贝莱斯芽孢杆菌菌株HYL-1及其应用

【技术领域】

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及贝莱斯芽孢杆菌菌株HYL-1及其应用。

【背景技术】

尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense,Foc)是一种土传真菌，会导致香蕉的枯萎病，被认为是香蕉最具破坏性的疾病，目前尚无有效的化学药剂进行预防和治疗，研究人员希望使用生物方法控制香蕉枯萎病。在不影响植物产量的情况下，使用微生物减少化肥、农药的使用是目前农业生物技术、微生物学的一个重要研究领域。

微生物中，有一类植物生长促进根际细菌(PGPR)可改善植物生长、提高土壤肥力、增加产量并减少病原体或非生物胁迫。现有技术中有报道，芽孢杆菌被用作生物防治剂来抑制许多土壤传播的植物病原体，例如立枯丝核菌和尖孢镰刀菌。PGPR通过产生植物生长激素如吲哚乙酸(IAA)、溶解无机磷酸盐、通过产生铁载体和杀真菌化合物对抗植物病原微生物的拮抗作用来帮助植物。但是，在实际的工作中，同属同种的不同菌株，其生理上有较大差别，有些菌株能抑制某个病原菌的生长，但是同种属的其他菌株并不一定具备和其相同的抑菌效果，为此菌株的筛选、研发工作是一项永无止境的研究领域，新菌株、新菌株应用的发现将为后续的植物保护、生物菌肥等各个相关的生物防护领域提供坚实的基础，本申请是基于香蕉种植地筛选的微生物，主要是为了筛选出具有香蕉枯萎病抗性、促进香蕉生长的微生物。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供一种能抑制多种病原菌的菌株，该菌株应用广泛，能生物肥料、生物农药和土壤改良等多项领域。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

复合微生物菌剂，该菌剂包括菌株贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis HYL-1其保藏编号为GDMCC NO.61927保藏于：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年09月10日。

本发明还包括包含所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1的菌剂。

本发明还包括贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1的代谢产物。

本发明还包括所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1、所述包含贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1的菌剂或所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1的代谢产物在抑制病原菌生长上的应用。

进一步的，所述病原菌为：霉菌、青枯病菌(Pseudomonas solanacearum(Smith)Smith)和/或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

进一步的，所述霉菌为皮壳青霉菌(Penicillium crustosum)和/或球孢枝孢霉菌(Cladosporium sphaerospermum)。

本发明还包括所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1、包含贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1的菌剂或所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis HYL-1的代谢产物在抑制罗汉果白绢病和/或香蕉枯萎病上的应用。

本发明还包括所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1、包含贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1的菌剂或所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis HYL-1的代谢产物在促进香蕉生长、加快香蕉花期和/或提高香蕉芽生发上的应用。

本发明还包括所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1、包含贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1的菌剂或所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis HYL-1的代谢产物在修复土壤中的应用。

本发明还包括所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1、包含贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1的菌剂或所述贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis HYL-1的代谢产物在制备生物肥料、生物农药和/或土壤修复剂上的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1、菌剂及其代谢产物均具有广泛的抑菌和抗病效果，对霉菌、白绢病菌、青枯病菌和香蕉尖孢镰刀菌具有良好的抑制作用，经过盆栽实验发现，该菌株可用于防治香蕉枯萎病，同时还具有促进香蕉生长、加快香蕉花期和提高香蕉芽生发的作用，通过其促生长实验还发现，该菌株还可以促进IAA合成、可产生铁载体、可溶解无机磷酸盐和硅酸盐能很好的促进植物生长、改善土壤。此外，该菌株还可产生蛋白质水解酶和淀粉水解酶。说明该菌株有较好的产酶效果，可用于食品将领域，由此可见，本申请的菌株是一株兼具多功能，应用领域广泛的菌株，在后期的生物防治、生物菌肥、食品加工等领域都具有良好的前景。

【附图说明】

图1为本发明HYL-1菌株在平皿上的形态图；

图2为本发明HYL-1菌株的系统发育树图；

图3为菌株HYL-1对尖孢镰刀菌(Foc1)的平板拮抗实验图；

图4为菌株HYL-1对尖孢镰刀菌(Foc4)的平板拮抗实验图；

图5为菌株HYL-1对尖孢镰刀菌(Foc1)对峙结果进行显微拍摄图；

图6为菌株HYL-1对尖孢镰刀菌(Foc4)对峙结果进行显微拍摄图；

图7为菌株HYL-1次级代谢产物对尖孢镰刀菌(Foc1)的抑制孔板实验结果图；

图8为菌株HYL-1次级代谢产物对尖孢镰刀菌(Foc4)的抑制孔板实验结果图；

图9-图10为巴西蕉实验组的盆栽实验结果图；其中，图9的病原菌为尖孢镰刀菌(Foc1)、图10为尖孢镰刀菌(Foc4)；

图11-图12为金粉蕉实验组的盆栽实验结果图；其中，图11的病原菌为尖孢镰刀菌(Foc1)、图12为尖孢镰刀菌(Foc4)；

图13-图14为威廉斯B6实验组的盆栽实验结果图；其中，图13的病原菌为尖孢镰刀菌(Foc1)、图14为尖孢镰刀菌(Foc4)；

图15为菌株HYL-1对威廉斯B6品种香蕉的促生长盆栽实验结果图；

图16为香蕉的生防剂发生率指数结果图；

图17为香蕉的承载率结果图；

图18为菌株HYL-1对青枯病菌的抑菌实验结果图；

图19为菌株HYL-1对白绢病菌的抑菌实验结果图；

图20为菌株HYL-1对皮壳青霉菌的抑制结果图；

图21为菌株HYL-1对球孢枝孢霉菌的抑制结果图；

图22为HYL-1菌株产IAA的结果图；

图23为HYL-1菌株产铁载体的结果图；

图24为HYL-1菌株降解无机磷的结果图；

图25为HYL-1菌株解硅酸盐的结果图；

图26为HYL-1菌株产蛋白酶的结果图；

图27为HYL-1菌株产淀粉酶的结果图；

图28为HYL-1菌株降解碳酸钙的结果图；

图29为HYL-1菌株降解几丁质的果图；

图30为HYL-1菌株降解植酸钙的结果图。

【具体实施方式】

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1：

菌株Bacillus velezensis HYL-1的筛选：

贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis HYL-1，其保藏编号为GDMCCNO.61927保藏于：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年09月10日。

上述菌株于2021年从广西壮族自治区南宁市新科健生物技术有限公司农场的香蕉耕种田的土壤中分离出来。

分离方法为：将土壤溶解在无菌水中，均质悬浮后，取悬浮液100μl在含有选择性培养基的培养皿上铺展，培养皿在28℃下孵育长达1天，然后计算菌落形成单位。分别从所有组织样品中挑取每个细菌菌落并转移到生长培养基板上。经过敏锐的观察和传代培养，根据表型、形态、菌落颜色、大小纹理、不透明度、高度、边缘和表面对纯细菌进行分离。

对分离的菌株进行形态学分类和分子生物学鉴定，具体如下：

1、菌株的形态学分类

菌株的形态学分类：

如图1所示，菌株HYL-1在LB培养基的察菌落形态特征表现为：菌落白色、边缘不光滑、菌落呈圆形、中间有褶皱。

2、分子生物学鉴定

对上述菌株进行测序、验证：采用通用引物：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'对菌株的16S rRNA基因序列进行扩增，对纯化的PCR产物进行测序。使用Mega 6.0生成HYL-1和其他菌株序列的多序列比对，构建菌株的系统发育树图：结果如图2所示，菌株HYL-1与芽孢杆菌Bacillus sp.都具有99.7％的相似性，属于Bacillus sp.属，经过形态鉴定，认为其外形更接近Bacillus velezensis种，因此，命名为Bacillus velezensis。

实施例2：

本实施例主要研究菌株HYL-1对香蕉枯萎病的抑制作用。

一、菌株HYL-1与病原菌(Foc1和Foc4)的对抗实验，具体实验过程如下：

①制备病原菌悬浮液：将带病原菌的琼脂培养基添加到PDB液体培养基中，在28℃、170rpm条件下培养7d，培养结束后将悬浮液通过四层纱布过滤，然后用蒸馏水调节终浓度到10×10

②将上述病原菌的悬浮液接种到PDA培养基上，其中对照组仅接种了本申请新菌株的病原菌；而实验组在PDA培养基的一侧接种了病原菌，相对的一侧接种相应的HYL-1菌株进行拮抗实验。

图3为菌株HYL-1和尖孢镰刀菌(Foc1)的平板拮抗实验图；图4为菌株HYL-1和尖孢镰刀菌(Foc4)的平板拮抗实验图；两图的左边均为未接种菌株HYL-1的对照组，右边均为接种了菌株HYL-1平皿的实验组；图中明显可见，实验组的病原菌菌丝仅占到整个平皿的一半，而对照组的菌丝占满了整个平皿，由此可知，菌株HYL-1对引起香蕉枯萎病的尖孢镰刀菌Foc1和Foc4均具有抑制作用。

对上述平板对峙结果进行显微拍摄，结果如图5(Foc1)和图6(Foc4)所示，图中，右边为实验组，左边为对照组，可见图中的对照组的菌丝生长强壮，而HYL-1实验组表现出菌丝生长抑制，对照组的菌丝出现溶解液泡化现象，由此说明，菌株HYL-1对尖孢镰刀菌有抑制作用。

二、菌株HYL-1的次级代谢产物对病原菌(Foc1和Foc4)的抑制作用：

①制备菌株HYL-1的次级代谢物：将菌株HYL-1分别接种与LB液体培养基中，接种量为1％，培养时间为12h，培养结束后将培养液进行离心分离，取液体，用0.22um无菌过滤之后得到次级代谢物。

②制备病原菌悬浮液：将带病原菌的琼脂培养基添加到PDA液体培养基中，在28℃、170rpm条件下培养2d，培养结束后将悬浮液通过四层纱布过滤，然后用蒸馏水调节终浓度到1×10

③将步骤①制备得到的次级代谢物物按照PDA培养基体积的0(Control组)、20％、40％、60％、80％、100％的添加量添加到PDA培养基中，然后将含有步骤①次级代谢物的PDA培养基分装到24孔板中，每个浓度梯度设置4个孔板，之后，将步骤②的病原菌接种到含有上述不同浓度细胞提取物的平皿中孵育培养2d，2d后观察不同孔板上菌丝的生长情况。

结果如图7-8所示，从图中可见，当HYL-1的代谢产物添加量达到80％时，开始对尖孢镰刀菌Foc1和Foc4起到抑制作用：当达到80％浓度时，HYL-1的代谢产物完全抑制了菌丝体的生长。

三、菌株HYL-1的盆栽实验：

选择长势一致的香蕉幼苗进行实验，设定如下3个处理：

1、空白组：将幼苗根部清理干净后，将幼苗根部用蒸馏水浸泡30min，移栽入花盆内并浇灌50mL清水；

2、对照组：将幼苗根部清理干净后，将幼苗根部用浓度为1×10

3、实验组：将幼苗根部清理干净后，挑选两条根部各刮出一处伤口，将幼苗根部用浓度为1×10

清理干净将伤根后的巴西蕉幼苗根部用，然后移栽至育苗盆中；设定3个处理：

移栽60d后，观察实验组和对照组的病情防效和病情指数统计结果如表1：

香蕉枯萎病的分级标准：

0级，无病叶，健株；1级，有25％的黄化病叶；3级，有25％-50％的黄化病叶；5级，有50％-90％黄化的病叶；7级，叶片全部黄化，植株死亡。

香蕉病情指数及防病效果计算：

病情指数＝∑(各级病株数×该病级数)/(调查总株数×最高病级数)×100％

防病效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。

选择巴西蕉、金粉蕉、威廉斯B6几个品种植株的盆栽进行实验

表1菌株HYL-1对香蕉枯萎病的影响

从表1可知，菌株HYL-1对各品种的香蕉枯萎病(巴西蕉、金粉蕉、威廉斯B6)均具有良好的抑制作用，表现在：各实验组的病情指数均低于空白组和对照组；防效均达到90％以上。

上述盆栽实验的结果如图9-14所示：图9-图10为巴西蕉实验组的盆栽实验结果图；图11-图12为金粉蕉实验组的盆栽实验结果图；图13-图14为威廉斯B6实验组的盆栽实验结果图；从图中可见，上述对照组的香蕉均表现出枯黄、矮小的表型，而实验组和空白组的生长状况接近，均表现为比对照组高大，且叶片不存在枯黄的状态。由此说明，菌株HYL-1对香蕉枯萎病有较强的抑制作用。

申请人在研究菌株的过程中除了发现菌株HYL-1对香蕉枯萎病有抑制作用外，还发现菌株HYL-1对威廉斯B6品种香蕉有促进生长的作用，申请人进行如下盆栽实验：选取长势一致的威廉斯B6品种香蕉幼苗种植在盆栽中，均分为两组(实验组和空白组)，其中，实验组在种植时浇灌50mL浓度为1×10

表2菌株HYL-1对威廉斯B6品种香蕉的促进生长作用

从表2可知，实验组香蕉的平均株高大于空白组，这与图15结果抑制，干重高于空白组，由此说明菌株HYL-1对威廉斯B6品种香蕉具有良好的促进生长作用。

上述盆栽实验的结果如图15所示：实验组的植株长势明显优于空白组，表现为植株更高大、颜色更翠绿。

为进一步研究Foc对香蕉枯萎病的影响，在广西南宁市开展了香蕉枯萎病的流行病学和防治策略研究。通过检查农场种植过程中疾病的发生率和香蕉芽发生率，结果表明，当施用含有菌株HYL-1的生物制剂，疾病严重程度降低，生防剂发生率指数为5.6％(图16)。但是，单孢施用使香蕉枯萎病的发病率指数增加。在播种时，香蕉在播种后10个月的承载率高于正常对照组(图17)；这些结果表明，将菌株HYL-1孢子的应用在大田种植中能略微促进了香蕉芽生发。

除上述效果外，菌株HYL-1还表现出能是香蕉提早挂果的效果，经过种植实验比对，施加了含菌株HYL-1菌肥的香蕉植株，其挂果时间提早了35天。

实施例3：

菌株HYL-1次级代谢产物对青枯病的抑制作用：

①将青枯病菌接种到LB液体培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养16h，备用；

②菌株HYL-1培养物上清液的制备：

将HYL-1菌种接种于LB液体培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养24h。然后将培养液在3500rpm条件下离心10min，放入4℃冰箱备用；

③病原指示平板的制备：

在LB固体培养基平皿上对称摆放2个牛津杯，将青枯病菌与已融化冷却至50℃的LB琼脂培养基按1:100比例混匀取20ml倒入上述LB固体培养基上表面，涂布均匀后冷却凝固后，用无菌镊子将牛津杯剔除得到带孔的培养基；

④上样：

实验组：移取100μL步骤②制备得到的菌株HYL-1上清液于步骤③指示平板的牛津杯孔内，避免液体外溢。

对照组：取100μL的LB培养基于步骤③指示平板的牛津杯孔内，避免液体外溢。

⑤培养：

上样完成后，将青枯病菌指示平板在37℃条件下培养16h。

⑥实验结果处理：

培养结束后，对平板进行拍照观察，平板指示结果如图18所示，图中可见，实验组有明显的透明抑菌圈，而对照组没有抑菌圈；实验组的抑菌圈的大小平均为3.5mm。

实施例4：

菌株HYL-1对罗汉果植株分离的白绢病病原菌(齐整小核菌(Selerotium rolfsiiSacc))的抑制作用，具体如下：

本实施例的白绢病病原菌和根腐病病原菌均分离自罗汉果植株，是申请人从菌种保藏中心处购买获得，获得相关病原菌后采用平板对峙实验进行抑菌效果的研究，具体如下：

①制备病原菌悬浮液：将带病原菌的琼脂培养基添加到PDB液体培养基中，在28℃、170rpm条件下培养7d，培养结束后将悬浮液通过四层纱布过滤，然后用蒸馏水调节终浓度到1×10

②将上述病原菌的悬浮液接种到PDA培养基上，其中对照组仅接种了本申请新菌株的病原菌；而实验组在PDA培养基的一侧接种了病原菌，相对的一侧接种相应的HYL-1菌株进行拮抗实验。

其中，对白绢病病原菌的抑制效果如图19所示，图中，右边为实验组平板，左边为对照组平板，可见，实验组的白绢病菌丝仅占到整个平板的一半，而对照组白绢病的菌丝长满了整个平板；

实施例5：

菌株HYL-1对霉菌的抑制作用，具体如下：

1、对皮壳青霉的抑制实验：

①制备病原菌悬浮液：将带病原菌的琼脂培养基添加到PDB液体培养基中，在28℃、170rpm条件下培养7d，培养结束后将悬浮液通过四层纱布过滤，然后用蒸馏水调节终浓度到10×10

②将上述病原菌的悬浮液接种到PDA培养基上，其中对照组仅接种了本申请新菌株的病原菌；而实验组在PDA培养基的一侧接种了病原菌，相对的一侧接种相应的筛选菌株：HYL-1进行拮抗实验。

平板对峙结果如图20所示，图中，左边为实验组平板，右边为对照组平板，可见，实验组平板的灰霉菌落大小明显小于对照组，由此说明，菌株HYL-1对皮壳青霉有抑制作用。

2、对球孢枝孢霉的平板对峙实验：

实验步骤与上述一实验的1相同，

平板对峙结果如图21所示，图中，右边为实验组平板，左边为对照组平板，可见，实验组平板的绿霉菌落大小明显小于对照组，由此说明，菌株HYL-1对球孢枝孢霉有抑制作用。

上述结果表明：菌株HYL-1对霉菌均具有良好的抑制作用。

实施例6：

本实施例主要研究菌株HYL-1对植物促生特性：

对菌株HYL-1产酶活性进行检测：培养1d后可以观察在各种培养基上菌株的生长状况，具体如图22-图30所示，从图中的实验结果表明：HYL-1显示出多种促进植物生长的性状，主要表现在IAA合成(图22)、铁载体(图23)、溶解无机磷酸盐(图24)和硅酸盐(图25)的能力中。此外，该菌株还可产生蛋白质水解酶(图26)和淀粉水解酶(图27)。HYL-1菌株在有机磷酸盐(图24)、植酸钙(图28)、碳酸钙(图29)或几丁质(图30)培养基平板上生长，菌株视为阴性结果。结果表明，该菌株可用于香蕉种植生态系统中受污染土壤的生物修复。

实施例7：

选择香蕉种植地为实验地将相邻两块等面积的地块分为实验组和对照组；

其中，实验组中施加修复剂，修复剂的制备方法为：将含1×10

对照组中施加有机肥，该有机肥为与实验组同品牌、同批次的有机肥，该有机肥不接种菌株HYL-1。

其它管理方法按常规管理方法进行，在施用菌剂前取1次土壤样品，在施用1个月后再取一次土壤样品测定土壤的速效磷及有机质含量。结果如下表：

表3菌株HYL-1对土壤的修复能力

从表3可知，在初始的种植地块中，实验组和对照组的养分含量接近，说明两地块的地质差别不大，当实验1个月后，实验组和对照组的有机质和速效磷含量都有所提升，说明，施用有机肥(对照组)能起到改善土壤有机质和磷含量的作用，而添加了菌剂HYL-1的实验组，其对土壤的改善能力更强，表现为实验组的有机质和速效磷含量均大于对照组。

综上所述，本发明的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis HYL-1菌株及其代谢产物对多种病原菌具有抑制作用；同时对植物的香蕉枯萎病具有防护作用，此外还具有对香蕉的促生长作用和提前花期的效果，同时还可用于修复污染土壤，由此可见，本申请的菌株可广泛应用于：植物防护、促生长、土壤修复等各个领域，应用广泛，是一株适合植物防护和促生长的优良菌株。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。