一种防治水产动物弧菌病害的霍乱弧菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及水产防治技术领域，具体涉及一种防治水产动物弧菌病害的霍乱弧菌噬菌体及其应用。

背景技术

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)属于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属(Vibrio)，为革兰氏阴性菌，广泛分布在水环境中，菌体呈弯曲弧形或逗点状，具有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜，运动性。霍乱弧菌是一种重要的鱼类和人类病原体，其中非O1/O139型霍乱弧菌广泛分布于水环境中，尤其在江河、湖泊、海水养殖中，能引起鱼、虾等水产动物感染疾病。感染霍乱弧菌病的虾类体色发黑，复眼变白，反应迟钝，多集分布于池塘四周浅滩脚处，病虾鳃部呈红色，上有黑色斑点，严重的病虾鳃组织全变为黑色，濒死状态个体的鳃有黏连糜状，易脱落，胃呈透明色，体内充盈液体，肝胰腺为红黄色，质地易碎，肌肉初性较差，并造成大量死亡，给水产养殖户造成巨大的经济损失。目前我国对霍乱弧菌的防治主要依赖于抗生素和一些药物，抗生素滥用的现象已经非常严重，也带来了环境污染和“超级细菌”产生的问题，随着人们环保意识的提高以及可持续农业发展战略的实施，寻找环保、安全、有效的生物防治措施越来越被人们重视。

水产噬菌体微生态制剂具有环境友好、对非靶标生物安全以及对水产病害具有特异性杀菌效果等优点，不同于抗生素和化学制剂，是完全源于自然的绿色环保产品，广泛应用于水产养殖领域和食品安全领域，在养殖业中替代抗生素用于防病抗病、克服过量使用抗生素带来的致病菌耐药性问题，已成为当前生物技术研究的热点。目前抗生素等化学制剂对水产病害的防治效果并不好，药效短，见效差，且容易导致病原耐药性增强。噬菌体对宿主有高度专一性，一般只能裂解一种宿主，因此窄谱噬菌体一般不能解决在水产养殖过程中出现的多种细菌病害感染问题。而本发明的噬菌体12VC501噬菌谱广，能同时裂解6种不同的宿主，能裂解44株霍乱弧菌，23株哈维氏弧菌，16株副溶血弧菌，15株溶藻弧菌，10株坎氏弧菌，8株创伤弧菌，能更有效的解决水产养殖中出现的多种细菌病害感染问题。同时噬菌体离开宿主微生物后无法独立生长和繁殖，也无法侵染其他生物和人类，不产生生物危害和环境污染。因此，本发明分离筛选新的具有高裂解能力的噬菌体用于抑菌杀菌不仅有效，而且具有高度的安全性，在水产生物防治上具有重大意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此本发明提供了一种防治水产动物弧菌病害的霍乱弧菌噬菌体及其应用，该噬菌体噬菌谱广，能同时裂解6种不同的宿主，能裂解44株霍乱弧菌，23株哈维氏弧菌，16株副溶血弧菌。能更有效的解决水产养殖中出现的多种细菌病害感染问题，具有良好的应用前景。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种防治水产动物弧菌病害的霍乱弧菌噬菌体及其应用，所述噬菌体于2021年11月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211375，分类命名为：Vibrio cholerae Phage 12VC501，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。根据本发明分离筛选得到的噬菌体12VC501具有较广的噬菌谱，其能同时裂解6种不同的宿主，能裂解44株霍乱弧菌，23株哈维氏弧菌，16株副溶血弧菌，能更有效的解决水产养殖中出现的多种细菌病害感染问题，具有良好的应用前景。

可选地，所述噬菌体是有尾噬菌体纲、Schitoviridae科的噬菌体新种，其全基因组在NCBI官网GeneBank登录号为OP313112.1。

可选地，所述噬菌体具有4个特异性基因片段，其核酸序列如实施例4所示。由此，通过这4个特异性基因片段可作为识别该噬菌体的典型特征。

可选地，所述噬菌体具有4个特异性PCR扩增引物，其特异性PCR扩增引物如实施例4所示。由此，通过这4个特异性PCR扩增引物可作为识别该噬菌体的典型特征。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种微生态制剂，其包括上述的防治水产霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等弧菌病害的新型噬菌体。根据本发明的实施例，该微生态制剂可用于防治水产霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等弧菌病害。

可选地，所述噬菌体的有效价为5.8×10

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明实施例的噬菌体12VC501的噬菌斑图；

图2为根据本发明实施例的噬菌体12VC501的透射电镜图；

图3为根据本发明实施例的噬菌体12VC501的系统进化树图；

图4为根据本发明实施例的噬菌体12VC501在NCBI上BLAST比对结果；

图5为根据本发明实施例的4个特异性基因的PCR扩增产物电泳图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1噬菌体12VC501的筛选和纯化

1、患病青虾病原菌霍乱弧菌的分离

取福建长泰地区患病青虾，剪取病虾头部于无菌培养皿，取50mL75％酒精将病虾头部表面冲洗干净，用研钵研磨后加入4mL无菌水使其充分溶解混匀，静止30min后取100μL上清液于弧菌专用培养基TCBS中，均匀涂布。在32℃下培养12h，挑取黄色菌落，在同样的选择培养基上划线纯化，反复纯化3次，将形态一致的菌株用接种环挑取单菌落接入3％NaCl浓度的LB液体培养基中，32℃培养12h,取500μL菌液和500μL 40％甘油混合后置于-80℃冰箱保存。

2、弧菌的扩大培养

宿主菌的扩大培养，在LB液体培养基中加入3％的NaCl，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，采用如下两种接种方法，第一种接种方法是单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，发酵温度为32℃，转速为150rpm，发酵时间12h；第二种接种方法是液体接种，加入10％培养基体积的浓度为10

3、噬菌体12VC501的筛选

从福建省漳州、泉州、广东湛江、海南海口等地25个青虾养殖池塘采集水样，采用菌液水样混合富集法，将培养好的霍乱弧菌液和水样分别取1L混合到一起，再加入1L新鲜3％NaCl浓度的LB液体培养基富集培养过夜。提取富集过后的液体，先12000rpm离心10min，再用0.22μm过滤膜过滤两次，通过涂布点样法筛选得到噬菌体。本发明的噬菌体是从福建省漳州市长泰县青虾池塘的水样中筛选获得。

4、噬菌体12VC501的纯化

挑选单个噬菌斑，放入1mL的SM缓冲液(Scientific Phygene公司产品)培养过夜，然后12000rpm离心10min，再用0.22μm过滤膜过滤两次，进行梯度稀释，稀释至10

5、噬菌体12VC501的耐高温性测定

取6个装有200mL含量为8.3×10

表1：噬菌体12VC501的耐高温性测定

6、噬菌体12VC501的耐酸碱性测定

取7个装有200mL含量为5.7×10

表2：噬菌体12VC501的耐酸碱性测定

7、噬菌体12VC501的紫外耐受能力测定

在超净工作台内，取12个装有10mL含量为9.3×10

表3：噬菌体12VC501的紫外耐受能力测定

8、噬菌体12VC501的形态学特征

取噬菌体12VC501富集液20μL于铜网上，静置吸附10min，用滤纸吸去多余菌液，再取适量3％磷钨酸染色5min，干燥后在透射电镜下观察。结果如图2所示，所筛选的噬菌体为有尾噬菌体，头部形状为正廿面体，头部长为71.3±1.6nm，头宽62.9±2.3nm，尾长68.2±1.7nm。

实施例2

1、噬菌体12VC501对霍乱弧菌的最佳感染复数(MOI)测定

取8个100mL的新鲜3％LB液体培养基，分别进行处理。处理1同时加入1mL含量为10

表4：噬菌体12VC501对霍乱弧菌最佳感染复数(MOI)测定

2、噬菌体12VC501的扩大培养

对分离出来的噬菌体进行扩培：配置3％LB液体培养基1L，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，同时加入1mL含量为10

3、噬菌体12VC501微生态制剂的制备

配置3％LB液体培养基1L，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，同时加入1mL含量为10

4、噬菌体12VC501的含量测定

将噬菌体进行梯度稀释，稀释至10

表5：噬菌体12VC501的含量测定

5、噬菌体12VC501的毒力基因或不良基因缺失检测试验

对噬菌体12VC501进行生物信息学分析，结果如表6所示，噬菌体12VC501不含有毒力基因或不良基因。

表6噬菌体12VC501开放阅读框

6.噬菌体12VC501的系统进化分析

以噬菌体12VC501全基因组构建的系统进化树(如图3所示)可以看出，噬菌体12VC501与GeneBank登录号为NC_028799、NC_049380、NC_049350、NC_021540的弧菌噬菌体全基因组属于同一分支，与其他噬菌体全基因组都不在一个分支上。

实施例3噬菌体12VC501的裂解能力和防治效果

1、噬菌体12VC501对霍乱弧菌的裂解能力测定

将噬菌体12VC501进行计数，分别稀释至1×10

表7：噬菌体12VC501对霍乱弧菌的裂解能力测定

2、噬菌体12VC501的宿主谱测定

培养噬菌体宿主菌VC501及其他弧菌共165株，其中包括霍乱弧菌58株，哈维氏弧菌32株，副溶血弧菌25株，溶藻弧菌21株，坎氏弧菌16株，创伤弧菌13株。在32℃，150r/min条件下培养12h后，通过直接点样法，取100μL浓度为3.8×10

结果如表8所示：噬菌体12VC501能裂解165株弧菌的116株，其中能裂解44株霍乱弧菌，23株哈维氏弧菌，16株副溶血弧菌，15株溶藻弧菌，10株坎氏弧菌，8株创伤弧菌，裂解率为70.30％，对弧菌的裂解能力强。杨吉霞的“霍乱弧菌SWBC-a为靶细菌筛选宽裂解弧菌噬菌体”中对26株弧菌(霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌)做了侵染实验，发现噬菌体SWBC-a-3只能裂解其中的3株弧菌。王景峰的“噬菌体VB_VpP_BT-1011、筛选方法和应用”中噬菌体VB_VpP_BT-1011对8株副溶血弧菌和16株其他菌种裂解实验，只能裂解其中1株副溶血弧菌。郑小双的“副溶血弧菌广谱裂解性噬菌体的筛选及其在海产品安全控制中的应用”中对42株副溶血弧菌做了侵染实验，发现噬菌体VppYZU68只能裂解其中的5株。陈义宝的“沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究”中对15株沙门氏菌进行了侵染试验，只能裂解其中的2株。张志宏的“一株金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解谱特异性和分子分类研究”中对37株金黄色葡萄球菌和74株其他种属菌株做了侵染实验，发现噬菌体vB_SauH_SAP1只能裂解10株金黄色葡萄球菌。由此可知，噬菌体具有很强的专一性，一般只能裂解1种宿主，且在实际运用中，窄谱噬菌体面对水产养殖过程中出现的多种细菌病害感染问题很难发挥作用，而本发明的12VC501噬菌体可以同时裂解6种不同种的宿主，能同时裂解44株霍乱弧菌，23株哈维氏弧菌，16株副溶血弧菌，15株溶藻弧菌，10株坎氏弧菌，8株创伤弧菌。因此，相较于其他噬菌体，本发明的噬菌体12VC501裂解能力更强，宿主谱更广，能在实际运用中更有效的解决水产养殖中出现的多种细菌病害感染问题。

表8:噬菌体12VC501的宿主谱

3、宽谱噬菌体12VC501与窄谱噬菌体对青虾弧菌的防治效果测定

培养霍乱弧菌VC501菌液、哈维氏弧菌VH513菌液、副溶血弧菌VP508，分别取500mL浓度为3.8×10

取平均体重(24.0±2.2)g的青虾200只，分为5个处理组，每组2个重复，每个重复20只青虾，放在玻璃鱼缸中(容量为60L),加入40L水。处理A组为无处理的空白对照，处理B组加入制备好的霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌上清液各100mL，处理C组同时加入制备好的霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌上清液各100mL和100mL VC501B噬菌体液，处理D组同时加入制备好的霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌上清液各100mL和100mL VC501F噬菌体液，处理E组同时加入制备好的霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌上清液各100mL和100mL实施例2中的噬菌体12VC501制剂，每天观察青虾生长情况并记录各处理组死亡青虾数。

宽谱噬菌体12VC501与窄谱噬菌体VC501B和VC501F对青虾弧菌的防治效果见表9，处理A组无青虾死亡；处理B组3d时青虾死亡21只，死亡率为52.50％，7d后青虾死亡39只，死亡率高达97.50％；处理C组3d时青虾死亡13只，死亡率为32.50％，7d后青虾死亡25只，死亡率为62.50％；处理D组3d时青虾死亡15只，死亡率为37.50％，7d后青虾死亡26只，死亡率为65.00％；处理E组3d时青虾死亡3只，死亡率为7.50％，7d后青虾死亡5只，死亡率为12.5％。通过对比，发现7d后处理E死亡率比处理B降低了85％,比处理C降低了50％，比处理D降低了52.50％。结果表明：在实际运用中宽谱噬菌体12VC501微生态制剂相对于窄谱噬菌体VC501B和VC501F具有明显的优势，能显著降低青虾的死亡率，降低水产养殖中霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌带来的危害，且治疗效果明显。

表9.宽谱噬菌体12VC501与窄谱噬菌体对青虾弧菌的防治效果测定

4、噬菌体12VC501微生态制剂对青虾霍乱弧菌的预防治疗效果测定

取平均体重(24.0±2.2)g的青虾200只，分为5个处理组，每组2个重复，每个重复20只青虾，放在玻璃鱼缸中(容量为60L),加入40L水。处理A组为无处理的空白对照，处理B组加入100mL制备好的霍乱弧菌上清液，处理C组同时加入100mL制备好的霍乱弧菌上清液和100mL实施例2中的噬菌体12VC501制剂，处理D组加入100mL实施例2中的噬菌体12VC501制剂3d后再加入100mL制备好的霍乱弧菌上清液，处理E组加入100mL噬菌体12VC501制剂，每天观察青虾生长情况并记录各处理组死亡青虾数。

噬菌体12VC501制剂对青虾霍乱弧菌病害防治效果见表10，处理A组和处理E组无青虾死亡；处理B组3d时青虾死亡19只，死亡率为47.50％，7d后青虾死亡38只，死亡率高达95.00％；处理C组3d时青虾死亡2只，死亡率仅为5.0％，7d后青虾死亡3只，死亡率仅为7.50％，处理D组3d时青虾死亡0只，死亡率为0％，7d后青虾死亡1只，死亡率仅为2.50％。通过对比，发现7d后C组青虾死亡率比B组降低了87.50％，证明了噬菌体12VC501微生态制剂对青虾霍乱弧菌病害有很好的治疗效果，且7d后D组青虾死亡率比B组降低了92.50％，提前预防效果显著，证明噬菌体12VC501微生态制剂对青虾霍乱弧菌病害有很好的预防效果，且E组无青虾死亡，证明噬菌体12VC501微生态制剂对青虾生长未有影响。因此，结果表明：噬菌体12VC501微生态制剂对青虾生长未有影响，且对青虾霍乱弧菌病害有明显的预防与治疗效果。

表10：噬菌体12VC501微生态制剂对青虾霍乱弧菌病害预防治疗效果

实施例4噬菌体12VC501全基因组测定和分析

1、噬菌体12VC501的纯化

取12VC501噬菌体液2mL，8000rpm离心10min，取上清液用0.22μm过滤膜过滤两次后放置于4℃冰箱保存。

2、噬菌体12VC501基因组DNA的提取

使用天根生化科技(北京)有限公司的噬菌体基因组DNA/RNA提取试剂盒将分离纯化的噬菌体进行噬菌体基因组DNA的提取，并送至美吉生物(上海)股份有限公司进行测序。

3、噬菌体12VC501全基因组序列分析

经Pacbio平台的第三代基因组测序，所筛选的噬菌体12VC501全基因组序列全长为70732bp，为线性双链DNA。基因组序列在NCBI官网进行BLAST，比对结果显示，与最接近的弧菌噬菌体(GeneBank登录号：KC438282.1)基因组序列比对覆盖率为80％，同源性为94.82％；其次，与弧菌噬菌体(GeneBank登录号：NC_049350.1)基因组序列的比对覆盖率为79％，同源性为94.78％。噬菌体12VC501通过基因组比对鉴定是有尾噬菌体纲、Schitoviridae科的噬菌体新种，且全基因组已上传NCBI官网并获得GeneBank登录号OP313112.1。噬菌体12VC501已于2021年11月05日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211375。

过DNAMAN 7软件找出噬菌体12VC501基因组与两个同源性最高的噬菌体基因组序列的差异性片段，获得特异性基因片段VC1、VC2、VC3、VC4；再通过Primer Premier6软件，设计特异性PCR扩增引物，并送至博尚生物技术(上海)有限公司合成引物，结果如图5所示。

其中，特异性PCR扩增引物为：

VC1F:5’-CAGAACAAGGAACCAATGAC-3’；

VC1R:5’-CCGTGAACCAAGAACAGTA-3’；

VC2F:5’-ATTCCGCCGCAATAAGTC-3’；

VC2R:5’-GCCATCGCCAATCACATA-3’；

VC3F:5’-CACCGCTTACCTATCCATT-3’；

VC3R:5’-ACACATCTCCTTACCAACAT-3’；

VC4F:5’-TGAAGCAGGTGAGATTGTT-3’；

VC4R:5’-CATTGGTTGATTGTGGTGAA-3’；

其中，特异性基因片段为：

VC1:CAGAACAAGGAACCAATGACATTTCACCACCACGCCATTCACTATTCCATGA ATAACAATTACCACTAACTTTATGTTGGTAAAGCTTTGTGTAATTACCAATTTTAAATTTGAATTCAAAACCAAAATGTTCAATTGGGTTACTTGGTACATAAGCTTCAGATTTACAACCAAAGATAAATACAGATAGGAAAAGTAAAATAAACAAACTTAATTGTTTCATGAGTAATCACCTTTAAACGAATAACCGTCTACTGCTAGTAGGTTTAATACTGTTCTTGGTTCACGGVC2:ATTCCGCCGCAATAAGTCAGTTAGGTTGATGAACTTAATTTTAAAAAGAACT CCAGTTAACACTAGCGACACTGGTCAAATATTAGCTTTAGTGGATCAAGATAGAGCTCATATTTCTGGAGTGCAAATCGACGGCCTGTCTGGAACAGGGTCTGGGCTGATACTTTTTGCTGATGTAAATGACGCTGTGAAGTACGCTGTTCTCGAAAGCATTAATGTGAAGGGCGATTATAATAAGTCCTTGAACATGAATGGCGTGCTCATTGTTGATGGGGAGATGTGCTCAATAGATAAGGTTGTGGCTGAGGGTATCAGGGAGTTTGCAGTTGAGCTAAAAAACAAGTCGCGCAGAAATACGATCTCAAACGCATTGGTGAAAGATTCCAGAATTGGTATCGGCTTAGGGCAGGACACGCCTGACGCTTTCGACGCATCTTACAACTCAATAATTAATGGTGTTCTTTTTAATGTTGAGCGAGGCTATGTGATTGGCGATGGC

VC3:CACCGCTTACCTATCCATTAAGGAGATGGCTCAACTCTCTAAGGAGGTTAAC GATGCTGCTGTAGTACTAATGACTTACTATTTCCGTAAGGTTAAGACACCTAAGTTCGACTTCTTCGATGATGAAGCTATTGCACTGGCGCTGGGTTGGACTGTTCGTAAGACCAAA GCCACTCGCCAGCTTCTGGTAAAGGCTGACTGGTTAAAACGAATTACATTTACCCAGCCAACTACTAAAGCAAAGATTACAGTGCTCTATGTTGGTAAGGAGATGTGT

VC4:TGAAGCAGGTGAGATTGTTGATTACCGTTATGTAATGAATGACAACACTAAG AATGACATCCTACAACGTGATACATCTTTTGATGATGTAATGGGTATTATGTTCTCTGGTTTAGCTGTTAAGAATGACATTAAAAGAGAGAACAAAGAACTGGTTAAAGTTCTAAAAGATATGTATACCAATACACTTAACAGAACTGAGTTGTAGAGATTTCACCACAATCAACCAATG

综上，根据本发明的实施例，本发明从福建省漳州长泰县地区青虾塘水样分离筛选出噬菌体12VC501，其对霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等弧菌具有很高的杀菌活性，同时具有较广的噬菌谱，其能同时裂解6种不同种属的弧菌，能裂解44株霍乱弧菌，23株哈维氏弧菌，16株副溶血弧菌，15株溶藻弧菌，10株坎氏弧菌，8株创伤弧菌，能更有效的解决水产养殖中出现的多种细菌病害感染问题。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。