一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法。

背景技术

吡咯喹啉醌(PQQ)是一种水溶性醌类化合物，广泛存在于食物和动物中，是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶，化学名称为4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸。PQQ已被证明具有很重要的生理功能而被认为是新的B族维生素,已有研究表明，PQQ可以用于治疗神经性和精神性失调症，这是由于PQQ可以阻止淀粉样蛋白的形成，抑制C-端缩短的变异型突触核蛋白的细胞毒性。并且，PQQ可以有效阻止氧化应激引起的神经退行性病变。总之，PQQ与神经系统相关的功能有如下四种：(1)抗氧化，清除自由基；(2)影响呼吸链功能，维护线粒体能量代谢；(3)刺激神经生长因子的分泌，修复和促进神经生长；(4)延缓α-synuclein蛋白的沉积，防止神经细胞纤维化。因此，有关研究人员认为PQQ对帕金森病和老年性痴呆等多种神经变性性疾病具有潜在的治疗价值。因此，PQQ作为药物或功能食品具有很好的应用前景。其结构式如下所示：

在PQQ生产中，从混合物中分离纯化PQQ，获得高纯度产品是至关重要的步骤。但是，PQQ水溶性强、反应液中浓度低，普通萃取方法萃取效率低、选择性差，严重制约着PQQ的大规模生产应用。目前，PQQ的生产方法主要是化学合成法及发酵法，化学合成法步骤多、副产物多且难以去除，在国内安全环保越来越严格的情况下，微生物发酵法生产PQQ具有巨大的成本优势。

如中国专利申请201510244788.5中公开了一种络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌，步骤如下：(1)将菌种发酵，得到发酵液；(2)发酵液经高速离心，将上清液在双溶质萃取体系进行络合萃取，其中三辛胺为络合剂，正己烷为稀释剂，得到富含吡咯喹啉醌的上层液；(3)将富含吡咯喹啉醌的上层液用氨水反萃，氨水层减压浓缩后，冷冻干燥，得到吡咯喹啉醌粗品；(4)将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，用HCl将pH调至3-4后，加入乙醇，在20-25℃下搅拌5-6h，然后静置12-24h，得到吡咯喹啉醌。该发明利用上述生产制备方法，条件简单，过程快捷，便于大规模工业化生产，对促进PQQ的产业化有重要意义，但是该工艺比较复杂，成本较高。

再如，中国专利申请201710441502.1中公开了一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用，包括如下步骤：(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。通过实验证明：该发明的方法具有工艺操作简单、衔接度高，产品回收率和纯度高的特点，但是根据该申请的记载可知其对终产品吡咯喹啉醌的收率并没有关注，并且其使用大孔经树脂后又经亲水性硅胶填料纯化会对产物的收率产生影响。

因此，需要开发一种操作简单，能够更好的提高吡咯喹啉醌的收率和纯度的分离纯化方法。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明旨在提供一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，该方法操作简单，并且能够更好的提高吡咯喹啉醌的收率和纯度。

本发明提供了一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将含有吡咯喹啉醌的发酵液调节pH为2.0-3.0，然后加入絮凝剂，在30℃条件下静置10-20分钟后然后加入助滤剂进行过滤，得滤液；

(2)将步骤(1)所得滤液进行浓缩，经过大孔树脂富集，然后使用水进行洗脱，得到洗脱液；

(3)将步骤(2)中得到的洗脱液进行浓缩加酸调节pH值，使吡咯喹啉醌从洗脱液中结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

(4)将步骤(3)中得到的吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

上述步骤(1)中所述的絮凝剂为非离子型絮凝剂和阴离子型絮凝剂的混合物，所述的非离子型絮凝剂选自水溶性淀粉、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺中的一种或几种，所述的阴离子型絮凝剂为聚丙烯酸、海藻酸和聚乙烯苯磺酸中的一种或几种。

优选地，所述的非离子型絮凝剂选自水溶性淀粉和/或聚丙烯酰胺，所述的阴离子型絮凝剂为聚丙烯酸和/或海藻酸。

再优选地，所述的非离子型絮凝剂为水溶性淀粉，所述的阴离子型絮凝剂为海藻酸。

在一些优选实施方案中，上述步骤(1)中所述的絮凝剂为质量比为2-5:1的水溶性淀粉和海藻酸的混合物；

优选地，上述步骤(1)中所述的絮凝剂为质量比为3-4:1的水溶性淀粉和海藻酸的混合物。

在优选地，上述步骤(1)中所述的絮凝剂为质量比为4:1的水溶性淀粉和海藻酸的混合物。

所述的助滤剂为硅藻土。

所述的絮凝剂的加入量与发酵液的质量体积比为5-10g/L；所述的助滤剂的加入量与絮凝剂的加入量之比为1:1-2(g/g)。

上述步骤(2)中所述的大孔树脂XDA-7和/或XDA-1。

优选地，上述步骤(2)中所述的大孔树脂为XDA-7和XDA-1配合使用，所述的XDA-7和XDA-1的体积比为1:2-3，优选为1:3。

上述步骤(2)中所述的洗脱速度为2.5-3BV/h，优选为2.8BV/h，收集红色至暗红色的洗脱液。

上述步骤(3)所述的调节pH值为3.0-3.2。

上述步骤(4)所述的重结晶的步骤为：将步骤(3)中得到的吡咯喹啉醌粗晶体加水溶解，然后调节pH值为4.0-6.0，静置，离心，重复两次，收集沉淀即为吡咯喹啉醌。

本发明调节pH的试剂为本领域常用酸或碱。

所述发酵液为以甲醇为唯一碳源的甲基营养菌发酵液。

本发明在实施过程中在吡咯喹啉醌的发酵液加入絮凝剂能够有效地使蛋白质、金属离子沉淀，结合助滤剂能够更好的除去吡咯喹啉醌发酵液中的杂质，从而能够更好的减少后续处理步骤，提高吡咯喹啉醌产品的纯度和收率。

本发明使用非离子型絮凝剂和阴离子型絮凝剂的混合物作为絮凝剂能够更好的使杂质凝集，具体的使用质量比为2-5:1的水溶性淀粉和海藻酸的混合物作为絮凝剂，使蛋白质杂质和金属离子杂质沉积，便于更好地除去。

本发明使用的大孔经树脂为混合树脂，即体积比为1:2-3的XDA-7和XDA-1，不仅能够除去色素杂质，还能更好地纯化吡咯喹啉醌，仅需使用纯水进行洗脱，即可得到纯度较高的吡咯喹啉醌，后续再进行重结晶，即可得到吡咯喹啉醌纯品。

具体的，本发明提供了一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将含有吡咯喹啉醌的发酵液调节pH为2.0-3.0，然后加入质量比为2-5:1的水溶性淀粉和海藻酸，在30℃条件下静置10-20分钟后然后加入硅藻土进行板框过滤，得滤液；

(2)将步骤(1)所得滤液进行浓缩，经过体积比为1:2-3的XDA-7和XDA-1混合大孔树脂富集，然后使用水进行洗脱，洗脱速度为2.5-3BV/h，得到洗脱液；

(3)将步骤(2)中得到的洗脱液进行浓缩加酸调节pH值为3.0-3.2，使吡咯喹啉醌从洗脱液中结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

(4)将步骤(3)中得到的吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

重结晶步骤为：将得到的吡咯喹啉醌粗晶体加水溶解，然后调节pH值为4.0-6.0，静置，离心，重复两次，收集沉淀即为吡咯喹啉醌。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明在实施过程中在吡咯喹啉醌的发酵液加入絮凝剂能够有效地使蛋白质、金属离子沉淀，结合助滤剂能够更好的除去吡咯喹啉醌发酵液中的杂质，从而能够更好的减少后续处理步骤，提高吡咯喹啉醌产品的纯度和收率；

(2)本发明使用非离子型絮凝剂和阴离子型絮凝剂的混合物作为絮凝剂能够更好的使杂质凝集，具体的使用质量比为2-5:1的水溶性淀粉和海藻酸的混合物作为絮凝剂，使蛋白质杂质和金属离子杂质沉积，便于更好地除去；

(3)本发明使用的大孔经树脂为混合树脂，即体积比为1:2-3的XDA-7和XDA-1，不仅能够除去色素杂质，还能更好地纯化吡咯喹啉醌，仅需使用纯水进行洗脱，即可得到纯度较高的吡咯喹啉醌，后续再进行重结晶，即可得到吡咯喹啉醌纯品。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

基础实施例一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法

包括以下步骤：

(1)将30L含有吡咯喹啉醌的发酵液调节pH为2.0-3.0，然后加入质量比为2-5:1的水溶性淀粉和海藻酸150-300g，在30℃条件下静置10-20分钟后然后加入硅藻土75-300g进行板框过滤，得滤液；

(2)将步骤(1)所得滤液进行浓缩，经过体积比为1:2-3的XDA-7和XDA-1混合大孔树脂富集，然后使用水进行洗脱，洗脱速度为2.5-3BV/h，得到洗脱液；

(3)将步骤(2)中得到的洗脱液进行浓缩加酸调节pH值为3.0-3.2，使吡咯喹啉醌从洗脱液中结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

(4)将步骤(3)中得到的吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

重结晶步骤为：将得到的吡咯喹啉醌粗晶体加水溶解，然后调节pH值为4.0-6.0，静置，离心，重复两次，收集沉淀即为吡咯喹啉醌。

所得到的吡咯喹啉醌的纯度为99.63％-99.72％，从发酵液中的PQQ量算起收率为72.5％-76.4％。

实施例1一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将30L含有吡咯喹啉醌的发酵液调节pH为2.0，然后加入质量比为2:1的水溶性淀粉和海藻酸150g，在30℃条件下静置10分钟后然后加入硅藻土150g进行板框过滤，得滤液；

(2)将步骤(1)所得滤液进行浓缩，经过体积比为1:2的XDA-7和XDA-1混合大孔树脂富集，然后使用水进行洗脱，洗脱速度为2.5BV/h，得到洗脱液；

(3)将步骤(2)中得到的洗脱液进行浓缩加酸调节pH值为3.0，使吡咯喹啉醌从洗脱液中结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

(4)将步骤(3)中得到的吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

重结晶步骤为：将得到的吡咯喹啉醌粗晶体加水溶解，然后调节pH值为4.0，静置，离心，重复两次，收集沉淀即为吡咯喹啉醌。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为99.63％，从发酵液中的PQQ量算起收率为72.5％。

实施例2一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将30L含有吡咯喹啉醌的发酵液调节pH为3.0，然后加入质量比为5:1的水溶性淀粉和海藻酸300g，在30℃条件下静置20分钟后然后加入硅藻土150g进行板框过滤，得滤液；

(2)将步骤(1)所得滤液进行浓缩，经过体积比为1:3的XDA-7和XDA-1混合大孔树脂富集，然后使用水进行洗脱，洗脱速度为3BV/h，得到洗脱液；

(3)将步骤(2)中得到的洗脱液进行浓缩加酸调节pH值为3.2，使吡咯喹啉醌从洗脱液中结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

(4)将步骤(3)中得到的吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

重结晶步骤为：将得到的吡咯喹啉醌粗晶体加水溶解，然后调节pH值为6.0，静置，离心，重复两次，收集沉淀即为吡咯喹啉醌。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为99.65％，从发酵液中的PQQ量算起收率为73.8％。

实施例3一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将30L含有吡咯喹啉醌的发酵液调节pH为2.5，然后加入质量比为4:1的水溶性淀粉和海藻酸240g，在30℃条件下静置10-20分钟后然后加入硅藻土120g进行板框过滤，得滤液；

(2)将步骤(1)所得滤液进行浓缩，经过体积比为1:2-3的XDA-7和XDA-1混合大孔树脂富集，然后使用水进行洗脱，洗脱速度为2.5-3BV/h，得到洗脱液；

(3)将步骤(2)中得到的洗脱液进行浓缩加酸调节pH值为3.0-3.2，使吡咯喹啉醌从洗脱液中结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

(4)将步骤(3)中得到的吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

重结晶步骤为：将得到的吡咯喹啉醌粗晶体加水溶解，然后调节pH值为4.0-6.0，静置，离心，重复两次，收集沉淀即为吡咯喹啉醌。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为99.72％，从发酵液中的PQQ量算起收率为76.4％。

对比例1

与实施例3的区别在于：步骤(1)仅使用水溶性淀粉作为絮凝剂，其他操作与步骤与实施例3相同。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为92.24％，从发酵液中的PQQ量算起收率为68.4％。

对比例2

与实施例3的区别在于：步骤(1)水溶性淀粉和海藻酸的质量比为1:1，其他操作与步骤与实施例3相同。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为94.85％，从发酵液中的PQQ量算起收率为66.3％。

对比例3

与实施例3的区别在于：步骤(1)水溶性淀粉和海藻酸的质量比为7:1，其他操作与步骤与实施例3相同。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为92.18％，从发酵液中的PQQ量算起收率为65.1％。

对比例4

与实施例3的区别在于：步骤(3)体积比为1:1的XDA-7和XDA-1混合大孔树，其他操作与步骤与实施例3相同。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为93.12％，从发酵液中的PQQ量算起收率为62.8％。

对比例5

与实施例3的区别在于：步骤(3)体积比为1:5的XDA-7和XDA-1混合大孔树，其他操作与步骤与实施例3相同。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为94.35％，从发酵液中的PQQ量算起收率为63.6％。

对比例6

与实施例3的区别在于：步骤(3)所述的调节pH值为4.0，其他操作与步骤与实施例3相同。

采用高效液相色谱法检测所得到的吡咯喹啉醌的纯度为98.26％，从发酵液中的PQQ量算起收率为64.8％。

具体检测结果，见下表1

表1所得吡咯喹啉醌的纯度和收率

根据以上检测结果可知，使用本发明在分离纯化过程中通过使用絮凝剂，能够有效地使蛋白质、金属离子沉淀，结合助滤剂能够更好的除去吡咯喹啉醌发酵液中的杂质，从而能够更好的减少后续处理步骤，提高吡咯喹啉醌产品的纯度和收率，根据本发明实施例1-3的记载可知使用本发明提供的使用非离子型絮凝剂和阴离子型絮凝剂的混合物作为絮凝剂，并控制两者的质量比为2-5:1，能够更好的使杂质凝集，并结合使用大孔经树脂，即使用体积比为1:2-3的XDA-7和XDA-1，可以明显提高产品的纯度和收率，使得到的产品纯度为99.63％-99.72％，收率为72.5％-76.4％。

对比例1-3改变絮凝剂中的具体组分，或改变非离子型絮凝剂和阴离子型絮凝剂的混合物的质量比不在本发明公开范围内时，得到的吡咯喹啉醌纯度降低，进而导致收率明显降低。对比例4-5改变大孔经树脂XDA-7和XDA-1的质量比不在本发明公开的范围内时，得到的吡咯喹啉醌的纯度明显降低，收率也随之降低。对比例6改变浓缩步骤中的pH值会对浓缩过程中吡咯喹啉醌从洗脱液中结晶洗出产生明显影响，因此会使吡咯喹啉醌得收率明显降低。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。