一种绿色环保的血液制品免疫电泳鉴别方法

技术领域

本发明涉及血液制品质量控制技术领域，具体涉及一种绿色环保的血液制品免疫电泳法鉴别方法。

背景技术

免疫电泳法是指利用凝胶电泳与双向免疫扩散两种技术结合的实验方法。在电场作用下标本中各组分因电泳迁移率不同而分成区带，然后沿电泳平行方向将凝胶挖沟槽，将抗体加入沟槽内，使抗原与抗体相互扩散而形成沉淀线，根据沉淀线的数量、位置及形状，以分析标本中所含组分的性质。

依据《中国药典》2020年版通则3404免疫电泳法记载，血液制品鉴别试验-免疫电泳法主要用于成品检定中的鉴别试验，例如人血白蛋白产品，采用此法与正常人血清或血浆比较，主要沉淀线应为白蛋白，而球蛋白产品的主要沉淀线为球蛋白，该法分辨率高，灵敏度高，时间短，用于鉴定蛋白质种类及纯度。其中电泳缓冲液是影响免疫电泳试验的主导因素。《中国药典》2020年版通则3404免疫电泳法中，需配制1500mL巴比妥缓冲液（pH 8.6）作为电泳缓冲液，巴比妥缓冲液的配方物料巴比妥、巴比妥钠、叠氮钠均为毒性危险化学品，获取难度大、购置及管控处理风险高，易产生环境污染；同时该方法中使用氨基黑染色及乙醇冰醋酸脱色，试剂刺激性大，易污染环境。

发明内容

针对现有免疫电泳法中使用的电泳缓冲液获取难度大、风险高，缓冲液、染色液及脱色液易产生环境污染，本发明提供一种绿色环保的血液制品免疫电泳鉴别方法，避免毒性试剂的使用，采用凝胶成像系统图像反相技术分析供试品中的成分及其性质，减少了环境污染。

具体技术方案如下：

一种绿色环保的血液制品免疫电泳鉴别方法，包括制板、加样、电泳、扩散、浸泡、成像；采用Tris缓冲液作为电泳缓冲液，通过电泳分离和双相免疫扩散，形成可见的沉淀弧；采用凝胶成像系统图像反相技术分析血液制品中的成分及其性质。

进一步的，Tris缓冲液pH值为8.0~9.0，浓度为0.1mol/L，临用新制。

进一步的，Tris缓冲液的制备方法为：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，加纯化水400mL，搅拌溶解，并稀释至500mL，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0~8.6，即得。适量盐酸赖氨酸的加入增加了缓冲液溶液离子强度，稳定缓冲液pH。

进一步的，Tris缓冲液的制备方法为：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g、氯化钠5.8g、乙二胺四乙酸二钠0.37g，再加纯化水溶解使成500mL，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至9.0，即得。氯化钠具有盐平衡，防止电泳过程蛋白结构遭破坏的作用；盐酸赖氨酸、乙二胺四乙酸二钠可以使球蛋白在低酸（pH 4.0）时有效抵抗pH的改变。

进一步的，具体包括以下步骤：

（1）制板：制备琼脂糖凝胶板，于琼脂糖凝胶板负极1/3分界线上等距打三个孔，两侧的孔为测定孔，中间的孔为对照孔；

（2）加样：向测定孔加供试品溶液10µL和溴酚蓝指示液1滴，对照孔加正常人血清或血浆10µL和溴酚蓝指示液1滴；

（3）电泳：电泳前1小时开启循环冷却系统，用3层滤纸搭桥和电泳缓冲液接触，开启电泳, 直到观察指示剂迁移到前沿；

（4）扩散：电泳结束后，在相邻两孔之间距离两端3~5mm处挖宽3mm的抗体槽，向槽中对应加入人血清抗体或人血浆抗体，槽满但不溢出，放湿盒中37℃水浴扩散24小时；

（5）浸泡：扩散完毕后，用0.90%氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，以除去未结合蛋白质；

（6）采用凝胶成像系统图像反相技术对浸泡好的琼脂糖凝胶板进行图像分析，判定结果。

进一步的，电泳电压设计150V~200V恒压，电泳时间2~4小时。

进一步的，琼脂糖凝胶板的制备方法为：将完全溶胀的1.5%琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上，厚度3mm，静置，待凝固成无气泡的均匀薄层，制得琼脂糖凝胶板。

进一步的，1.5%琼脂糖溶液制备方法为：采用纯化水:Tris缓冲液按照体积比1:1混合，加入琼脂糖粉末，加热使琼脂糖溶胀完全。

进一步的，扩散完毕后的琼脂糖凝胶板用0.90%氯化钠溶液浸泡72小时，每间隔24小时换液1次，共换液2次。

进一步的，凝胶成像系统采用高像素专业数字CCD摄像头，分析图像更清晰，分辨率更高。用成像技术替换了传统的氨基黑染色及乙醇冰醋酸脱色步骤，减少环境污染、人员伤害以及实验安全隐患。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的血液制品免疫电泳鉴别方法，通过选择绿色环保的电泳缓冲液，调整电泳缓冲液配方、电泳电压及电泳时间，细化操作细节例如琼脂糖凝胶板换液次数，通过凝胶成像系统图像反相技术分析判定结果，得到与《中国药典》2020年版3404免疫电泳法相同的鉴定效果，同时避免使用有毒有害试剂巴比妥和巴比妥钠、染色剂及脱色剂，减少环境污染、人员伤害以及实验安全隐患。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1的免疫电泳结果示意图。

图2是本发明对比例1的免疫电泳结果示意图。

图3是本发明实施例2的免疫电泳结果示意图。

图4是本发明实施例3的免疫电泳结果示意图。

图中，1、琼脂糖凝胶板；2、测定孔；3、对照孔；4、抗体槽；5、正常人血清人白蛋白沉淀弧，6、正常人血清球蛋白沉淀弧；7、供试品A白蛋白沉淀弧；8、供试品B球蛋白沉淀弧。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明实施例中使用的试验材料来源如下：

琼脂糖购自SIGMA；三羟甲基氨基甲烷购自国药集团化学试剂有限公司；正常人血清购自海伦娜；氨基黑10B购自国药集团化学试剂有限公司；乙醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司；冰醋酸购自台山市新宁有限公司。

本发明实施例中使用的Tris缓冲液的配制方法如下：

Tris缓冲液（pH=8.0）：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，加纯化水400mL，搅拌溶解，并稀释至500mL，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0，即得。

Tris缓冲液（pH=8.6）：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，加纯化水400mL，搅拌溶解，并稀释至500mL，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.6，即得。

Tris缓冲液（pH=9.0）：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g、氯化钠5.8g、乙二胺四乙酸二钠0.37g，再加纯化水溶解使成500mL，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至9.0，即得。

本发明实施例中使用的凝胶成像系统为美国BIO-RAD伯乐ChemiDoc XRS+凝胶成像系统，采用高像素专业数字CCD摄像头。

实施例1

（1）制板：采用纯化水:Tris缓冲液（pH=8.6）按照体积比1:1混合，加入琼脂糖粉末，加热使琼脂糖溶胀完全，制得1.5%琼脂糖溶液；将完全溶胀的1.5%琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上，厚度3mm，静置，待凝固成无气泡的均匀薄层，制得琼脂糖凝胶板；于琼脂糖凝胶板负极1/3分界线上等距打三个孔，两侧的孔为测定孔，中间的孔为对照孔。

（2）加样：将供试品A（来源：山东泰邦生物制品有限公司，规格：蛋白质含量20%）从2~8℃取出平衡至室温，用氯化钠注射液稀释将供试品蛋白质浓度稀释至0.5%，作为供试品溶液；测定孔加供试品溶液10µL和溴酚蓝指示液1滴，对照孔加正常人血清10µL和溴酚蓝指示液1滴。

（3）电泳：Tris缓冲液（pH=8.6）作为电泳缓冲液，电泳前1小时开启循环冷却系统，用3层滤纸搭桥和电泳缓冲液接触，150V恒压电泳4小时，观察到指示剂迁移到前沿。

（4）扩散：电泳结束后，在相邻两孔之间距离两端3mm处挖宽3mm的抗体槽，向槽中加入人血清抗体，槽满但不溢出，放湿盒中37℃水浴扩散24小时。

（5）浸泡：扩散完毕后，用0.90%氯化钠溶液浸泡琼脂糖凝胶板72小时，每间隔24小时换液1次，共换液2次，以除去未结合蛋白质。

（6）采用凝胶成像系统图像反相技术对浸泡好的琼脂糖凝胶板进行图像分析，判定结果。

结果如图1所示，与正常人血清生成的沉淀弧的位置和形状相比，可以判断主要沉淀线为白蛋白，因此该供试品A为白蛋白产品。

对比例1

与实施例1的不同之处在于：依据《中国药典》2020年版通则中的3404免疫电泳法，使用巴比妥缓冲液（pH=8.6）代替Tris缓冲液（pH=8.6）制备琼脂糖凝胶板，并以巴比妥缓冲液（pH=8.6）作为电泳缓冲液；使用氨基黑进行染色、乙醇冰醋酸进行脱色，不采用凝胶成像系统图像反相技术；其它处理均相同。

结果如图2所示，与正常人血清生成的沉淀弧的位置和形状相比，可以判断主要沉淀线为白蛋白，因此该供试品A为白蛋白产品。

由实施例1和对比例1的鉴定结果可知，本发明提供的血液制品免疫电泳鉴别方法取得了与《中国药典》2020年版通则中的3404免疫电泳法相同的鉴定结果，而且本发明避免了使用有毒有害试剂巴比妥和巴比妥钠、染色剂及脱色剂，减少了环境污染、人员伤害以及实验安全隐患。

实施例2

（1）制板：采用纯化水:Tris缓冲液（pH=8.0）按照体积比1:1混合，加入琼脂糖粉末，加热使琼脂糖溶胀完全，制得1.5%琼脂糖溶液；将完全溶胀的1.5%琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上，厚度3mm，静置，待凝固成无气泡的均匀薄层，制得琼脂糖凝胶板；于琼脂糖凝胶板负极1/3分界线上等距打三个孔，两侧的孔为测定孔，中间的孔为对照孔。

（2）加样：将供试品A从2~8℃取出平衡至室温，用氯化钠注射液稀释将供试品蛋白质浓度稀释至0.5%，作为供试品溶液；测定孔加供试品溶液10µL和溴酚蓝指示液1滴，对照孔加正常人血清10µL和溴酚蓝指示液1滴。

（3）电泳：Tris缓冲液（pH=8.0）作为电泳缓冲液，电泳前1小时开启循环冷却系统，用3层滤纸搭桥和电泳缓冲液接触，170V恒压电泳4小时，观察到指示剂迁移到前沿。

（4）扩散：电泳结束后，在相邻两孔之间距离两端4mm处挖宽3mm的抗体槽，向槽中加入人血清抗体，槽满但不溢出，放湿盒中37℃水浴扩散24小时。

（5）浸泡：扩散完毕后，用0.90%氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板72小时，每间隔24小时换液1次，共换液2次，以除去未结合蛋白质。

（6）采用凝胶成像系统图像反相技术对浸泡好的琼脂糖凝胶板进行图像分析，判定结果。

结果如图3所示，与正常人血清生成的沉淀弧的位置和形状相比，根据判断主要沉淀线为白蛋白，因此该供试品A为白蛋白产品。

实施例3

（1）制板：采用纯化水:Tris缓冲液（pH=9.0）按照体积比1:1混合，加入琼脂糖粉末，加热使琼脂糖溶胀完全，制得1.5%琼脂糖溶液；将完全溶胀的1.5%琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上，厚度3mm，静置，待凝固成无气泡的均匀薄层，制得琼脂糖凝胶板；于琼脂糖凝胶板负极1/3分界线的上中下各打一孔，分别为测定孔、对照孔、测定孔。

（2）加样：将供试品B（来源：山东泰邦生物制品有限公司，规格：蛋白质含量5%）从2~8℃取出平衡至室温，用氯化钠注射液稀释将供试品蛋白质浓度稀释至0.5%，作为供试品溶液；测定孔加供试品溶液10µL和溴酚蓝指示液1滴，对照孔加正常人血清10µL和溴酚蓝指示液1滴。

（3）电泳：Tris缓冲液（pH=9.0）作为电泳缓冲液，电泳前1小时开启循环冷却系统，用3层滤纸搭桥和电泳缓冲液接触，200V恒压电泳2小时，观察到指示剂迁移到前沿。

（4）扩散：电泳结束后，在相邻两孔之间距离两端5mm处挖宽3mm抗体槽，向槽中加入人血清抗体，槽满但不溢出，放湿盒中37℃水浴扩散24小时。

（5）浸泡：扩散完毕后，用0.90%氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板72小时，每间隔24小时换液1次，共换液2次，以除去未结合蛋白质。

（6）成像：采用凝胶成像系统图像反相技术对浸泡好的琼脂糖凝胶板进行图像分析，判定结果。

结果如图4所示，与正常人血清生成的沉淀弧的位置和形状相比，可以判断主要沉淀线为球蛋白，因此该供试品B为球蛋白产品。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。