使用。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是Aβ-1-5(SEQ ID NO:4)；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:9组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗阿尔茨海默氏病的方法中使用。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是α-突触核蛋白或衍生自α-突触核蛋白的肽，并且其中优选地所述肽由6到14个氨基酸组成，并且其中进一步优选地所述抗原多肽是衍生自α-突触核蛋白的肽，所述肽选自SEQ D NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:117。衍生自α-突触核蛋白的另外的优选的肽在WO 2011/020133中公开，所述文献通过引用并入本文。

α-突触核蛋白(α-Syn)是一种具有多种生理和病理功能的小蛋白，是在路易氏体中发现的主要蛋白质之一，这是路易氏体症(包含帕金森氏病(PD))的病理学标志。最近，在包含血液和脑脊髓液的体液中发现了α-Syn，并且可能由外周组织和中枢神经系统两者产生。在脑与外周组织之间交换α-Syn可能具有重要的病理生理和治疗意义(Gardai SJ等人,《公共科学图书馆综合》(2013)8(8):e71634)。帕金森氏病(PD)发病机理中涉及α-突触核蛋白(a-syn)的证据是压倒性的。然而，关于a-syn导致PD和其它共核蛋白病的病理的方式尚无明确共识。

α-突触核蛋白是路易体(LB)的主要组分，并且关于导致聚集的a-syn过度表达的描述很多。人类遗传数据表明，a-syn基因的错义突变和倍增会导致家族性PD。在基因倍增的情况下，推测a-syn蛋白水平升高导致病理的主要功能获得。虽然a-syn的水平升高可能导致聚集和毒性，但过去几年的研究也表明，a-syn升高可能干扰囊泡池的形成、定位和/或维持(Gardai SJ等人,《公共科学图书馆综合》(2013)8(8):e71634；以及其中引用的参考文献)。

因此，在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽选自序列中的任一个，所述序列选自SEQ D NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:117。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是SEQ D NO:49。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是SEQ D NO:50。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是SEQ D NO:51。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是SEQ D NO:117。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是SEQ ID NO:49，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是SEQ ID NO:49；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:52组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其用于在治疗疾病、病症或生理病状的方法中使用，其中所述疾病、病症或生理病状选自路易体病症，并且其中优选地所述疾病、病症或生理病状为帕金森氏病。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是SEQ ID NO:50；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是SEQ ID NO:50；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:53组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其用于在治疗疾病、病症或生理病状的方法中使用，其中所述疾病、病症或生理病状选自路易体病症，并且其中优选地所述疾病、病症或生理病状为帕金森氏病。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是SEQ ID NO:51；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽是SEQ ID NO:51；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:54组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其用于在治疗疾病、病症或生理病状的方法中使用，其中所述疾病、病症或生理病状选自路易体病症，并且其中优选地所述疾病、病症或生理病状为帕金森氏病。

在再另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是糊精。在非常优选的实施例中，所述抗原多肽是血管紧张素I或衍生自血管紧张素I的肽。在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是血管紧张素II或衍生自血管紧张素II的肽。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是GnRH。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽是嗜酸性粒细胞趋化因子。

在另一个非常优选的实施例中，所述抗原多肽是肌生长抑制素，优选地牛肌生长抑制素。在再一个另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:118，或与SEQ ID NO:118具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原多肽包括SEQ ID NO:118或优选地由其组成。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽由SEQ ID NO:118组成。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是寄生虫的多肽，其中优选地所述病原体选自由以下组成的组：(a)弓形虫属；(b)恶性疟原虫；(c)间日疟原虫；(d)卵形疟原虫；(e)三日疟原虫；(f)利什曼虫；(g)血吸虫和(h)线虫。优选地，所述抗原多肽衍生自恶性疟原虫或间日疟原虫(SEQ ID NO:119)。

在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽衍生自恶性疟原虫。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽衍生自包括SEQ ID NO:44或优选地由其组成的恶性疟原虫。

在非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：SEQ ID NO:62；或与SEQ IDNO:62具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成；(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽衍生自恶性疟原虫，并且其中优选地所述抗原多肽衍生自包括SEQ ID NO:44或优选地由其组成的恶性疟原虫，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括以下，优选地由以下组成：SEQID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列，再优选地SEQ ID NO:64。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白，所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ ID NO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽包括SEQ ID NO:44，或优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:46组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗疟疾的方法中使用。

在另外的非常优选的实施例中，黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)包括至少一种融合蛋白并且进一步包括至少一种CMV蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包括a)嵌合CMV多肽或优选地由其组成，其中所述嵌合CMV多肽包括以下或优选地由以下组成：(i)CMV多肽，(ii)抗原多肽和(iii)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括SEQ IDNO:62或优选地由其组成，(ii)抗原多肽，其中所述抗原多肽插入到所述CMV多肽中，其中所述抗原多肽的所述插入处于所述CMV多肽的与SEQ ID NO:62的位置84和位置85的氨基酸残基对应的氨基酸残基之间；并且其中所述抗原多肽包括SEQ ID NO:44，或优选地由其组成；并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV多肽的N端区域，其中所述CMV多肽的所述N端区域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ IDNO:64，优选地由其组成；并且其中所述CMV蛋白包括CMV的外壳蛋白，优选地由其组成，优选地SEQ ID NO:62，并且其中所述CMV蛋白任选地通过T辅助细胞表位修饰，并且其中所述T辅助细胞表位替代所述CMV蛋白的N端区域，其中所述CMV蛋白的所述N端区域对应于SEQ IDNO:62的氨基酸2-12，并且其中优选地所述T辅助细胞表位包括SEQ ID NO:64，优选地由其组成。在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:46组成，并且所述CMV蛋白由SEQ ID NO:5组成。在本文另外的非常优选的实施例和方面中，本发明提供了黄瓜花叶病毒(CMV)的所述经修饰的病毒样颗粒(VLP)，其在治疗疟疾的方法中使用。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是细菌的多肽，其中优选地所述细菌选自由以下组成的组：(a)衣原体；(b)链球菌；(c)肺炎球菌；(d)葡萄球菌；(e)沙门氏菌；(f)分枝杆菌；(g)梭菌；(h)弧菌；(i)耶尔森菌；(k)脑膜炎球菌(l)疏螺旋体。

在另外的优选实施例中，所述抗原多肽是病毒抗原，其中优选地所述病毒抗原是选自由以下组成的组的多肽：(a)HIV和其它逆转录病毒；(b)流感病毒，优选地甲型M2流感细胞外结构域或HA或HA球状结构域；(c)乙型肝炎病毒的多肽，优选地preSl；(d)丙型肝炎病毒；(e)HPV，优选地HPV16E7；(f)RSV；(g)SARS和其它冠状病毒；(h)登革热和其它黄病毒，如西尼罗河病毒和手足口病病毒；(i)基孔肯雅和其它甲病毒。(k)CMV和其它疱疹病毒；(l)轮状病毒。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽衍生自RSV。在另外的非常优选的实施例中，所述抗原多肽衍生自登革热病毒。

在优选实施例中，所述抗原多肽是甲型流感病毒M2蛋白的细胞外结构域或其抗原片段。在非常优选的实施例中，所述抗原多肽包括甲型流感病毒M2蛋白的细胞外结构域或优选地由其组成，其中优选地所述甲型流感病毒M2蛋白的细胞外结构域是SEQ ID NO:120。在另一个优选实施例中，所述抗原多肽是流感病毒的球状结构域。

在另外的非常优选的实施例中，所述嵌合CMV多肽选自由以下组成的组：SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54。

在另外的优选的实施例中，所述经修饰的VLP进一步包括至少一种免疫刺激性物质。在非常优选的实施例中，将所述免疫刺激性物质包装到本发明的经修饰的VLP中。在另一个优选实施例中，将免疫刺激性物质与本发明的经修饰的VLP混合。可用于本发明的免疫刺激性物质是本领域公知的，并且公开于，尤其是WO2003/024481A2中。

在本发明的另一个实施例中，所述免疫刺激性物质由非真核来源的DNA或RNA组成。在另外的优选实施例中，所述免疫刺激性物质选自由以下组成的组：(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；以及(h)(a)到(g)的至少一种物质的任何混合物。在另外的优选实施例中，所述免疫刺激性物质是免疫刺激性核酸，其中所述免疫刺激性核酸选自由以下组成的组：(a)核糖核酸；(b)脱氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；以及(d)(a)、(b)和/或(c)的任何混合物。在另外的优选实施例中，所述免疫刺激性核酸是核糖核酸，并且其中所述核糖核酸是细菌源性RNA。在另外的优选实施例中，所述免疫刺激性核酸是聚(IC)或其衍生物。在另外的优选实施例中，所述免疫刺激性核酸是脱氧核糖核酸，其中所述脱氧核糖核酸是未甲基化的含CpG的寡核苷酸。

在非常优选的实施例中，所述免疫刺激性物质是未甲基化的含CpG的寡核苷酸。在另外的优选实施例中，所述未甲基化的含CpG的寡核苷酸是A型CpG。在另外的优选实施例中，所述A型CpG包括回文序列。在另外的优选实施例中，所述回文序列在其5'端和在其3'端由鸟苷实体侧接。在另外的优选实施例中，所述回文序列在其5'端由至少3个和至多15个鸟苷实体侧接，并且其中所述回文序列在其3'端由至少3个和至多15个鸟嘌呤实体侧接。

在另一个优选的实施例中，所述免疫刺激性物质是未甲基化的含CpG的寡核苷酸，并且其中优选地所述未甲基化的含CpG的寡核苷酸包括回文序列，并且其中进一步优选地所述未甲基化的含CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分。

在另外的方面中，本发明提供了用作药物的本发明的经修饰的病毒样颗粒。

在另外的方面中，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包括本发明的经修饰的病毒样颗粒或可替代地由其组成。疫苗涵盖在内，其中所述经修饰的VLP单独地或以任何可能的组合包括本文公开的技术特征中的任何一种技术特征。在一个实施例中，疫苗进一步包括佐剂。在另外的实施例中，疫苗不含佐剂。在优选实施例中，所述疫苗包括有效量的本发明的组合物。

在另外的方面中，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包括：(a)本发明的经修饰的VLP或本发明的疫苗；和(b)药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。所述稀释剂包含无菌水溶液(例如，生理盐水)或非水溶液和悬浮液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射有机酯如油酸乙酯。载体或闭塞性敷料可以用于增加皮肤渗透性并增强抗原吸收。本发明的药物组合物可以是含有盐、缓冲剂、佐剂或对改善缀合物的功效所期望的其它物质的形式。适于制备药物组合物的材料的实例在许多来源中提供，包含《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(Osol,A编辑,马克出版公司(Mack Publishing Co.),(1990))。在一个实施例中，所述药物组合物包括有效量的本发明的疫苗。

本发明的另外的方面是一种免疫方法，所述方法包括向动物或人施用本发明的经修饰的VLP、本发明的疫苗或本发明的药物组合物。在优选的实施例中，所述方法包括向动物或人施用本发明的组合物、本发明的疫苗或本发明的药物组合物。

本发明的另外的方面是一种治疗或预防动物中的疾病、病症或生理病状的方法，所述方法包括向所述动物施用本发明的经修饰的VLP、本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中优选地所述动物可以是人。在另外的优选实施例中，将所述经修饰的VLP、所述疫苗或所述药物组合物皮下、静脉内、皮内、鼻内、口服、结节内或透皮施用于所述动物。

在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状选自由以下组成的组：过敏、癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、感染性疾病。

在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状选自由以下组成的组：RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩氏病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、甲型流感病毒感染、疟疾、RSV感染。

在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状是炎性疾病。在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状是选自RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩氏病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)的炎性疾病。

在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状是感染性疾病。在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状是选自A型流感病毒感染、疟疾、RSV感染的炎性疾病。在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状是疟疾。

在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状是阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状是阿尔茨海默氏病。在另外的非常优选的实施例中，所述疾病、病症或生理病状是帕金森氏病。

实例

实例1

将Aβ1-42片段克隆到产生CMV-Aβ-嵌合CMV多肽的黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的外壳蛋白中

已经制备了根据本发明的CMV-Aβ-嵌合CMV多肽，所述多肽包括Aβ蛋白片段Aβ1-6(SEQ ID NO:1)、Aβ1-7(SEQ ID NO:2)、Aβ3-6(SEQ ID NO:3)和Aβ1-5(SEQ ID NO:4)。

这些Aβ肽已插入在非常优选的经修饰的CMV外壳蛋白CMV-Ntt830(SEQ ID NO:5)的氨基酸残基Ser(88)与Tyr(89)之间，所述外壳蛋白包括衍生自破伤风类毒素的T辅助细胞表位。根据本发明的这些优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列如下：

“CMV-Ntt830-Ab16”的氨基酸序列：SEQ ID NO:6；

“CMV-Ntt830-Ab17”的氨基酸序列：SEQ ID NO:7；

“CMV-Ntt830-Ab36”的氨基酸序列：SEQ ID NO:8；

“CMV-Ntt830-Ab15”的氨基酸序列：SEQ ID NO:9。

这些优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列进一步包括在两个末端处侧接引入的Aβ肽的甘氨酸-丝氨酸接头。SEQ ID NO:6到SEQ ID NO:9的所有优选的融合蛋白包括直接位于引入的Aβ肽的N端处的GGGS接头(SEQ ID NO:10)以及位于引入的Aβ肽的C端处的GGGSGS接头(SEQ ID NO:11)。

所述优选的嵌合CMV多肽的对应的核苷酸序列如下：

“CMV-Ntt830-Ab16”的核酸序列：SEQ ID NO:12；

“CMV-Ntt830-Ab17”的核酸序列：SEQ ID NO:13；

“CMV-Ntt830-Ab36”的核酸序列：SEQ ID NO:14；

“CMV-Ntt830-Ab15”的核酸序列：SEQ ID NO:15。

为了在CMV-Ntt830的对应CMV DNA序列中引入这些Aβ肽或其它对DNA序列进行编码的抗原多肽，在对应位置处引入含BamHI位点的序列用于随后的克隆。CMV-Ntt830编码核酸序列如WO2016/062720A1的实例3中所描述的进行制备，并且对应于WO2016/062720A1的SEQ ID NO:14。

使用下文列出的寡核苷酸并以先前构建的pET-CMV-Ntt830作为模板，通过两步PCR诱变引入BamHI位点。模板pET-CMV-Ntt830如WO2016/062720A1的实例3中所描述的进行制备。

第1PCR：正向-pET-90引物(使pET28a+退火)(SEQ ID NO:16)

反向-RGSYrev(SEQ ID NO:17)

第2PCR正向-RGSYdir(SEQ ID NO:18)

反向-CMV-AgeR(SEQ ID NO:19)

在两种PCR产物都纯化之后，进行下一PCR以连接PCR片段(无引物的5个循环，然后用引物pET-90和CMV-AgeR进行25个循环)。

在基因扩增之后，将获得的PCR产物直接克隆到pTZ57R/T载体(InsTAclone PCR克隆试剂盒，富酶泰斯公司(Fermentas)编号K1214)中。大肠杆菌XL1-Blue细胞用作克隆和质粒扩增的宿主。

为避免RT-PCR错误，使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))对若干个含CMV-Ntt830基因的pTZ57质粒克隆进行了测序。在测序之后，用NcoI和AgeI酶切割出无序列错误的pTZ质粒克隆，所述质粒克隆含有具有引入的BamHI位点的CMV-Ntt830B基因。然后将片段亚克隆到pET-CMV-Ntt830的NcoI/AgeI位点上，得到辅助载体pET-CMV-Ntt830B。

为了引入对淀粉样蛋白-(β)肽进行编码的DNA，在PCR反应中使用了以下寡核苷酸(所有PCR中的模板均为pET-CMV-Ntt830)：

第1PCR：正向-C-Ab15(SEQ ID NO:20)

反向-CMcpR(SEQ ID NO:21)

第2PCR：正向-C-Ab16(SEQ ID NO:22)

反向-CMcpR(SEQ ID NO:21)

第3PCR：正向-C-Ab17(SEQ ID NO:23)

反向-CMcpR(SEQ ID NO:21)

第4PCR：正向-C-Ab36(SEQ ID NO:24)

反向-CMcpR(SEQ ID NO:21)

将所有PCR片段直接连接到pTZ57R/T载体中，并在大肠杆菌XL1细胞中转化之后分离出对应的含插入物的质粒克隆。使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(应用生物系统公司)对含PCR产物DNA的若干个质粒克隆进行测序。在测序之后，使用位点BamHI和HindIII，将含Ab片段的CMV 3'端片段连接到pET-CMV-Ntt830B辅助载体中。在BamHI/HindIII限制酶测试之后，选择了正确克隆。

进一步地，质粒克隆pET-CMV-Ntt830B-Ab15、pET-CMV-Ntt830B-Ab16、pET-CMV-Ntt830B-Ab17和pET-CMV-Ntt830B-Ab36用于转化大肠杆菌C2566细胞。pET-CMV-Ntt830B-Ab36的质粒图谱示例性地示出在图1中。

实例2

CMV-Aβ-嵌合CMV多肽的表达

产生CMV-AβVLP

对于CMV-AβVLP(即，CMV-Ntt830-Ab16 VLP、CMV-Ntt830-Ab17 VLP、CMV-Ntt830-Ab36 VLP或CMV-Ntt830-Ab15 VLP)的分离，用对应的质粒pET-CMV-Ntt830-Ab15、pET-CMV-Ntt830-Ab16、pET-CMV-Ntt830-Ab17和pET-CMV-Ntt830-Ab36转化大肠杆菌C2566(美国新英格兰生物实验室(New England Biolabs,USA))感受态细胞。

在选择具有最高靶蛋白表达水平的克隆之后，在30℃下在旋转振荡器上，将大肠杆菌培养物在含有卡那霉素(25mg/l)的2TY(胰蛋白1.6％、酵母提取物1％、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)培养基中生长直到OD(600)值为0.8-1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并向培养基中补充5mM MgCl

CMV-AβVLP的纯化包含以下步骤：

1)将3g生物质悬浮于20ml的50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、5mM EDTA、5mM巯基乙醇，pH 9.0中，用超声处理悬浮液(Hielscher超声仪UP200S，16分钟，振幅70％，循环0.5)；

2)将裂解物在+4℃下以11000rpm离心20分钟；

3)在35ml试管中，在含有50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、2mM EDTA、0.5％TX-100的缓冲液中制备蔗糖梯度(20-60％)；

4)在蔗糖梯度上覆盖5ml VLP样品；

5)使用贝克曼公司(Beckman)的SW32转子(25000rpm，+18℃)离心6小时。

6)将每个梯度管的内容物分成6ml级分。合并对应级分；

7)分析SDS-PAGE上的梯度级分(图2A、图2B、图2C、图2D)。

8)SDS-PAGE分析表明在第3蔗糖梯度级分中存在VLP。用24ml缓冲液(5mM硼酸钠、2mM EDTA，pH 9.0)稀释24ml第3级分；

9)使用70型转子(贝克曼公司Optima，L100XP超速离心机；4小时，以50000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

10)将沉淀物溶解于3ml 5mM硼酸钠、2mM EDTA，pH 9.0中；

11)将VLP悬浮液覆盖在20％蔗糖“垫”的顶部(在5mM硼酸钠、2mM EDTA，pH 9.0缓冲液中)；

12)使用转子TLA100.3(贝克曼公司；1小时，以72000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

13)将沉淀物溶解于2ml 5mM硼酸钠、2mM EDTA中，pH 9.0，过夜，4℃；

14)分析EM下的VLP(图3A、图3B、图3C、图3D)。

如图2A、图2B、图2C、图2D所示，四种CMV-AβVLP可以在大肠杆菌细胞中成功表达，并且获得的大部分可以存在于可溶性级分中。此外，如蔗糖梯度分析(图2A-2D)和电子显微镜分析(图3A-3D)所显示的，这些蛋白质以等距VLP的形式直接存在于大肠杆菌细胞提取物中。

实例3

具有阿杜卡尼单抗的可变区序列的单克隆抗体识别CMV-AβVLP

用Aβ

ELISA：

将ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp，纽约州罗切斯特(Rochester,NY))在4℃下用100μl Aβ

实例4

用CMV-AβVLP对小鼠进行免疫

用CMV-Ntt830-Ab16 VLP、CMV-Ntt830-Ab17 VLP或CMV-Ntt830-Ab36 VLP对每组四只雌性Balb/c小鼠进行免疫。将VLP在pH 7.4的150mM PBS和150μl中调配，并在第0天以30ug进行静脉内注射。在第0天(免疫前)和第14天将小鼠放血，并使用Aβ1-42包被的ELISA板分析血清。通过免疫组织化学在来自阿尔茨海默氏病患者的脑切片上进一步分析了由CMV-Ntt830-Ab36 VLP诱导的抗体。

ELISA：

在指示的时间分析小鼠血清中的抗体应答。为了确定Aβ1-42特异性抗体，将ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp，纽约州罗切斯特)在4℃下，pH 7.4的含100μl Aβ1-42(1μg/ml)的PBS中包被过夜。为避免非特异性结合，用含200μl 2％BSA的PBST将ELISA板封闭，并在室温下温育2小时。将血清样品在2％BSA/PBST中稀释。将预先稀释的血清转移到包被的板上，并进一步连续稀释以获得基于OD50计算的抗体效价。在室温下温育2小时之后，将ELISA板用200μl PBST洗涤5次。通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室有限公司)检测血清抗体的结合。将检测抗体在2％BSA/PBST中以1:1000稀释，并转移每个样品100μl的体积。将板在室温下温育1小时。如前所描述的洗涤ELISA板。在洗涤之前，准备底物溶液。为此，将1片剂(10mg)OPD(1,2-苯二胺二盐酸盐)和9μl 30％H

免疫组织化学：

用切片机制备阿尔茨海默氏病患者的石蜡包埋的脑(海马体)组织切片。将切片安装在载玻片上，并通过与3％H

实例5

CMV的包括Ara-h202的经修饰的外壳蛋白的克隆

为了根据本发明从单一质粒系统获得含抗原的花叶VLP，构建步骤是在第二T7启动子下将CMV-Ntt830基因插入pETDuet-1(诺瓦根公司(Novagen))的多接头中。本文，CMV-Ntt830核酸序列如WO2016/062720A1的实例3中所描述的进行制备，并且对应于WO2016/062720A1的SEQ ID NO:14。对于具有相应克隆限制性位点的CMV结构基因，使用以下寡核苷酸在PCR反应中扩增了所述CMV-Ntt830基因：

正向：CM-830NdeF(SEQ ID NO:25)

反向：CM-cpR(SEQ ID NO:26)

在基因扩增之后，将对应的PCR产物直接克隆到pTZ57R/T载体(InsTAclone PCR克隆试剂盒，富酶泰斯公司编号K1214)中。大肠杆菌XL1-Blue细胞用作克隆和质粒扩增的宿主。为避免RT-PCR错误，使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))对若干个含CMV-Ntt830基因的pTZ57质粒克隆进行了测序。在测序之后，用HindIII酶切割出无序列错误的含CMV-Ntt830基因的pTZ质粒克隆，用Klenow酶处理，并且最后用NdeI限制酶处理。然后将片段亚克隆到pETDuet-1的NdeI/EcoRV位点上，得到辅助载体pETDu-CMV-Ntt830。

为了在CMV-Ntt830核酸中插入Ara-h202蛋白编码DNA序列，引入了含BamHI位点的长度为15个和10个氨基酸的Gly-Ser接头编码序列，如在对应于CMV-Ntt830的SEQ ID NO:5的Ser(88)与Tyr(89)的位置之间产生所述插入。Ara-h202蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:27中描述，而对应的DNA序列在SEQ ID NO:28中描述。

根据本发明的此优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列被称为“CMV-Ntt830-Arah202”，其为SEQ ID NO:29。此优选的嵌合CMV多肽的此氨基酸序列包括在两个末端处侧接引入的Ara-h202蛋白的甘氨酸-丝氨酸接头，即直接位于引入的Ara-h202蛋白的N端处的长度为15个氨基酸的GS接头(SEQ ID NO:30)和位于引入的Ara-h202蛋白的C端处的长度为10个氨基酸长的GS接头(SEQ ID NO:31)。此优选的嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-Arah202的对应核苷酸序列在SEQ ID NO:32中描述。

首先，使用以下寡核苷酸在PCR反应中扩增CMV-Ntt830基因片段和Ara-h202编码序列(侧接BamHI，无“起始”和“终止”密码子)：

CMV基因5'端的第1PCR：

正向：830-NcoF(SEQ ID NO:33)

反向：C-5xg4s-R(SEQ ID NO:34)

模板：使用pET-CMV-Ntt830，其如WO2016/062720A1的实例3中所描述的进行制备

CMV基因3'端的第2PCR：

正向：C-5xg4s-F(SEQ ID NO:35)

反向：CMcpR(SEQ ID NO:21)

模板：使用pET-CMV-Ntt830，其如WO2016/062720A1的实例3中所描述的进行制备

Arah202的第3PCR：

正向：Ara-BamF2(SEQ ID NO:36)

反向：Ara-BamR2(SEQ ID NO:37)

模板：pUCIDT质粒中的基因合成的Ara-h202基因，如WO 2017/186808A1的实例13中所描述的进行制备。

将所有PCR片段直接连接到pTZ57R/T载体中，并在大肠杆菌XL1细胞中转化之后分离出对应的含插入物的质粒克隆。为避免PCR错误，使用BigDye循环测序试剂盒和ABIPrism 3100基因分析仪(应用生物系统公司)对含PCR产物DNA的若干个质粒克隆进行测序。在测序之后，在位点BamHI和HindIII中，将CMV 3'端的片段连接到pTZ57-CMV-5端载体中。因此，获得了辅助质粒pTZ-CMVB2，其含有GlySer接头和BamHI位点，用于进一步亚克隆Ara-h202编码序列。下一步，将部分BamHI处理后的Ara-h202片段再亚克隆到pTZ-CMVB2 BamHI位点。使用引物Ara-BamF2/CMcpR在“菌落PCR”反应中发现了含有正确方向的Ara-h202插入物的正确克隆。对具有阳性PCR信号的质粒克隆进行重新测序。pTZ-CMVB2-Ara-h202质粒克隆的测序结果证实了存在与CMV融合的Ara-h202基因。

为了构建表达载体，使用NcoI和HindIII酶从辅助质粒中切除CMVB2-Arah202插入物，并将其亚克隆到构建的辅助载体pETDu-CMV-Ntt830中。所得pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt的质粒图谱示出在图6中。

实例6

含有CMV的经修饰的外壳蛋白和融合的Ara-h202的花叶颗粒(CMV-M-Arah202)的表达

为了分离花叶CMV-Arah202 VLP，用质粒pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt转化大肠杆菌C2566(美国新英格兰生物实验室)感受态细胞。

在选择具有最高靶蛋白表达水平的克隆之后，在30℃下在旋转振荡器上，将大肠杆菌培养物在含有氨苄青霉素(100mg/l)的2TY(胰蛋白1.6％、酵母提取物1％、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)培养基中生长直到OD(600)值为0.8-1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并向培养基中补充5mM MgCl

根据本发明的包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP的纯化(所述花叶VLP被称为“CMV-M-Arah202”)包含以下步骤：

1)将6g生物质悬浮于20ml的50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、5mM EDTA、5mM巯基乙醇，pH 9.0中，用超声处理悬浮液(Hielscher超声仪UP200S，16分钟，振幅70％，循环0.5)；

2)将裂解物在+4℃下以11000rpm离心20分钟；

3)在35ml试管中，在含有50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、2mM EDTA、0.5％Tx-100的缓冲液中制备蔗糖梯度(20-60％)；

4)在蔗糖梯度上覆盖5ml VLP样品。准备4管；

5)使用贝克曼公司的SW32转子(25000rpm，+18℃)离心6小时。

6)将每个梯度管的内容物分成6ml级分。合并对应级分；

7)在SDS-PAGE和蛋白质印迹上分析梯度级分(图7)。

8)SDS-PAGE分析表明在第3蔗糖梯度级分中存在花叶VLP。用24ml缓冲液(5mM硼酸钠、2mM EDTA，pH 9.0)稀释24ml第3级分；

9)使用70型转子(贝克曼公司Optima，L100XP超速离心机；4小时，以50000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

10)将沉淀物溶于3ml 5mM硼酸钠，2mM EDTA，pH 9.0中；

11)将VLP悬浮液覆盖在20％蔗糖“垫”的顶部(在5mM硼酸钠、2mM EDTA，pH 9.0缓冲液中)；

12)使用转子TLA100.3(贝克曼公司；1小时，以72000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

13)将沉淀物溶解于2ml 5mM硼酸钠、2mM EDTA中，pH 9.0，过夜，4℃；

14)在SDS-PAGE凝胶纯化后(图7)以及在EM(图8)下分析VLP。

实例7

用花叶颗粒CMV-M-Arah202对小鼠进行免疫

用作为包括CMV-Ntt830-Arah202和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白(CMV-M-Arah202)的VLP的总量为10μg的Ara-h202或呈游离形式的Ara-h202对每组三只雌性Balb/c小鼠皮下地进行免疫。将VLP在pH 7.4的150mM PBS中调配，并以150ul体积皮下注射10ug。免疫后14天将小鼠放血，并通过ELISA对重组Ara-h202的所有免疫血清进行检测。

ELISA：

在指示的时间分析小鼠血清中的抗体应答。为了测定Ara-h202特异性抗体效价，将ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp，纽约州罗切斯特市)在4℃下用100μl从PBS中的花生提取物(1μg/ml)中纯化的Ara-h2包被过夜。为避免非特异性结合，用含200μl 2％BSA的PBST将ELISA板封闭，并在室温下温育2小时。将血清样品在2％BSA/PBST中稀释。将预先稀释的血清转移到包被的板上，并进一步连续稀释以获得基于OD50计算的抗体效价。在室温下温育2小时之后，将ELISA板用200μl PBST洗涤5次。通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室有限公司)检测血清抗体的结合。将检测抗体在2％BSA/PBST中以1:1000稀释，并转移每个样品100μl的体积。将板在室温下温育1小时。如前所描述的洗涤ELISA板。在洗涤之前，准备底物溶液。为此，将1片剂(10mg)OPD(1,2-苯二胺二盐酸盐)和9μl 30％H

为了测定Ara h202 IgG，在4℃下用PBS缓冲液中的2μg/ml Ara h2包被96孔NuncMaxisorpTM ELISA板(美国沃尔瑟姆马萨诸塞州的赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA))过夜。在用PBS/0.15％酪蛋白溶液封闭2小时之后，将板用PBS/0.05％Tween洗涤五次。将血清的系列稀释液添加到板中，并在4℃下温育2小时。然后将板用PBS/0.05％Tween(PBST)洗涤五次。此后，将HRP0标记的山羊抗小鼠IgG(美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室)在4℃下温育1小时。用TMB(3,30,5,50-四甲基-联苯胺)和H

实例8

用CMV-M-Arah202进行免疫以预防过敏反应

在第0天和第7天通过腹膜内注射在200μl明矾中调配的花生提取物使小鼠对花生过敏原敏感。然后将小鼠用CMV-M-Arah202或CMV-Ntt830 VLP接种疫苗作为对照组(第21天，在200ul PBS中为30ug)。图10A示出了研究CMV-M-Arah202疫苗接种对过敏全身和局部反应的保护作用的实验设计。

在致敏和疫苗接种的BALB/c的耳朵上用20ug静脉内花生提取物或通过皮肤点刺试验(180ug/20ul PBS)进行激发。通过温度下降(图10B；为了简单起见，CMV-Ntt830 VLP缩写为CMV)或流体组织外渗(点的直径，图10C；为了简单起见，CMV-Ntt830 VLP缩写为CMV)来分别确定全身和局部过敏反应。图代表2个独立实验。示出了每组5只小鼠的平均值+/-SEM。通过双向Anova检验分析过敏反应曲线。皮肤点刺测试通过双尾学生t检验进行分析。

实例9

含有CMV的经修饰的外壳蛋白和融合FEL D 1的花叶颗粒(CMV-M-Fel)的构建和表达

首先，制备了根据本发明的优选的嵌合CMV多肽的被称为“CMV-Ntt830-Feld12”的编码序列。

CMV-Ntt830-Feld12包括SEQ ID NO:38的Fel d1蛋白，其对应于Fel d1的链1和链2的融合蛋白，其中具有将所述链1与所述链2连接的15个氨基酸的GS接头。SEQ ID NO:38的构建体在WO 2017/042241的实例7中描述。进一步地，在CMV-Ntt830-Feld12内，SEQ ID NO:38的所述Fel d1蛋白由甘氨酸-丝氨酸接头侧接，详细地，SEQ ID NO:38的所述Fel d1蛋白在其N端处直接由SEQ ID NO:30的长度为15个氨基酸的GS接头侧接，并在其C端处直接由SEQ ID NO:31的长度为10个氨基酸的GS接头侧接。进一步地，将所述上述描述的完整构建体，即由所描述的甘氨酸-丝氨酸接头侧接的SEQ ID NO:38的构建体，插入在与CMV-Ntt830的SEQ ID NO:5的Ser(88)和Tyr(89)相对应的位置之间，从而产生CMV-Ntt830-Feld12。

根据本发明的此优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列被称为“CMV-Ntt830-Feld12”，其为SEQ ID NO:39。此优选的嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-Feld12的对应核苷酸序列在SEQ IDNO:40中描述。

CMV-Ntt830-Feld12基因如WO 2017/042241的实例7中所描述的类似地进行制备，所述文献的全部公开内容通过引用并入本文。为了获得所述CMV-Ntt830-Feld12基因，首先通过PCR用以下寡核苷酸扩增Fel d1对应基因：

正向：FG4S-BamF(SEQ ID NO:41)

反向：FG4S-BamR(SEQ ID NO:42)

将两个末端处含有侧接Gly-Ser接头和BamHI位点的PCR片段直接连接到pTZ57R/T载体中，并在大肠杆菌XL1细胞中转化之后分离出对应的含插入物的质粒克隆。为了找到没有PCR错误的插入物，使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(应用生物系统公司)对含PCR产物DNA的若干个质粒克隆进行测序。在测序之后，在位点BamHI中，将正确Fel d1片段连接到辅助载体pET-CMV-Ntt830B中。使用引物FG4S-BamF/CMcpR在“菌落PCR”反应中发现了含有正确方向的Fel d1插入物的正确克隆。对具有阳性PCR信号的质粒克隆进行重新测序，并选择正确克隆进行进一步克隆。因此，获得了辅助质粒pET-CMVB-Feld1。下一步，将NcoI/HindIII处理后的CMVB-Feld1片段亚克隆到辅助载体pETDu-CMV-Ntt830中(参见实例5)。为了构建不含Amp抗性基因的表达载体，将含有CMV-Ntt830-Feld12融合体和未经修饰的CMV-Ntt830基因的整个盒切除，并亚克隆到pET28a+(诺瓦根公司)的NcoI/XhoI位点中，得到表达载体pET28-CMVBxFeld1-CMVtt。质粒图谱示出在图11中。

花叶CMV-Feld1 VLP的分离，即，根据本发明的包括CMV-Ntt830-Feld12和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(被称为“CMV-M-Fel”)的分离包含以下步骤：

用质粒pET28-CMVBxFeld1-CMVtt转化大肠杆菌C2566(美国新英格兰生物实验室)感受态细胞。

在选择具有最高靶蛋白表达水平的克隆之后，在30℃下在旋转振荡器上，将大肠杆菌培养物在含有卡那霉素(25mg/l)的2TY(胰蛋白1.6％、酵母提取物1％、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)培养基中生长直到OD(600)值为0.8-1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并向培养基中补充5mM MgCl

花叶CMV-M-Fel VLP的纯化包含以下步骤：

1)将6g生物质悬浮于20ml的50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、5mM EDTA、5mM巯基乙醇，pH 9.0中，用超声处理悬浮液(Hielscher超声仪UP200S，16分钟，振幅70％，循环0.5)；

2)将裂解物在+4℃下以11000rpm离心20分钟；

3)在35ml试管中，在含有50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、2mM EDTA、0.5％TX-100的缓冲液中制备蔗糖梯度(20-60％)；

4)在蔗糖梯度上覆盖5ml VLP样品；

5)使用贝克曼公司(Beckman)的SW32转子(25000rpm，+18℃)离心6小时。

6)将每个梯度管的内容物分成6ml级分。合并对应级分；

7)分析SDS-PAGE上的梯度级分(图12A)；

8)SDS-PAGE分析表明在第2蔗糖梯度级分中存在花叶VLP。用24ml缓冲液(5mM硼酸钠、2mM EDTA，pH 9.0)稀释24ml第3级分；

9)使用70型转子(贝克曼公司Optima，L100XP超速离心机；4小时，以50000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

10)将沉淀物溶解于3ml 5mM硼酸钠、2mM EDTA，pH 9.0中；

11)将VLP悬浮液覆盖在20％蔗糖“垫”的顶部(在5mM硼酸钠、2mM EDTA，pH 9.0缓冲液中)；

12)使用转子TLA100.3(贝克曼公司；1小时，以72000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

13)将沉淀物溶解于2ml 5mM硼酸钠、2mM EDTA中，pH 9.0，过夜，4℃；

14)在SDS-PAGE凝胶纯化后(图12B)以及在EM(图12C)下分析VLP。

实例10

用花叶颗粒CMV-M-Fel对小鼠进行免疫

用化学偶联到CMVNtt830 VLP或重组Fel d1提取物的CMV-M-Fel或Fel d1对每组四只雌性Balb/c小鼠进行免疫。将VLP在pH 7.4的150mM PBS中调配，并以150ul体积皮下注射25ug。在PBS中调配重组Fel d1提取物，并皮下注射10ug。两周后，给小鼠放血，并通过ELISA确定针对Fel d1的抗体水平。如Schmitz N等人,《实验医学杂志》(2009)206:1941-1955所描述的，通过ELISA针对重组Fel d1测试所有免疫血清。

ELISA：

在指示的时间分析小鼠血清中的抗体应答。为了测定Fel d1特异性抗体效价，将ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp，纽约州罗切斯特市)在4℃下用PBS中的100μl Fel d1(1μg/ml)包被过夜。为避免非特异性结合，用含200μl 2％BSA的PBST将ELISA板封闭，并在室温下温育2小时。将血清样品在2％BSA/PBST中稀释。将预先稀释的血清转移到包被的板上，并进一步连续稀释以获得基于OD50计算的抗体效价。在室温下温育2小时之后，将ELISA板用200μl PBST洗涤5次。通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室有限公司)检测血清抗体的结合。将检测抗体在2％BSA/PBST中以1:1000稀释，并转移每个样品100μl的体积。将板在室温下温育1小时。如前所描述的洗涤ELISA板。在洗涤之前，准备底物溶液。为此，将1片剂(10mg)OPD(1,2-苯二胺二盐酸盐)和9μl 30％H

实例11

用CMV-M-Fel进行免疫以预防过敏反应

在第1天，用从在明矾中调配的猫毛中分离得到的1ug天然Fel d1通过腹膜内致敏，使小鼠对Fel d1过敏。在确定温度下降时的静脉内系统过敏反应之前，用CMV-M-Fel或CMV-Ntt830 VLP(第14天，在PBS中为30ug)对小鼠进行免疫。

在第0天通过腹膜内注射在200μl明矾中调配的天然Fel d1提取物(1ug)使小鼠对Fel d1敏感。然后将小鼠用CMV-M-Fel或CMV-Ntt830 VLP接种疫苗作为对照组(第21天，在200ul PBS中为30ug)。图14A示出了研究CMV-M-Fel疫苗接种对过敏全身和局部反应的保护作用的实验设计。

用Fel d1提取物在致敏和接种疫苗的BALB/c小鼠中进行静脉内激发。通过温度下降确定全身性过敏反应(图14B)。图代表2个独立实验。示出了每组5只小鼠的平均值+/-SEM。通过双向Anova检验分析过敏反应曲线。

实例12

含有CMV的经修饰的外壳蛋白和恶性疟原虫环子孢子蛋白(CSP)的融合内部重复序列的花叶颗粒(CMV-M-CSP)的构建和表达

为了克隆恶性疟原虫CS蛋白片段，即来自中央重复区的产生SEQ ID NO:44(19nanp)的19个NANP重复序列(SEQ ID NO:43)，SEQ ID NO:45的序列从商业来源获得(基因合成)：

序列SEQ ID NO:45还对CMV-Ntt830基因的3'端部分和必要的限制性位点BamHI和HindIII进行编码。

接下来，将来自基因合成产物的DNA片段用BamHI/HindIII处理，并再克隆到辅助载体pTZ-CMVB2(参见实例5)中。使用限制酶切位点分析(BamHI/HindIII)发现含有19NANP插入物的正确克隆。对具有正确限制酶模式的质粒克隆进行重新测序。下一步，将NcoI/HindIII处理后的CMVB-19NANP片段亚克隆到辅助载体pETDu-CMV-Ntt830中(参见实例5)。为了构建不含Amp抗性基因的表达载体，将含有CMV-19NANP融合体和来自pETDu-CMV-Ntt830的未经修饰的CMV-Ntt830基因的整个盒切除，并亚克隆到pET28a+(诺瓦根公司)的NcoI/BlpI位点中，得到表达载体pET28-CMVB2x19nanp-CMVtt。质粒图谱和序列细节示出在图15中。

根据本发明的此优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列被称为“CMV-Ntt830-19NANP”(或“CMV-Ntt830-19nanp”，如本文可互换使用)，其为SEQ ID NO:46。此优选的嵌合CMV多肽的此氨基酸序列包括在两个末端处侧接SEQ ID NO:44的引入的19nanp蛋白的甘氨酸-丝氨酸接头，即直接位于引入的19nanp蛋白的N端处的长度为15个氨基酸的GS接头(SEQ ID NO:30)和位于引入的19nanp蛋白的C端处的长度为12个氨基酸长的GS接头(SEQ ID NO:47)。此优选的嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-19NANP的对应核苷酸序列在SEQ ID NO:48中描述。

进一步地，用于合成包括CMV-Ntt830-19NANP和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-CSP)的所得质粒克隆pET28-CMVB2x19nanp-CMVtt用于转化大肠杆菌C2566细胞。为了分离CMV-M-CSP，如实例6中所描述的进行大肠杆菌细胞培养、生物质的处理和纯化。在SDS-PAGE凝胶中进行蔗糖梯度纯化之后对VLP的分析示出于图16中。在电子显微镜分析之后，经纯化的CMV-M-CSP的图像示出与图17中。

实例13

CMV-M-CSP的保护性功效

用CMV-M-CSP对每组四只雌性Balb/c小鼠进行免疫。在pH 7.4的150mM PBS中调配VLP，并以150ul体积皮下注射10ug。为了检查疫苗的功效，从英国哈伦购买每组6只雌性BALB/c近交系小鼠和每组8只8周龄雌性CD1远交系小鼠，并且每只小鼠肌内(i.m)接种20μg(50μL)CMV-Ntt830或CMV-M-CSP。在第0天和第21天进行疫苗接种。在第0天、第21天、第42天的每次疫苗接种之前收集样品(血液)，并通过ELISA测量CSP特异性免疫应答。在第42天，用表达恶性疟原虫蛋白的CSP蛋白的伯氏疟原虫替代物感染小鼠。从激发后第四天开始每天检查寄生虫血症，直到小鼠达到1％寄生虫血症。

通过ELISA进行CSP特异性抗体应答的测量

为了评估抗体产生，总IgG及其亚类，进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)。为此，将96孔微量滴定ELISA板(英国诺丁汉的赛默飞世尔科技公司)以每孔100μL在浓度为1μg/mL经纯化的CSP中包被，并在pH＝9.6的碳酸盐缓冲液(CBB)50mM中稀释，并在4℃下温育过夜。在第二天，将板填充有200μL的2％BSA-PBS以避免非特异性结合，并在室温下温育2小时。然后将免疫小鼠的血清稀释在0.2％BSA-PBS缓冲液中，首先以100比1稀释，并且然后在ELISA板中以1/3连续稀释十一次。对于总IgG测量，每孔添加100μL稀释到1:2000的山羊抗小鼠IgG(二抗，HRP偶联物(英国佩斯利的赛默飞世尔科技公司))，并在室温下温育1小时。为了评估IgG亚类，以1:2000的稀释度使用山羊抗小鼠IgG亚类(山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2bHRP偶联的，生命科技公司(Life Technologies))，并在室温下温育1小时。为了发展反应，应用100微升/孔的TMB底物(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))并在室温下温育10分钟，并放在铝箔下以避光。之后，用0.5M H2SO4(100微升/孔)终止反应，并使用酶标仪将板在450nm处读数。滴度表示为导致最大半数OD(OD50)的稀释度。

保护性功效的测量

此研究中使用的寄生虫是表达恶性疟原虫CSP蛋白的伯氏疟原虫(SciRep.2015Jul3；5:11820.doi:10.1038/srep11820.)。用感染的塔克普通(TO)小鼠饲喂雌性斯氏按蚊(Anopheles stephensi)蚊子。将感染的蚊子在12小时的昼夜循环中，在19到21°℃的温度下在潮湿温育箱中保存21天，并饲喂果糖对氨基苯甲酸(PABA)溶液。在21天之后，从蚊子中解剖唾液腺，放入到施耐德的培养基(德国艾登巴赫的Pan生物科技公司(PanBiotech,Aidenbach,Germany))中，并使用玻璃匀浆器轻轻释放子孢子。将子孢子稀释成100μL 1000个寄生虫的浓度，并且静脉内注射到小鼠的尾静脉中。寄生虫.从激发后第四天开始每天检查寄生虫血症，直到小鼠达到1％寄生虫血症。

实例14

含有CMV融合体与α-突触核蛋白肽的VLP的构建和表达

已经制备了根据本发明的CMV-α-突触核蛋白-嵌合CMV多肽，其包括α-突触核蛋白肽egy(SEQ ID NO:49)、kne(SEQ ID NO:50)和mdv(SEQ ID NO:51)。

这些α-突触核蛋白肽已插入CMV-Ntt830(SEQ ID NO:5)的氨基酸残基Ser(88)与Tyr(89)之间。根据本发明的这些优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列如下：

“CMV-Ntt830-egy”的氨基酸序列：SEQ ID NO:52；

“CMV-Ntt830-kne”的氨基酸序列：SEQ ID NO:53；

“CMV-Ntt830-mdv”的氨基酸序列：SEQ ID NO:54。

这些优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列进一步包括在两个末端处侧接引入的α突触核蛋白肽的甘氨酸-丝氨酸接头。SEQ ID NO:52到SEQ ID NO:54的所有优选的融合蛋白包括直接位于引入的α突触核蛋白肽的N端处的GGGS接头(SEQ ID NO:10)以及位于引入的α突触核蛋白肽的C端处的GGGSGS接头(SEQ ID NO:11)。

所述优选的嵌合CMV多肽的对应的核苷酸序列如下：

“CMV-Ntt830-egy”的核酸序列：SEQ ID NO:55；

“CMV-Ntt830-kne”的核酸序列：SEQ ID NO:56；

“CMV-Ntt830-mdv”的核酸序列：SEQ ID NO:57。

为了在表达载体中引入编码α-突触核蛋白肽变体的DNA，在PCR反应中使用了以下寡核苷酸，而所有PCR中的模板均为pET-CMV-Ntt830：

第1PCR正向：CM-egyF(SEQ ID NO:58)

反向：CMcpR(SEQ ID NO:59)

第2PCR正向：CM-kneF(SEQ ID NO:60)

反向：CMcpR(SEQ ID NO:59)

第3PCR正向：CM-mdvF(SEQ ID NO:61)

反向：CMcpR(SEQ ID NO:59)

将所有PCR片段直接连接到pTZ57R/T载体中，并在大肠杆菌XL1细胞中转化之后分离出对应的含插入物的质粒克隆。使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(应用生物系统公司)对含对应的PCR产物的DNA的若干个质粒克隆进行测序。在测序之后，使用BamHI和HindIII限制性酶切位点，从pTZ载体切除含α-突触核蛋白片段的CMV 3'端片段，并连接到pET-CMV-Ntt830B辅助载体中(参见实例1)。在BamHI/HindIII限制性核酸内切酶测试之后，选择了正确克隆。

进一步地，质粒克隆pET-CMV-Ntt830B-egy、pET-CMV-Ntt830B-kne和pET-CMV-Ntt830B-mdv用于转化大肠杆菌C2566细胞。质粒图谱和序列细节示出在图18中。

为了分离对应的含α-突触核蛋白肽的VLP，如实例2中所描述的进行大肠杆菌细胞培养、生物质的处理和纯化。

在SDS-PAGE凝胶中进行蔗糖梯度纯化之后对VLP的分析示出于图19A、图19B和图19C以及图20A中。电镜图像示出于图20B、图20C和图20D中。

实例15

含有CMV的经修饰的外壳蛋白和融合猫白介素5的花叶颗粒(CMV-M-fel-IL-5)的构建和表达

为了克隆CMV的包括猫IL-5抗原的经修饰的外壳蛋白，构建了两种不同的载体。

如下使用PCR诱变和寡核苷酸构建了第一载体，允许在fel IL-5抗原的两侧引入包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少Glu并且甚至进一步包括至少一个Asp的氨基酸接头：

第1PCR反应：

正向：830-NcoF(SEQ ID NO:33)

反向：Cmded-BamR(SEQ ID NO:121)

模板：pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt

第2PCR反应：

正向：CMded-BamF(SEQ ID NO:122)

反向：CM-cpR(SEQ ID NO:26)

模板：pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt

在基因片段扩增之后，将对应的PCR产物直接克隆到pTZ57R/T载体(InsTAclonePCR克隆试剂盒，富酶泰斯公司编号K1214)中。大肠杆菌XL1-Blue细胞用作克隆和质粒扩增的宿主。为避免RT-PCR错误，使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))对若干个含CMV-Ntt830基因的pTZ57质粒克隆进行了测序。在测序之后，将含有来自第1PCR反应的产物的pTZ质粒克隆用NcoI/BamHI限制酶切割，将来自第2PCR反应的克隆用BamHI/HindIII切割，并与辅助载体pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt进行连接反应，所述辅助载体用NcoI/HindIII切割。此处，使用质粒pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt作为辅助载体来生成新的基于CMV的表达载体。NcoI/HindIII处理完全去除了CMVB2xArah202基因。三个DNA片段的连接产生了辅助质粒pETDu-CMVB3d-CMVtt。载体含有CMV-Ntt830基因和源自两种经编码的蛋白中的破伤风毒素的Th细胞表位，以及对包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少Glu并且甚至进一步包括至少一个Asp的氨基酸接头进行编码的引入的序列，详细地包括Gly-Ser接头，其具有另外的Asp-Glu-Asp段和BamHI/SpeI位点，以用于在第一T7启动子下亚克隆CMV-Ntt830基因中的抗原DNA序列。

此外，如下使用PCR诱变和寡核苷酸构建了第二载体，允许在fel IL-5抗原的N端上引入GS接头，并在fel IL-5抗原的C端上引入包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少Thr的氨基酸接头：

第3PCR反应：

正向：CM-BamSpeF(SEQ ID NO:137)

反向：CM-cpR(SEQ ID NO:26)

模板：pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt

来自第3反应的PCR产物也被直接克隆到pTZ57R/T载体中；所得连接混合物用于转化大肠杆菌XL1-Blue细胞。在分离质粒DNA后，对若干个克隆进行测序。用BamHI/HindIII限制酶切割正确质粒克隆，并将所得片段亚克隆到用相同酶切割的pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt中。连接反应产生辅助质粒pETDu-CMVB3-CMVtt。

猫白介素5(IL5)基因以质粒pET42-felIL5N的形式从基因合成服务(美国通用生物系统公司(General Biosystems,USA))获得。为了克隆，使用以下寡核苷酸在PCR反应中扩增felIL5基因：

正向：I5-BamF(SEQ ID NO:123)

反向：I5-SpeR(SEQ ID NO:124)

模板：pET42-felIL5N

将PCR产物直接连接到pTZ57中，并在分离质粒DNA后，对若干个克隆进行测序。在标识无序列错误的克隆之后，将felIL5基因进一步亚克隆到BamHI/SpeI位点的pETDu-CMVB3d-CMV-tt或pETDu-CMVB3-CMV-tt中。所得pETDu-CMVB3d-flIL5-CMV-tt和pETDu-CMVB3-flIL5-CMV-tt的质粒图谱示出在图21A和图21B中。所述质粒和表达载体确保并用于表达包括CMV-Ntt830-fel-IL-5和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-fel-IL-5)。

CMV-Ntt830-fel-IL-5包括SEQ ID NO:125的猫IL-5蛋白，其由包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少一个Glu的氨基酸接头侧接。详细地，SEQ ID NO:125的所述猫IL-5蛋白在其N端处直接由SEQ ID NO:126的长度为18个氨基酸的GSED接头侧接，并在其C端处直接由SEQ ID NO:127的长度为15个氨基酸的GSED接头侧接。进一步地，将所述上述描述的完整构建体，即由所描述的GSED接头侧接的SEQ ID NO:125的构建体，插入在与CMV-Ntt830的SEQ ID NO:5的Ser(88)和Tyr(89)相对应的位置之间，从而产生CMV-Ntt830-fel-IL-5。根据本发明的此优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列被称为“CMV-Ntt830-fel-IL-5”，其为SEQID NO:128。此优选的嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-fel-IL-5的对应核苷酸序列在SEQ ID NO:129中描述。

CMV-Ntt830-fel-IL-5

因此，为了表达和纯化花叶CMV-M-fel-IL-5和CMV-M-fel-IL-5

在选择具有最高靶蛋白表达水平的克隆之后，在30℃下在旋转振荡器上，将大肠杆菌培养物在含有氨苄青霉素(100mg/l)的2TY(胰蛋白1.6％、酵母提取物1％、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)培养基中生长直到OD(600)值为0.8-1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并向培养基中补充5mM MgCl

包括CMV-Ntt830-fel-IL-5或CMV-Ntt830-fel-IL-5

1)将1.5g生物质悬浮于10ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中，用超声处理悬浮液(Hielscher超声仪UP200S，16分钟，振幅70％，循环0.5)；

2)将裂解物在+4℃下以11000rpm离心20分钟；

3)在35ml试管中，在含有20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、0.5％TX-100的缓冲液中制备蔗糖梯度(20-60％)；

4)在蔗糖梯度上覆盖5ml VLP样品。准备2管；

5)使用贝克曼公司的SW32转子(25000rpm，+18℃)离心6小时。

6)将每个梯度管的内容物分成6ml级分。合并对应级分；

7)分析SDS-PAGE上的梯度级分(图22A和图22B)。

8)SDS-PAGE分析表明在第2和第3蔗糖梯度级分中存在花叶VLP。用等量的缓冲液(20mM Tris-HCl、5mM EDTA，pH 8.0)稀释第2级分和第3级分；

9)使用70型转子(贝克曼公司Optima，L100XP超速离心机；4小时，以50000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

10)将沉淀物溶解于2ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中；

11)将VLP悬浮液覆盖在20％蔗糖“垫”的顶部(在20mM Tris-HCl(pH 8)、5mMEDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油缓冲液中)；

12)使用转子TLA100.3(贝克曼公司；1小时，以72000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

13)将沉淀物溶解于2ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中，过夜，在4℃下；

14)通过离心(5分钟，13000rpm，Eppendorf 5418)澄清悬浮液

15)在SDS-PAGE凝胶纯化后(图23A和图23C)以及在EM(图23B和图23D)下分析VLP。

EM图像显示，与包括CMV-Ntt830-fel-IL-5

实例16

含有CMV的经修饰的外壳蛋白和融合复制猫白介素5的花叶颗粒(CMV-M-2xfel-IL-5)的构建和表达

为了克隆包括两个拷贝的猫IL-5抗原的CMV的经修饰的外壳蛋白，如下使用PCR诱变和寡核苷酸构建了相应载体，允许在fel IL-5抗原的两侧引入包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少Glu并且甚至进一步包括至少一个Asp的氨基酸接头以及氨基酸接头以与连接两个猫Il-5抗原：

第1PCR反应：

正向：I5-BamF(SEQ ID NO:123)

反向：2xIL5-gsKpnR(SEQ ID NO:130)

模板：pETDu-CMVB3d-flIL5-CMV-tt

第2PCR反应：

正向：2xIL5-gsKpnF(SEQ ID NO:131)

反向：I5-SpeR(SEQ ID NO:124)

模板：pETDu-CMVB3d-flIL5-CMV-tt

在基因片段扩增之后，将对应的PCR产物直接克隆到pTZ57R/T载体(InsTAclonePCR克隆试剂盒，富酶泰斯公司编号K1214)中。大肠杆菌XL1-Blue细胞用作克隆和质粒扩增的宿主。为了找到没有PCR错误的质粒，使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))对若干个含fel-IL5基因的pTZ57质粒克隆进行了测序。在测序之后，用Kpn2/EcoRI限制酶切割含有来自第2PCR反应的产物的正确pTZ质粒克隆，并将所得片段连接到含有来自第1PCR反应的PCR产物的用相同限制酶切割的pTZ质粒中。连接反应产生了辅助质粒pTZ-2xflIL5，其含有与Gly-Ser接头连接的两个拷贝的flIL5基因。从XL1细胞中纯化含有复制的felIL5的质粒。使用BamHI/SpeI限制酶进一步切除2xfel-IL5基因，并连接到相同的限制性位点中的表达载体pETDu-CMVB3d-CMVtt中。所得载体含有CMV-Ntt830以及对两个猫IL5基因进行编码的引入的序列，所述序列被Gly-Ser接头分开并且由包括至少一个Gly、至少一种Ser和至少Glu并且甚至进一步包括至少一个Asp的氨基酸接头侧接，详细地包括具有另外的Asp-Glu-Asp段的Gly-Ser接头。所得pETDu-CMVB3d-2xflIL5-CMV-tt的质粒图谱示出在图24中。所述质粒和表达载体确保并用于表达包括CMV-Ntt830-2xfel-IL-5和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-2xfel-IL-5)。

CMV-Ntt830-2xfel-IL-5包括两个拷贝的SEQ ID NO:125的猫IL-5蛋白，其与Gly-Ser接头(SEQ ID NO:30)连接，并由包括至少一个Gly、至少一种Ser和至少一个Glu的氨基酸接头侧接。详细地，与Gly-Ser接头(SEQ ID NO:30)连接的SEQ ID NO:125的两个拷贝的猫IL-5蛋白的所述序列在其N端直接由SEQ ID NO:126的长度为18个氨基酸的GSED接头侧接，并在其C端处直接由SEQ ID NO:127的长度为15个氨基酸的GSED接头侧接。进一步地，将所述上述描述的完整构建体，即与SEQ ID NO:30连接的并由所描述的GSED接头侧接的SEQID NO:125的两个拷贝的构建体，插入在与CMV-Ntt830的SEQ ID NO:5的Ser(88)和Tyr(89)相对应的位置之间，从而产生CMV-Ntt830-2xfel-IL-5。

据本发明的此优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列被称为“CMV-Ntt830-2xfel-IL-5”，其为SEQ ID NO:132。此优选的嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-2xfel-IL-5的对应核苷酸序列在SEQ ID NO:133中描述。

因此，或表达和纯化花叶CMV-M-2xfel-IL-5，用质粒pETDu-CMVB3d-2xflIL5-CMVtt转化大肠杆菌C2566(美国新英格兰生物实验室)感受态细胞。

在选择具有最高靶蛋白表达水平的克隆之后，在30℃下在旋转振荡器上，将大肠杆菌培养物在含有氨苄青霉素(100mg/l)的2TY(胰蛋白1.6％、酵母提取物1％、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)培养基中生长直到OD(600)值为0.8-1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并向培养基中补充5mM MgCl

根据本发明的包括CMV-Ntt830-2xfel-Il5和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP的纯化(所述花叶VLP被称为“CMV-M-2xfel-IL-5”)包含以下步骤：

1)将1.5g生物质悬浮于10ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中，用超声处理悬浮液(Hielscher超声仪UP200S，16分钟，振幅70％，循环0.5)；

2)将裂解物在+4℃下以11000rpm离心20分钟；

3)在35ml试管中，在含有20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、0.5％TX-100的缓冲液中制备蔗糖梯度(20-60％)；

4)在蔗糖梯度上覆盖5ml VLP样品。准备2管；

5)使用贝克曼公司的SW32转子(25000rpm，+18℃)离心6小时。

6)将每个梯度管的内容物分成6ml级分。合并对应级分；

7)在SDS-PAGE上分析梯度级分(图25)。

8)SDS-PAGE分析表明在第2和第3蔗糖梯度级分中存在花叶VLP。合并第2级分和第3级分，用等量的缓冲液(20mM Tris-HCl、5mM EDTA，pH 8.0)稀释；

9)使用70型转子(贝克曼公司Optima，L100XP超速离心机；4小时，以50000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

10)将沉淀物溶解于2ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中；

11)将VLP悬浮液覆盖在20％蔗糖“垫”的顶部(在20mM Tris-HCl(pH 8)、5mMEDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油缓冲液中)；

12)使用转子TLA100.3(贝克曼公司；1小时，以72000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

13)将沉淀物溶解于2ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中，过夜，在4℃下；

14)通过离心(5分钟，13000rpm，Eppendorf 5418)澄清悬浮液

15)在SDS-PAGE凝胶纯化后(图26A)以及在EM(图26B)下分析VLP。

实例17

含有CMV的经修饰的外壳蛋白和融合犬白介素1b的花叶颗粒(CMV-M-cIL-1b)的构建和表达

具有侧接BamHI和Spe I位点的犬白介素1b基因从商业来源获得(美国通用生物系统公司pUCcIL1b中的基因合成产物)。从质粒pUCcIL1b-BS切除BamHI/SpeI片段，并将其连接到辅助载体pETDu-CMVB3d-CMVtt(位点BamHI和SpeI)中。从大肠杆菌XL1细胞分离所得质粒，并进行重新测序以验证导入的cIL-1b序列。pETDu-CMVB3d-cIL1b-CMV-tt的质粒图谱如(图27)所示。所述质粒和表达载体确保并用于表达包括CMV-Ntt830-cIL-1b和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP(即，CMV-M-cIL-1b)。

CMV-Ntt830-cIL-1b包括SEQ ID NO:134的犬IL-1b蛋白，其由包括至少一个Gly、至少一个Ser和至少一个Glu的氨基酸接头侧接。详细地，SEQ ID NO:134的所述犬IL-1b蛋白在其N端处直接由SEQ ID NO:126的长度为18个氨基酸的GSED接头侧接，并在其C端处直接由SEQ ID NO:127的长度为15个氨基酸的GSED接头侧接。进一步地，将所述上述描述的完整构建体，即由所描述的GSED接头侧接的SEQ ID NO:134的构建体，插入在与CMV-Ntt830的SEQ ID NO:5的Ser(88)和Tyr(89)相对应的位置之间，从而产生CMV-Ntt830-cIL-1b。

据本发明的此优选的嵌合CMV多肽的氨基酸序列被称为“CMV-Ntt830-cIL-1b”，其为SEQ ID NO:135。此优选的嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-cIL-1b的对应核苷酸序列在SEQ IDNO:136中描述。

因此，或表达和纯化花叶CMV-M-cIL-1b，用质粒pETDu-CMVB3d-cIL1b-CMVtt转化大肠杆菌C2566(美国新英格兰生物实验室)感受态细胞。

在选择具有最高靶蛋白表达水平的克隆之后，在30℃下在旋转振荡器上，将大肠杆菌培养物在含有氨苄青霉素(100mg/l)的2TY(胰蛋白1.6％、酵母提取物1％、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)培养基中生长直到OD(600)值为0.8-1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并向培养基中补充5mM MgCl

根据本发明的包括CMV-Ntt830-cIL-1b和未经修饰的CMV-Ntt830蛋白的花叶VLP的纯化(所述花叶VLP被称为“CMV-M-cIL-1b”)包含以下步骤：

1)将1.5g生物质悬浮于10ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中，用超声处理悬浮液(Hielscher超声仪UP200S，16分钟，振幅70％，循环0.5)；

2)将裂解物在+4℃下以11000rpm离心20分钟；

3)在35ml试管中，在含有20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、0.5％TX-100的缓冲液中制备蔗糖梯度(20-60％)；

4)在蔗糖梯度上覆盖5ml VLP样品。准备2管；

5)使用贝克曼公司的SW32转子(25000rpm，+18℃)离心6小时。

6)将每个梯度管的内容物分成6ml级分。合并对应级分；

7)在SDS-PAGE上分析梯度级分(图28)。

8)SDS-PAGE分析表明在第2和第3蔗糖梯度级分中存在花叶VLP。合并第2级分和第3级分，用等量的缓冲液(20mM Tris-HCl、5mM EDTA，pH 8.0)稀释；

9)使用70型转子(贝克曼公司Optima，L100XP超速离心机；4小时，以50000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

10)将沉淀物溶解于2ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中；

11)将VLP悬浮液覆盖在20％蔗糖“垫”的顶部(在20mM Tris-HCl(pH 8)、5mMEDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油缓冲液中)；

12)使用转子TLA100.3(贝克曼公司；1小时，以72000rpm，5℃)通过超离心收集VLP；

13)将沉淀物溶解于2ml的20mM Tris-HCl(pH 8)、5mM EDTA、5mM巯基乙醇、5％甘油、10％蔗糖中，过夜，在4℃下；

14)通过离心(5分钟，13000rpm，Eppendorf 5418)澄清悬浮液

15)在SDS-PAGE凝胶(图29A)上和在EM下(图29B)纯化后分析VLP。