一种假单胞菌及其应用

技术领域：

本发明涉及一种假单胞菌及其应用，尤其涉及一种假单胞菌及其在改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

铁是植物生长必需的营养元素之一，它涉及植物叶绿素的合成、呼吸作用和氧化还原反应等生理过程，此外，铁还是多种酶反应的关键因素，控制着生命的进程。地壳中储藏着丰富的铁元素，但这些铁元素大多以难以被植物吸收利用的形态存在着，这种情况在石灰性土壤中尤其明显，高pH条件下，绝大部分铁元素被氧化固定，溶解性和流动性都极差，很难被植物根系吸收。此外，铁还会影响作物对氮和磷的吸收，从而影响作物品质。

据报道，地球上大约40%的土壤中有效铁含量较低，这些土壤容易导致植物出现缺铁症状，降低作物的产量和品质。除此之外，铁也是人类生存所必需的元素，植物缺铁，会减少人类吸收铁的来源，人类对铁的摄入量不够标准，就会引发缺铁性贫血，还会降低人体免疫力。目前，我国市场上销售的铁肥仍以价格低廉的无机铁肥为主，因其性质不稳定而导致效率低成本高。一些土壤微生物可分泌嗜铁素，螯合土壤中难溶性铁并将其转化植物可利用态，从而有效解决石灰性土壤上作物缺铁的难题，同时可降低铁肥进口费用。因此，从自然环境中筛选得到能够产嗜铁素的有效菌种具有较高的应用价值。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于针对上述问题，提供一种假单胞菌及其应用。

本发明的第一目的在于提供一种能够高产嗜铁素的假单胞菌。本发明的第二目的在于提供一种假单胞菌在改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁中的应用。

为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为：一种假单胞菌，其分类命名为假单胞菌

为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为：所述假单胞菌在缓解农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁中的应用。

具体应用为：

（1）将改善农业土壤尤其是石灰性土壤上作物缺铁的假单胞菌的试管种接种于PS液体培养基中，振荡速度为180-240r/min，培养温度为25~30℃，培养至对数期，得到菌液，即为应用于作物缺铁的假单胞菌。

更进一步的，所述步骤（1）中PS培养基的配方为：蛋白胨20.00g/L、氯化镁（MgCl

本发明中所述的假单胞菌的生理活性特征如下：

所述假单胞菌主要生物学特性为G

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

（1）本发明公开的一种假单胞菌具有分泌能与Fe

（2）假单胞菌培养条件简单、生产使用成本低，容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

具体实施方式

下面结合实验例详细阐述本发明假单胞菌的应用。

假单胞菌的筛选、分离和鉴定：

（1）取从有效铁含量较低的区域得到的新鲜土样1.0g，加入30.0ml纯水，混匀。取上面得到的土壤悬浊液1.0mL，加入9.0mL无菌水中，配成10

（2）2天后从培养基上挑取单菌落，平板划线，并对原平板进行鉴定。以60mL为例，在烧杯中加入54ml 去离子水，然后准确称量1.814g PIPES（哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸））和0.54g琼脂，逐个加入其中，尽量搅拌均匀，接下来使用氢氧化钠和盐酸将培养基的pH调节为6.8。加热培养基直至沸腾，使其中的琼脂完全溶解。放置冷却，待温度降至约50℃，将6mLCAS检测溶液加入其中，搅拌均匀，此时溶液应呈蓝色或绿色。将配置好的检测培养基慢慢倾倒在已经生长2~3天的菌株之上，没过菌株即可。

CAS检测溶液制作方法为：

Fe（Ⅲ）溶液：准确称取0.027g FeCl

CAS溶液：在烧杯中将60.5mg铬天青溶解于50ml去离子水，完全溶解后溶液将呈橙色或红色。

HDTMA溶液：准确称取72.9mg HDTMA置于烧杯中，再加入40ml 去离子水，待固体完全溶解，溶液呈无色。

CAS检测溶液（100ml）：首先在50ml CAS溶液中缓慢加入10ml Fe（Ⅲ）溶液，等溶液均匀混合后会呈现深红色或紫色。接下来将CAS-Fe（Ⅲ）溶液缓慢加入到40ml HDTMA溶液中。混合均匀后溶液将呈现深紫色或蓝色。然后将溶液放入高压灭菌锅于121℃条件下灭菌20min。制作完成后的CAS检测溶液，可以在室温下长期保存。

（3）将倒入检测培养基的菌株静置2~3天，检测培养基本身为蓝绿色，该菌株周围出现明显橘黄色光晕，说明该菌株具有分泌嗜铁素的能力。经鉴定该菌株为假单胞菌属，命名为：假单胞菌

假单胞菌属缓解作物缺铁中的应用：

实施例1：

（1）将假单胞菌的原种在培养皿上活化，并测定分泌嗜铁素性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL PS培养基的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中PS培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，蛋白胨20.00g，MgCl

（2）准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为：蛋白胨 2%，MgCl

（3）将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm

实施例2：

（1）将假单胞菌的原种在培养皿上活化，并测定分泌嗜铁素性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL PS培养基的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中PS培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，蛋白胨20.00g，MgCl

（2）准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为：蛋白胨 2%，MgCl

（3）将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm

实施例3：

（1）将假单胞菌的原种在培养皿上活化，并测定分泌嗜铁素性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mLPS培养基的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中PS培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，蛋白胨20.00g，MgCl

（2）准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为：蛋白胨 2%，MgCl

（3）将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm

核苷酸序列

<110>扬州大学

<120>一种产嗜铁素的假单胞菌及其应用

<160>1

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>1501

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

AGAGTTTGGAACCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTTAGCCGT。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种假单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgga acctggctca gattgaacgc tggcggcagg cctaacacat gcaagtcgag 60

cggatgaagg gagcttgctc ctggattcag cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc 120

tgcctggtag tgggggataa cgtccggaaa cgggcgctaa taccgcatac gtcctgaggg 180

agaaagtggg ggatcttcgg acctcacgct atcagatgag cctaggtcgg attagctagt 240

tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc 300

acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac 360

aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa 420

gcactttaag ttgggaggaa gggcagtaag ttaatacctt gctgttttga cgttaccaac 480

agaataagca ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg tgcaagcgtt 540

aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggttca gcaagttgga tgtgaaatcc 600

ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa ctactgagct agagtacggt agagggtggt 660

ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc 720

gaccacctgg actgatactg acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacgatgt cgactagccg ttgggatcct tgagatctta 840

gtggcgcagc taacgcgata agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc 900

aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960

gaagaacctt acctggcctt gacatgctga gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg 1020

ggaactcaga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acctcgggtg ggcactctaa 1140

ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1200

acggccaggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt 1260

ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320

agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg 1380

tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag aagtagctag tctaaccgca 1440

agggggacgg ttaccacgga gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggttagccg 1500

t 1501