一种用于抗生素增效的超支化聚赖氨酸的制备方法

技术领域

本发明属于抗细菌药物技术领域，具体涉及一种用于抗生素增效的超支化聚赖氨酸及其制备方法。

背景技术

抗生素耐药性对全球健康的威胁越来越大，多重耐药性的发展严重损害了抗生素的疗效，特别是在革兰氏阴性细菌和病原体相关感染方面。革兰氏阴性菌已经进化出对最后一道防线抗生素粘菌素的耐药性，因此我们迫切需要采取替代战略来解决此类感染问题。

目前已经开发出多种抗生素佐剂，例如克拉维酸和β-内酰胺类抗生素的组合，以增强抗生素的疗效或延迟耐药性的出现。非抗生素化合物，如曲霉胺和他汀类药物，分别对革兰氏阴性病原体和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表现出特异的抗生素敏感性。例如，甘氨酸碱性肽作用于大肠杆菌膜，诱导细胞受损，影响了外膜的通透性，从而提高了低浓度大肠杆菌对两种疏水性抗生素红霉素和利福平的敏感性。这些组合方法能够延长现有抗生素的使用寿命，并填补抗生素发现的空白。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种超支化聚赖氨酸及其制备方法。

本发明所提供的超支化聚赖氨酸是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

将L-赖氨酸盐酸盐与碱混合均匀，在负压条件下进行超支化赖氨酸的聚合反应，得到所述的超支化聚赖氨酸。

上述方法中，所述L-赖氨酸盐酸盐与氢氧化钾的摩尔比可为1:0.5-1.5，具体如1:1。

上述方法中，所述碱可选自下述至少一种：KOH、NaOH、LiOH、CsOH。

上述方法中，所述聚合反应的通常在120-200℃，优选130-180℃，更优选150-170℃，进一步优选150-160℃的温度下进行；反应时间根据所需分子量变化且通常为至少1小时，优选至少3小时，非常优选至少6小时，尤其是至少9小时，通常反应持续不超过48小时。

所述负压的条件为-0.02至-0.1Mpa。

根据本发明的一个实施例，所述聚合反应的反应条件可为：160℃，-0.1MPa的负压条件下反应6小时。

上述方法，所述聚合反应的反应过程中，水蒸气经由负压抽出，冷凝收集。

上述方法，所述聚合反应反应结束后还包括下述步骤：反应产物冷却至室温，加入去离子水溶解，溶解后的产物用截留分子量为500的透析袋透析，透析3-4天后，于真空冷冻干燥机中冻干，得到超支化聚赖氨酸。

本发明的另一个目的是提供上述超支化聚赖氨酸的应用。

本发明所提供的超支化聚赖氨酸的应用是其在制备抗生素增效剂中的应用。

所述抗生素具体可为粘杆菌素、红霉素或利福平。

所述抗生素增效剂能够增强抗生素的抑菌活性和/或杀菌活性。

进一步的，所述抑菌活性和/或杀菌活性为对下述至少一种病原菌具有抑制和/或杀灭作用：1、革兰氏阴性细菌；2、变形菌门细菌；3、γ-变形菌纲细菌；4、肠杆菌目细菌或假单胞菌目细菌；5、肠杆菌科细菌或假单胞菌科细菌；6、埃希氏菌属细菌或假单胞菌属细菌；7、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌或沙门氏菌。

更具体的，所述病原菌选自下述至少一种：鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、铜绿假单胞菌。

本发明提供的超支化聚赖氨酸为赖氨酸盐酸盐通过化学法合成的聚赖氨酸高纯度组合物，用于处理人或动物的食源/饲料源致病菌，增加细胞膜通透性，降低粘杆菌素使用，减少细菌感染。

本发明再一个目的是提供一种抗菌组合物。

所述抗菌组合物，包括抗生素和本发明提供的超支化聚赖氨酸。

进一步的，所述抗生素为粘杆菌素，具体为硫酸粘杆菌素，其CAS号：1264-72-8。

所述抗菌组合物中，硫酸粘杆菌素与超支化聚赖氨酸的质量比为1:(0.78-100)

对于抑制大肠埃希菌而言，所述抗菌组合物中，硫酸粘杆菌素与超支化聚赖氨酸的质量比为0.25：(3.125-6.25)；

对于抑制沙门氏菌而言，所述抗菌组合物中，硫酸粘杆菌素与超支化聚赖氨酸的质量比为2：(0.78-1.56)；

对于抑制铜绿假单胞菌而言，所述抗菌组合物中，硫酸粘杆菌素与超支化聚赖氨酸的质量比为1：(6.25-12.5)；

进一步的，所述抗生素为红霉素。

所述病原菌为大肠埃希菌，所述抗菌组合物中，红霉素与超支化聚赖氨酸的质量比为8：(6.25-12.5)；

进一步的，所述抗生素为利福平。

所述病原菌为沙门氏菌，所述抗菌组合物中，利福平与超支化聚赖氨酸的质量比为2：(6.25-12.5)。

上述抗菌组合物可对下述至少一种病原菌具有杀灭和/或抑制作用：1、革兰氏阴性细菌；2、变形菌门细菌；3、γ-变形菌纲细菌；4、肠杆菌目细菌或假单胞菌目细菌；5、肠杆菌科细菌或假单胞菌科细菌；6、埃希氏菌属细菌或假单胞菌属细菌；7、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌或沙门氏菌。

更具体的，所述病原菌选自下述至少一种：鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、铜绿假单胞菌。

此外，含有上述抗菌组合物的抗菌产品也属于本发明的保护范围。

上述抗菌产品的剂型可为下述任意一种：片剂、乳膏、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型、冻干粉针剂型。

本发明基于超支化聚合物的一锅合成方法，开发了具有新颖结构的超支化聚赖氨酸，并且6小时合成产物(lys-6h)对所有测试的革兰氏阴性病原菌都具有协同增效粘杆菌素抗菌活性的能力，将大大有利于细菌感染的治疗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的超支化聚赖氨酸采用一锅法合成，相比于现有技术如生物合成的ε-聚赖氨酸，化学合成的α-聚赖氨酸，本发明的超支化聚赖氨酸合成步骤更简单，成本更低廉。

本发明合成的超支化聚赖氨酸没有明显的抗菌活性方面效果，但在与抗生素协同增效方面具有显著优势。更因为其本身没有明显的抑菌效果且不是抗生素，只是对已有抗生素的增效，因而不容易诱导耐药性的形成。因此，本发明的超支化聚赖氨酸可以作为一种新型的抗生素辅助治疗剂，用于协同抗生素治疗感染疾病，且具有减少耐药性形成的潜力。本发明安全性评估表明在抗生素协同浓度下，没有明显的细胞毒性和溶血性。

附图说明

图1为实施例1制备的超支化聚赖氨酸结构分布示意图以及制备的超支化聚赖氨酸实际样品；

图2为实施例1制备的超支化聚赖氨酸的核磁共振氢谱；

图3为实施例1制备的超支化聚赖氨酸的从1H-13C HSQC核磁图谱；

图4为傅里叶红外光谱图，其中，1.KOH 2.lys-6H 3.lys.HCl；图中从上至下依次为1,2,3对应的傅里叶红外光谱图；

图5为实施例1制备的超支化聚赖氨酸的质谱图；

图6为单体赖氨酸盐酸盐和超支化聚赖氨酸的X射线衍射分析；

图7为超支化聚赖氨酸的示差扫描热量图；

图8为超支化聚赖氨酸和粘杆菌素联用于三种革兰氏阴性致病菌的生长曲线图；a.b.为大肠杆菌O157，c.d.为鼠伤寒沙门氏菌，e.f.为铜绿假单胞菌；

图9为超支化聚赖氨酸和红霉素联用作用于大肠杆菌O157的生长曲线图；

图10为超支化聚赖氨酸和利福平联用作用于鼠伤寒沙门氏菌的生长曲线图；

图11为不同浓度聚赖氨酸对鼠伤寒沙门氏菌生物膜的影响；

图12为不同浓度聚赖氨酸对Vero细胞的存活率；

图13为不同浓度聚赖氨酸对绵羊血细胞的溶血率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述试验中所用的病原菌：

鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium(菌株编号：CICC 22956购买公司：中国工业微生物菌种保藏管理中心)

大肠埃希氏菌Escherichia coli O157：H7(菌种编号：CICC 10907购买公司：中国工业微生物菌种保藏管理中心)

铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAO1(购自：ATCC美国细胞系资源中心菌种编号：ATCC 27853)

非洲绿猴肾细胞Vero细胞(细胞编号：ATCC CCL-81，购自武汉普诺赛生命科技有限公司)

绵羊血细胞(新鲜无菌脱纤维羊血，购自北京陆桥技术股份有限公司)

下述实施例中使用的粘杆菌素为硫酸粘杆菌素，其CAS号：1264-72-8

实施例1：超支化聚赖氨酸的负压制备

将L-赖氨酸盐酸盐(33g，180mmol)与氢氧化钾(9.9g，180mmol)以等摩尔的比例混合均匀，加到250mL圆底烧瓶中，160℃，-0.1MPa的负压条件下反应6小时，进行超支化赖氨酸的聚合反应。反应过程中，水蒸气经由负压抽出，冷凝收集。反应结束后，反应产物冷却至室温，加入100mL去离子水溶解，溶解后的产物用截留分子量为500的透析袋透析，透析3-4天后，于真空冷冻干燥机中冻干，得到2g超支化聚赖氨酸。纯度为100％。

图1为超支化聚赖氨酸结构分布示意图(a)以及制备的超支化聚赖氨酸聚赖实际样品(b)。

实施例2：超支化聚赖氨酸的物化性质测定

采用核磁共振光谱(布鲁克)，检测聚赖氨酸的1H，13C，HSQC，进行物质结构解析。

超支化聚赖氨酸的核磁共振氢谱见图2。由图2可知，聚赖氨酸的连接方式包括树枝状和直链组成的分支化结构。通过氢谱和二维谱图，标记出超支化聚合物中的α-CH和ε-CH中氢。赖氨酸化聚合物的光谱显示出4.11、3.88、3.36和3.26ppm处的共振分别对应于树枝状、α线性、末端和ε线性单元的α-CH质子，通过对这些峰进行积分，计算出结构参数分支度DB和平均分支数ANB分别为0.507和0.4075，表明合成了超支化的聚赖氨酸。计算公式如下：

DB＝D+T/D+L+T

ANB＝D/D+L

超支化聚赖氨酸的从1H-13C HSQC核磁图谱见图3。从1H-13C HSQC核磁图谱上看出，共聚物中超支化赖氨酸和线性赖氨酸的α-CH可以很好的区分。如图3所示，(4.11,53.90)ppm处为聚合物结构中的树支化点，(3.83,55.78)ppm处则是α-linear线性单元(α-linear unit)，(3.33,53.90)ppm处为树枝末端点，(3.24,54.22)ppm处则是ε-linear线性单元(ε-linear unit)，(3.10,38.59)ppm处则是环状二聚体结构中ε-亚甲基(ε-CH

采用傅里叶红外光谱仪(布鲁克，型号为VERTEX 70V；HYPERION 2000；)，溴化钾压片法，检测聚赖氨酸在中红外(4000cm

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)(Ultraflextreme,Brucker,Germany)在线性模式下检测。结果如图5所示，根据质谱结果，可得聚赖氨酸的分子量为4102Da。

X射线衍射仪(XRD)型号为Miniflex 600，Rigaku，Japan，扫描角范围5-70°，扫描速率4°/min，采用xrd检测物质反应前后变化。结果如图6所示，根据xrd结果，可得反应前的赖氨酸盐酸盐有明显的峰，表明单体是以晶体的形式存在的，反应结束后看到反应产物没有明显的峰，因为生成了非定型晶体的超支化聚L-赖氨酸。

利用热分析仪(HQT-3，北京恒久)对聚赖氨酸进行热重分析以初步确定热解温度范围。具体测定条件为：N

实施例3：超支化聚赖氨酸的活性测定

1.聚赖氨酸透化革兰氏阴性菌

把鼠伤寒沙门氏菌(CICC 22956)培养至OD

表1沙门氏菌被聚赖氨酸透化后NPN荧光值与NPN摄取系数

2.超支化聚赖氨酸协同增效粘杆菌素

采用棋盘法评估化合物与抗菌药物的联用是否具有协同作用，以及化合物对抗菌药物的增效活性。首先平板划线三种革兰氏阴性致病菌鼠伤寒沙门氏菌(CICC 22956)、大肠杆菌O157(CICC 10907)、铜绿假单胞菌PAO1(ATCC 27853)，然后挑取单菌落接种于MHB培养基中，置于37℃、180rpm/min震荡培养箱中培养至细菌指数生长期，用MHB调至OD

3.超支化聚赖氨酸协同增效红霉素

采用棋盘法评估化合物与抗菌药物的联用是否具有协同作用，以及化合物对抗菌药物的增效活性。首先平板划线大肠杆菌O157(CICC 10907)，然后挑取单菌落接种于MHB培养基中，置于37℃、180rpm/min震荡培养箱中培养至细菌指数生长期，用MHB调至OD 600nm＝0.5，最后将待测菌株菌落数稀释到10 

4.超支化聚赖氨酸协同增效利福平

采用棋盘法评估化合物与抗菌药物的联用是否具有协同作用，以及化合物对抗菌药物的增效活性。首先平板划线鼠伤寒沙门氏菌(CICC 22956)，然后挑取单菌落接种于MHB培养基中，置于37℃、180rpm/min震荡培养箱中培养至细菌指数生长期，用MHB调至OD600nm＝0.5，最后将待测菌株菌落数稀释到10 

5.超支化聚赖氨酸抗生物膜

取100μL、10

实施例4：聚赖氨酸毒性测定

1.聚赖氨酸的细胞毒性

使用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)并采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)(VWR,Lutterworth,UK)方法测定实施例1制备的超支化聚赖氨酸的细胞毒性，具体操作如下：细胞在添加10％胎牛血清和1％青霉素的Dulbecco改良Eagle’s培养基(MEM)中，37℃、5％ CO

2.聚赖氨酸的溶血毒性

Lys-6h和粘菌素的溶血活性测定，首先用新鲜，无菌，去纤维化的绵羊血(北京陆桥技术)制备绵羊血细胞。用不同浓度的Lys-6h或粘菌素处理，范围从0μg/mL至100μg/mL(0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)在37℃下处理4小时。磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，在存在或不存在0.2％Triton X-100的情况下，分别用作阳性和阴性对照。通过酶标仪在576nm处测量释放血红蛋白的吸收。从溶血率的结果(图13)来看，剂量小于等于25μg/mL时溶血率小于5％，认为没有明显的溶血毒性。