一种Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种新型Fc融合纳米抗体及其制备方法与应用。

背景技术

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（Cytotoxic T lymphocyte-associatedAntigen-4，CTLA-4）是一种免疫负调节因子，主要表达于活化T细胞表面，具有抑制T细胞的增殖与活化的功能。专利号ZL201610575258.3的发明专利，公开了一种利用噬菌体展示技术，成功筛选出针对CTLA-4的特异性纳米抗体16 （CTLA-4 Nb16），CTLA-4 Nb16 可增强树突细胞/肝癌融合细胞（DC/HepG2-FC）诱导的CD8

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服CTLA-4 Nb16纳米抗体半衰期短及生物学功能单一的不足，提供一种新型Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc及其制备方法与应用。

为了解决该技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc，其结构包含能够延长纳米抗体在体内的作用时间，介导ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应的Fc段的第一功能域；以及能够特异性结合并有效阻断T细胞表面免疫检查位点CTLA-4的第二功能域；所述第一功能域、所述第二功能域从N端到C端顺序连接。

优选地，所述第二功能域的抗CTLA-4 Nb16包含决定簇互补区CDR和框架区FR；所述第二功能域的决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；其中CDR1为SEQ ID No.1中的第26-35位氨基酸，CDR2为SEQ ID No.1中的第51-59位氨基酸，CDR3为SEQ ID No.1中的第97-106位氨基酸；

优选地，所述第一功能域Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.2，其GenBank的登录号为:AH007035.2；

优选地，所述第一功能域的Fc来源于人IgG1 Fc 片段，与所述抗CTLA-4纳米抗体16之间通过连接片段（Linker）连接；

优选地，所述连接片段为以G

所述G

所述Linker含有二个G

优选地，所述新型Fc融合蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。

本发明的新型Fc融合蛋白纳米抗体分子量小，穿透性强，抗原结合性能好且免疫原性弱，能够通过Fc段延长纳米抗体在体内的作用时间，保留了ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应，并能有效阻断T细胞表面CTLA-4分子，从而增强T细胞活化所需的信号；能够显著增强树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗诱导的特异性T淋巴细胞对靶细胞的杀伤能力，抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存时间。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码所述新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc；

优选地，编码所述CTLA-4 Nb16-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。

本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有所述多核苷酸。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其被所述表达载体所转化。

本发明的第五方面，提供一种药物组合物，其包含所述新型Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc和可药用载体。

本发明的第六方面，提供一种新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的制备方法，包括构建含有新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的基因序列的原核表达载体，然后将含有Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的基因序列的原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达和纯化，从而获得所述新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc，所述原核表达载体采用pET-30a（+）。

所述宿主菌采用E.coli Rosstta (DE3)。

本发明的第七方面，提供一种新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，包括采用基因工程技术，将高亲和力hCTLA-4 Nb16基因、hIgG1Fc片段基因通过柔性接头序列Ger4Ser相连，并插入用于纯化和鉴定的含标签蛋白基因His-tag，进行基因重组克隆，得到CTLA-4 Nb16-Fc重组基因序列的原核表达载体；然后将重组基因序列的原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达，收获、溶解包涵体，用His标签蛋白试剂盒纯化，并进行超滤浓缩从而获得所述新型Fc融合纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc；

采用BCA法测定超滤浓缩后的CTLA-4 Nb16-Fc（用ddH

（1）选取4-6周龄BALB/c裸鼠, 在右侧腋下皮下注射肿瘤细胞 HepG2或者MCF7或者C8161 100 μL，含有2 × 107个细胞/mL，分别构建肝癌、乳腺癌和黑色素瘤三个肿瘤模型；观察肿瘤的成瘤情况，包括出瘤率、肿瘤体积和成瘤时间；

（2）当小鼠瘤体积约为100 mm3时开始治疗，当天记为“Day 0”；选取出瘤情况一致，瘤体积大小相等的小鼠，将小鼠随机分为5组，每组5只；采取尾静脉注射给药，分别按照分组将药物用100 μL重悬进行治疗，每周给药2次，连续2周；观察小鼠肿瘤的治疗效果；

（3）在三种不同的荷瘤小鼠模型中，实验结果显示：CTLA-4 Nb16-Fc联合树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗共同诱导的CTLs过继治疗能够显著抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠生存时间。

有益效果

1.本发明所述的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc是以融合人 IgG1 Fc片段，并以纳米抗体作为结构基础的T细胞激动剂，该融合蛋白体积小，抗原结合性能好，容易基因工程改造和实现大量生产，免疫原性弱；以及引入的Fc片段可以与FcRn结合，从而克服纳米抗体在体内半衰期短、组织滞留少、血浆清除率快的缺点。此外，Fc段可介导额外的ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应，与CTLA-4 Nb16融合后，解决了原本纳米抗体生物功能单一的问题。采用原核细胞表达系统生产，其程序较传统单克隆抗体简单，且蛋白产量高，使用方便，可工业化生产，具有良好的发展前景且适于推广使用。

2.本发明所述的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc可延长纳米抗体在体内的作用时间，保留了ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应。同时，所述新型Fc融合蛋白纳米抗体（CTLA-4 Nb16-Fc）包含的抗CTLA-4纳米抗体能有效阻断CTLA-4介导的免疫抑制信号通路，消除其免疫抑制功能，诱导T细胞激动剂具有更高疗效，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1 CTLA-4 Nb16-Fc 的结构示意图。

图2 CTLA-4 Nb16-Fc的作用机制示意图。

图3A 为重组质粒pET-30a（+）- CTLA-4 Nb16-Fc示意图（A）和琼脂糖凝胶电泳图（B），其中，M表示Marker 泳道；2表示CTLA-4 Nb16-Fc双酶切产物泳道。

图4 为CTLA-4 Nb16-Fc蛋白SDS-PAGE分析图，其中M表示Marker泳道，1表示CTLA-4 Nb16-Fc蛋白泳道。

图5 为CTLA-4 Nb16-Fc蛋白Western blot分析图，其中M表示Marker泳道；1表示CTLA-4 Nb16-Fc蛋白泳道。

图6 显示 CTLA-4 Nb16-Fc的ELISA鉴定结果。

图7 显示CTLA-4 Nb16-Fc介导的T细胞对相应靶细胞的杀伤效应；A表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对靶细胞HepG2的杀伤效率；B表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对靶细胞MCF7的杀伤效率；C表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对靶细胞C8161的杀伤效率。

图8显示CTLA-4 Nb16-Fc介导的T细胞对相应皮下移植瘤生长的抑制作用；A表示在各实验分组介导的T细胞对HepG2皮下移植瘤生长的抑制作用；B表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对MCF7皮下移植瘤生长的抑制作用；C表示在不同效靶比作用下各实验分组介导的T细胞对C8161皮下移植瘤生长的抑制作用。

具体实施方式

本发明的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的结构包含能够延长纳米抗体在体内的作用时间，介导额外的ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应的Fc段的第一功能域，以及能够特异性结合并有效阻断T细胞表面CTLA-4分子的第二功能域，结构如图1所示。本发明的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的作用机制如图2所示。

在本发明的实施例中，CTLA-4 Nb16-Fc含有延长纳米抗体在体内的作用时间、介导ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应的第一功能域，以及一个能够特异性结合并有效阻断T细胞表面CTLA-4分子的第二功能域，所述第一功能域、第二功能域从N端到C端顺序连接；所述第一功能域为人 IgG1 Fc 片段，Fc的氨基酸序列为SEQ ID No.2，其GenBank的登录号为: AH007035.2。所述第二功能域为抗CTLA-4纳米抗体Nb16，其决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1为SEQ ID No.1中的第26-35位氨基酸；CDR2为SEQ ID No.1中的第51-59位氨基酸；CDR3为SEQ ID No.1中的第97-106位氨基酸。所述抗CTLA-4 Nb16与所述Fc之间通过连接片段连接，所述连接片段为以GGGGS为单元的柔性连接片段。本实施例所述的CTLA-4 Nb16-Fc新型融合蛋白不仅能延长纳米抗体在体内的作用时间，保留了ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应。同时， CTLA-4 Nb16-Fc包含的抗CTLA-4纳米抗体能有效阻断CTLA-4介导的免疫抑制信号通路，消除其免疫抑制功能，诱导T细胞更高效地分泌IL-2、TNF-α、IFN- γ等细胞因子发挥抗肿瘤作用，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的临床应用前景。

编码新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的多核苷酸。

本发明的编码新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的多核苷酸可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。

本发明的实施例中，编码所述CTLA-4 Nb16-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。

新型Fc融合蛋白纳米抗体（CTLA-4 Nb16-Fc）的表达载体。

本发明的表达载体含有编码CTLA-4 Nb16-Fc的多核苷酸。用本领域的技术人员熟知的方法能够构建本发明的表达载体；这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码CTLA-4 Nb16-Fc蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白。本发明的实施例中，所述表达载体采用pET-30a（+）；所述宿主菌采用E.coliRosstta (DE3)。

新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的制备方法。

本发明的制备前述CTLA-4 Nb16-Fc的方法，包括：构建含有CTLA-4 Nb16-Fc基因序列的表达载体，然后将含CTLA-4 Nb16-Fc基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的CTLA-4 Nb16-Fc。本发明的实施例中，所述表达载体采用pET-30a。所述宿主菌采用E.coli Rosstta (DE3)。

编码新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc的应用。

本发明的新型Fc融合蛋白纳米抗体CTLA-4 Nb16-Fc可用于制备肿瘤治疗药物。

实施例1: CTLA-4 Nb16-Fc的制备

1.CTLA-4 Nb16-Fc的构建

采用基因工程技术，将专利为L201610575258.3所筛选出的高亲和力CTLA-4 Nb16基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；以及能够延长血浆半衰期及介导ADCC、ADCP和CDC细胞毒性效应的Fc段的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；所述CTLA-4 Nb16纳米抗体与Fc段从N端到C端通过以GGGGS为单元的柔性连接片段（Linker）顺序连接。

2.CTLA-4 Nb16-Fc的多核苷酸的制备

为使 CTLA-4 Nb16在原核系统中进行表达，针对Fc、抗CTLA-4 Nb16序列均根据密码子优化原则进行了优化得到了CTLA-4 Nb16-Fc的核苷酸序列。具体地，CTLA-4 Nb16-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。

3.CTLA-4 Nb16-Fc的原核表达载体制备

通过PCR法将目的基因序列合成并扩增，并与酶切后的pET-30a（+）重组获得重组原核表达质粒pET-30a（+）-CTLA-4 Nb16-Fc，该质粒结构如图3A所示。具体地，采用酶切的方法对pET-30a（+）表达质粒进行酶切，酶切后琼脂凝胶电泳检测显示经酶切后片段大小约6213 bp，条带清晰。将酶切后的pET-30a（+）表达质粒与PCR法得到的目的序列重组，将重组后的原核表达质粒pET-30a（+）-CTLA-4 Nb16-Fc进行双酶切鉴定，结果显示CTLA-4 Nb16-Fc和载体的大小分别与重组之前一致，凝胶电泳结果如图3B所示。将获得的重组质粒pET-30a（+）-CTLA-4 Nb16-Fc转化至Rosetta（DE3）大肠杆菌中，将卡那霉素筛选出的阳性克隆菌株进行测序验证，经过比对基因序列正确。

4．CTLA-4 Nb16-Fc的表达

（1）活化菌种，从-80℃拿出冻存的甘油菌置于37℃水浴锅中，轻微摇动至完全溶解。无菌操作下打开盖子，用接种环从冻存管中沾取适量菌滴，划线接种于含KanR

（2）小枪头挑取单克隆菌落至20 mL含KanR

（3）按1:100比例转接于250 mL含KanR

（4）对照取样，取1 mL菌液至Ep管中离心取菌体沉淀，标明未诱导，冻存于-20 ℃。

（5）诱导：在剩余的菌液中加入IPTG，使其终浓度为0.5 mM，将试管置于37℃，200rpm进行低温诱导培养12 h。

（6）收集菌体沉淀之前取1mL菌液至Ep管中离心取菌体沉淀，冻存于-20 ℃。

（7）收集菌体沉淀，将诱导后的菌液于4℃，4000 g离心20min。弃上清液，收集菌体沉淀，秤湿重，冻存于-80 ℃。

（8）SDS-PAGE凝胶电泳分析：分别向对照样品、诱导后样品的菌体沉淀用100 μL无菌水重悬菌液，加入25μL 5× SDS 上样缓冲液，涡旋震荡混匀后置于金属浴中煮10 min，10000 g离心5 min，取5 μL上清液凝胶电泳检测诱导情况。

（9）解冻菌体沉淀，按每克菌体沉淀湿重加入4 mL非变性裂解液的比例加入非变性裂解液，充分重悬菌体。

（10）加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL、加入脱氧核糖核酸酶 I至终浓度为5 µg/mL，并加入适量的100×蛋白酶抑制剂，混匀后冰上放置30 min。

（11）冰上超声裂解细菌：首先用超声仪超声水，水洗超声仪探头。超声菌液的条件为：功率30%，工作5 s，间隔8 s，持续15 min。至菌液不再黏稠即可。结束后水洗超声仪探头。

（12）4℃，12000 g离心30 min，收集细菌裂解液上清置于冰上。取1 mL上清至Ep管，存于-20 ℃，后续待用。

（13）洗涤包涵体，将裂解后的菌体沉淀，用1× PBS洗涤一次。

（14）溶解包涵体，沉淀用8M Urea的溶菌平衡缓冲液溶解包涵体，室温震荡60min，4℃ 12000 g离心30 min弃沉淀。

5.CTLA-4 Nb16-Fc的纯化

（1）平衡凝胶：取1 mL混合均匀的50% 凝胶储存液4ºC，1000 g瞬时离心弃去储存液，向凝胶中加入0.5 mL 溶菌平衡缓冲液混匀以平衡凝胶，4ºC，1000 g瞬时离心弃去液体，重复2次，弃去液体。

（2）将约4 mL细菌裂解液的上清加入凝胶中，于4ºC条件下，摇床上缓慢摇动1 h，得到凝胶和细菌裂解液的混合物。

（3）将凝胶和细菌裂解液的混合物装入亲和层析柱管中。

（4）将柱管底部的盖子打开，重力作用下使纯化柱内液体流出，收集穿流液并重复上柱4次以充分结合目的蛋白，收集20 μL穿流液作后续分析用。

（5）咪唑的洗涤和收集：分别用20 mM IM、50 mM IM、100 mM IM、250 mM、500 mMIM含有8 M Urea的洗脱液洗脱，收集流出液到不同的离心管中。

（6）纯化检测，对粗蛋白液、洗涤液、洗脱液分别处理制样，跑SDS-PAGE验证蛋白是否纯化出。

（7）将纯化出的蛋白质溶于洗脱缓冲液中，将其放入处理后的透析袋，按照复性缓冲液1/洗脱缓冲液比例为1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:0进行梯度透析，最后于复性缓冲液2中处理12 h。

最终纯化后的CTLA-4 Nb16-Fc蛋白使用SDS-PAGE分析，通过考马斯亮蓝染色来显示蛋白条带，然后使用Image Lab软件检测条带所占的比例。凝胶电泳结果由图4可知，SDS-PAGE电泳显示在分子量约39 kDa位置处有明显可见的蛋白条带（箭头所示），而且具有95%的纯度。

采用Western blot进一步鉴定纯化后的CTLA-4 Nb16-Fc蛋白，通过Western blot步骤操作，显色试剂盒显色。WB结果由图5可知，Western blot结果显示在分子量约39 kDa位置处有明显可见的蛋白条带（箭头所示），表明该蛋白为CTLA-4 Nb16-Fc。

实施例2：ELISA检测CTLA-4 Nb16-Fc与人CTLA-4蛋白的结合能力

（1）包被：用0.05 M的Na

（2）封闭：于37℃恒温箱用3% BSA封闭液封闭1 h。甩去板孔中的液体，每孔加入300 μL的1× PBST，静置1 min，甩去板孔中的液体，吸水纸上大力拍干，1× PBST重复洗涤3次。

（3）实验分组：分为PBS组，Irr Nb16-Fc组，CTLA-4 Nb16，CTLA-4 Nb16-Fc组和CTLA-4 mAb组，将CTLA-4 Nb16-Fc组按照系列倍比进行稀释。

（4）加一抗：加入系列倍比稀释的CTLA-4 Nb16-Fc，最高浓度为500 ng/mL，稀释后浓度依次为：250 ng/mL，125 ng/mL，62.5 ng/mL，31.3 ng/mL，15.6 ng/mL，8 ng/mL，4 ng/mL，每孔加100 μL，设3个复孔，37℃恒温箱孵育1 h。甩去板孔中的液体，每孔加入300 μL的1× PBST，静置1 min，甩去板孔中的液体，吸水纸上大力拍干，1× PBST重复洗涤5次。同样，向PBS组采用相同方法加一抗。

（5）加二抗：向PBS组，Irr Nb16-Fc组，CTLA-4 Nb16，CTLA-4 Nb16-Fc组加入稀释好的HRP标记的抗His tag二抗，另外向CTLA-4 mAb组加入稀释好的HRP标记的羊抗兔抗IgG二抗，每孔100 μL，37℃恒温箱孵育30 min。甩去板孔中的液体，每孔加入300 μL的1×PBST，静置1 min，甩去板孔中的液体，吸水纸上大力拍干。用1× PBST重复洗涤7次。

（6）显色：每孔加入新鲜配置的TMB显色液100 μL，37℃避光孵育15 min。

（7）测OD450值：每孔加入50 μL终止液，15 min内测定各孔的OD450值。

ELISA结果由图6可知，CTLA-4 Nb16-Fc可以与hCTLA-4蛋白结合。

实施例3：CTLA-4 Nb16-Fc介导的细胞杀伤实验

（1）收集靶细胞：当靶细胞长满达到90%的时候，收集靶细胞，然后对靶细胞进行染色并进行细胞计数，加入完全DMEM培养基调细胞浓度为1×10

（2）按照1:1，10:1，20:1的效靶比，在24孔板中加入不同组别相应数量的效应T淋巴细胞。

（3）按照实验设计与分组加入CTLA-4 Nb16-Fc及其他对照，然后加入完全RPMI1640培养基至体积为500 μL/孔，每组设置3个复孔。另设置最大释放孔和自然释放孔，将细胞置于37℃，5% CO

（4）将各组细胞1500 rpm/min，离心15 min收集细胞，弃掉上清液，加入100 μL 1× PBS重悬细胞，然后加入5 μL PI染液，充分混匀，于室温避光孵育30 min，使用1× PBS重复洗涤2次，加入500 μL 1× PBS 重悬细胞后上流式细胞仪检测。

（5）同时准备未染色空白管和未做任何处理的单染管，各1×10

（6）根据杀伤公式计算T细胞对相应靶细胞的杀伤效率。杀伤效率（%）=（实验孔-自然释放孔）/（最大释放孔-空白孔）×100%。

结果如图7显示，CTLA-4 Nb16-Fc组对HepG2、MCF7和C8161靶细胞的杀伤作用最强，高于对照组的杀伤比率。而且随着效靶比增大而对靶细胞杀伤比率增高。

实施例4：CTLA-4 Nb16-Fc介导的皮下移植瘤抑制实验

（1）收集处于对数生长期的HepG2、MCF7和C8161细胞，PBS清洗两遍，然后用预冷的PBS调整细胞密度为2 × 10

（2）4周龄BALB/c裸鼠, 在右侧腋附近皮下注射HepG2、MCF7和C8161细胞100 μL。开始观察肿瘤的成瘤情况，包括出瘤率、肿瘤体积和成瘤时间。

（3）当小鼠瘤体积约为100 mm

（4）分别按照分组情况从尾静脉注射药物100 μL进行治疗。在治疗过程中，每周给予药物2次，治疗时间共2周。分组情况及给药情况：jPBS组: PBS 100 μL/只；k树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7, C8161)融合疫苗组：树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7,C8161)融合疫苗诱导的CD8

（5）从治疗时间起，每隔3天测量小鼠的体重，并用游标卡尺测量肿瘤的长度（L）与宽度(W)，按照公式 V（mm

（6）从第一次治疗当天开始计算，30天后，进行小鼠眼球取血，并剥离瘤体，称量瘤体重量，并按公式计算抑瘤率（抑瘤率=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组瘤），根据记录绘制小鼠肿瘤体积生长曲线。

（7）另一组小鼠采取同样的处理方法，观察小鼠的存活时间分析其生存率。

结果如图8显示，树突状细胞/肿瘤细胞(HepG2, MCF7, C8161)融合疫苗+CTLA-4Nb16-Fc诱导的CD8