一种纳米金掺杂自组装多肽活性物及其制备方法

技术领域

本申请涉及化妆品生物活性原料领域，尤其是涉及一种纳米金掺杂自组装多肽活性物及其制备方法。

背景技术

自组装多肽是以肽分子间的非共价作用为驱动力实现自组装的纳米材料。非共价作用主要包括氢键作用、π-π堆积作用、静电作用、疏水相互作用等，这些驱动力赋予多肽优异的自组装能力以及自组装的可控制性，当自组装驱动力达到动态平衡时，多肽的结构陷入亚稳态，即可形成规则的自组装结构，如纤维、凝胶、纳米管、纳米球、条带等。

自组装多肽具有优异的生物相容性、生物降解性和细胞靶向性，使得其具有广泛的用途，包括作为创伤修复、组织修复、护肤和化妆药品、细胞培养、药物载体等方面。然而，在用作护肤品成分时，由于自组装多肽的稳定性较差，容易变性，导致其使用效果较差。

发明内容

本申请提供一种纳米金掺杂自组装多肽活性物及其制备方法，该自组装多肽活性物稳定性高，具有突出的皮肤保水、修护效果。

第一方面，本申请提供一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，由重量比为(50～100):1的自组装多肽活性物和纳米金溶液制得；所述自组装多肽混合物由活性多肽与嗜热栖热菌发酵产物自组装得到；所述活性多肽包括乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽-4与谷胱甘肽中的一种或几种。

上述技术方案中，纳米金粒子具有较大的比表面积，生物相容性好，粒径小等优点，可以渗透表皮层的深层，促进活性物在皮肤中的积累。通过在自组装多肽体系中加入纳米金，由于自组装多肽分子中的巯基能够与纳米金结合，因此可利用自组装多肽对纳米金进行表面修饰，形成纳米金掺杂自组装多肽活性物。一方面，可促进自组装多肽向表皮层深层的渗透，提高自组装多肽活性物在皮肤中的含量，有效提高自组装多肽的皮肤修复、保水以及抗皱等功效；另一方面，纳米金与自组装多肽结合后，能够提高自组装多肽结构的稳定性，减少因多肽变性导致的功效下降甚至丧失的现象。

优选的，所述嗜热栖热菌发酵产物与活性多肽的用量比为(90～99.8):(0.1～2)。

在多肽自组装过程中，本申请采用了活性多肽与嗜热栖热菌的发酵产物作为组装底物，其中，活性多肽包括乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽-4与谷胱甘肽，其具有乙酰基和棕榈酰基等修饰基，一方面，有利于协同促进多肽的自组装，得到种类更丰富的自组装多肽；另一方面，乙酰基和棕榈酰基具有较好的亲油性，有利于自组装多肽活性物向皮肤深层的渗透，提高修护、保水、抗皱等功效。

对于嗜热栖热菌发酵产物，是嗜热栖热菌在高温条件下发酵破碎所得，其溶胞物中主要含有核酸、蛋白、脂类、多糖、次生代谢物以及各种多肽。其含有的天然多肽组分，如序列号为缬-苯丙-酪-酪-异亮，谷-赖-精-丙-异亮-丙，甘-脯-亮-亮-苯丙-缬-谷等，同时含有适量的谷胱甘肽以及带不同电荷、不同疏水性的氨基酸，可改变肽的非共价相互作用，促进肽的自组装，丰富自组装产物的多样性，最终，有效提升修护、保水、抗皱等功效。

优选的，所述活性多肽采用质量比为(8～20):1:1的乙酰基六肽-8，棕榈酰五肽-4与谷胱甘肽。

上述加入的谷胱甘肽与纳米金具有较高的亲和性，可通过巯基与纳米金表面结合，增加自组装多肽体系的稳定性，保障纳米金掺杂自组装多肽活性物修护效果的发挥。

优选的，所述纳米金溶液中纳米金的平均粒度为10～20nm。

通过采用上述技术方案，纳米金粒度的减小，有助于其渗透性的提高；然而，粒径过小，将不利于提高其对自组装多肽的负载量，从而影响纳米金掺杂自组装多肽活性物的修护效果。

优选的，所述嗜热栖热菌发酵产物由保藏号为BAA-163的菌株于50～80℃下发酵培养，进行破碎处理得到，发酵时间为2～12h。

通过采用上述技术方案，嗜热栖热菌在高温环境下经过充分的发酵，其发酵产物中具有种类丰富的多肽，有利于提升自组装多肽的多样性。

需要说明的是，本申请中嗜热栖热菌的并不唯一，其他品类的嗜热栖热菌发酵产物也具有促进多肽自组装的效果。嗜热栖热菌的发酵培养温度为50～80℃，发酵时间为2～12h。

优选的，所述纳米金溶液按照如下方法制备得到：

S101：将金离子溶液加热至沸腾，然后加入还原剂，进行氧化还原反应，当溶液呈酒红色时，得到纳米金粗溶液；

S102：向纳米金粗溶液中加入丁二醇，搅拌均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮，得到纳米金溶液。

本申请采用还原法制备纳米金，随着还原反应的进行，反应溶液显色逐渐由透明向黑色，当溶液进一步转变为酒红色时，反应结束，得到含有纳米金的粗溶液。在充分搅拌下，纳米金在丁二醇中具有较好的分散性，通过加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，能够有效抑制纳米金的团聚趋势，提高纳米金溶液的稳定性。

优选的，步骤S102中，与聚乙烯吡咯烷酮一同加入有修饰剂，所述修饰剂采用四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、三甲氧基硅烷与三乙氧基硅烷中的一种或几种。

通过采用上述技术方案，通过采用有机硅氧烷对纳米金表面进行修饰，可在纳米金表面形成具有Si-O-Si主链的保护层，起到空间位阻作用，能够进一步的提高纳米金颗粒的分散性和均一性，保障纳米金掺杂自组装多肽活性物的形成。

优选的，所述还原剂采用质量比为(2～3):1的柠檬酸钠和抗坏血酸钠。

通过采用上述技术方案，柠檬酸钠与抗坏血酸钠复配所得还原剂，具有较好的还原性。其中，柠檬酸钠还具有稳定剂的作用，有利于控制反应速度，保障所得纳米金颗粒的平均粒度在10～20nm之间。

第二方面，本申请提供一种纳米金掺杂自组装多肽活性物的制备方法，包括如下步骤：

S201：按配比，将乙酰基六肽-8，棕榈酰五肽-4以及谷胱甘肽三者加入嗜热栖热菌发酵产物中，混合均匀，得到反应液；

S202：调节反应液pH值至3～6，在25～50℃的反应温度进行自组装反应，得到自组装多肽活性物；

S203：按配比，将自组装多肽活性物与纳米金水溶液混合，得到纳米金掺杂自组装多肽活性物。

通过采用上述技术方案，所得纳米金掺杂自组装多肽活性物中多肽自组装的成分较丰富，渗透性高，可在皮肤深层有效累积，因而对皮肤修护作用和保水作用更为显著。

综上所述，本申请具有如下有益效果：

1、本申请通过将纳米金与自组装多肽活性物混合，得到具有优异的稳定性和渗透性的纳米金掺杂自组装多肽活性物，显著提升了自组装多肽活性物的DPPH清除、淡化细纹以及锁水保水等功效。

2、本申请通过在自组装多肽的底物中添加嗜热栖热菌发酵产物，有效增加了底物中多肽和氨基酸的种类，同时通过引入了带有乙酰基、棕榈酰基等修饰基的多肽底物，从而丰富了自组装多肽产物的种类，提高了自组装多肽的稳定性。最终，提升了所得纳米金掺杂自组装多肽活性物的皮肤修复功效。

3、本申请通过采用聚乙烯吡咯烷酮和有机硅氧烷分子对纳米金粒子进行表面修饰，显著改善了纳米金粒子在溶液中的稳定性，减少了团聚现象，进而保障了纳米金掺杂自组装多肽活性物的稳定性。

附图说明

图1是实施例1中纳米金掺杂自组装多肽活性物使用前后的眼周皱纹图。

具体实施方式

嗜热栖热菌发酵产物制备例

制备例1-1，一种嗜热栖热菌发酵产物，按照如下方法制得：

步骤1：将嗜热栖热菌(菌种编号为BAA-163)接种于培养基中进行发酵培养，其中，发酵温度为55±5℃，发酵时间为12h，培养基成分为：60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节至7.0，加水配制成20L培养液。

步骤2：发酵结束后采用超声对菌体进行破碎处理，所得菌体溶胞物即为嗜热栖热菌发酵产物。

经检测，嗜热栖热菌发酵产物中还原型谷胱甘肽的含量为20μmol/L；所得发酵产物中多肽含量为0.35g/L。

制备例1-2，一种嗜热栖热菌发酵产物，按照如下方法制得：

步骤1：将嗜热栖热菌(菌种编号为CICC 2489)接种于培养基中进行发酵培养，其中，发酵温度为75±5℃，发酵时间为2h，培养基成分为：60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、 2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节至7.0，加水配制成20L培养液。

步骤2：发酵结束后采用超声对菌体进行破碎处理，所得菌体溶胞物即为嗜热栖热菌发酵产物。

经检测，嗜热栖热菌发酵产物中还原型谷胱甘肽的含量为15μmol/L；所得发酵产物中多肽含量为0.3g/L。

纳米金溶液的制备例

制备例2-1，一种纳米金溶液，按照如下方法制备得到：

S101：圆底烧瓶中加入90ml纯化水，再加入占纯化水重量3％的氯化金溶液(1wt％)，加热至沸腾；然后加入氯化金溶液1.5倍重量的还原剂(质量比为2:1的柠檬酸钠和抗坏血酸钠)，进行氧化还原反应并观察溶液颜色变化，当溶液溶液显色由透明→黑色→酒红色后关闭加热电源，停止加热，取出圆底烧瓶；将纳米金冷却至常温，得到纳米金粗溶液。

S102：向纳米金粗溶液中加入丁二醇，搅拌18h，加入纯化水定容至100ml，再加入反应体系总重量0.1％的聚乙烯吡咯烷酮和反应体系总重量0.05％的四乙氧基硅烷(修饰剂)，得到纳米金溶液。经透射电子显微镜测量，所得纳米金的平均粒度约为10nm。

制备例2-2，一种纳米金溶液，按照如下方法制备得到：

S101：向圆底烧瓶中加入90ml纯化水，再加入占纯化水重量5％的氯化金溶液(1.5wt％)，加热至沸腾；然后加入占氯化金溶液2倍重量的还原剂(质量比为3:1的柠檬酸钠和抗坏血酸钠)，进行氧化还原反应并观察溶液颜色变化，当溶液溶液显色由透明→黑色→酒红色后关闭加热电源，停止加热，取出圆底烧瓶；将纳米金冷却至常温，得到纳米金粗溶液。

S102：向纳米金粗溶液中加入丁二醇，搅拌16h，加入纯化水定容至100ml，再加入体系总重量0.1％的聚乙烯吡咯烷酮和体系总重量0.05％的三甲氧基硅烷(修饰剂)，得到纳米金溶液。经检测，所得纳米金的平均粒度约为20nm。

制备例2-3，一种纳米金溶液，与备例2-1的区别在于，步骤S102中，未添加聚乙烯吡咯烷酮；经检测，所得纳米金的平均粒度约为24nm。

制备例2-4，一种纳米金溶液，与备例2-1的区别在于，步骤S102中，未添加修饰剂；经检测，所得纳米金的平均粒度约为26nm。

制备例2-5，一种纳米金溶液，与备例2-1的区别在于，步骤S102中，未添加聚乙烯吡咯烷酮和修饰剂；经检测，所得纳米金的平均粒度约为33nm。

制备例2-6，一种纳米金溶液，与备例2-1的区别在于，步骤S102中，采用硼氢化钠作为还原剂；经检测，所得纳米金的平均粒度约为6nm。

实施例

实施例1，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，按照如下步方法制备得到：

S201：按配比，将质量比为10:1:1乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽-4以及谷胱甘肽三种多肽底物共0.12㎏加入108㎏嗜热栖热菌发酵产物(制备例1-1制得)中，混合均匀，得到反应液；

S202：调节反应液pH值至3，控制反应温度在45±5℃，同时辅以适量的超声分散(功率为 1000W)，搅拌2h使底物原料进行自组装反应，得到自组装多肽活性物；

S203：按配比，将自组装多肽活性物与纳米金溶液(制备例2-1制得)混合，搅拌1h，得到纳米金掺杂自组装多肽活性物。

实施例2，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，按照如下步方法制备得到：

S201：按配比，将质量比为20:1:1乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽-4以及谷胱甘肽三种多肽底物共0.22㎏加入10.98㎏嗜热栖热菌发酵产物(制备例1-2制得)中，混合均匀，得到反应液；

S202：调节反应液pH值至6，控制反应温度在30±5℃，同时辅以适量的超声分散(功率为 1000W)，搅拌3h使底物原料进行自组装反应，得到自组装多肽活性物；

S203：按配比，将自组装多肽活性物与纳米金溶液(制备例2-2制得)混合，搅拌0.5h，得到纳米金掺杂自组装多肽活性物。

实施例3，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，步骤S203中，采用制备例2-3制得的纳米金溶液。

实施例4，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，步骤S203中，采用制备例2-4制得的纳米金溶液。

实施例5，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，步骤S203中，采用制备例2-5制得的纳米金溶液。

实施例6，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，步骤S203中，采用制备例2-6制得的纳米金溶液。

对比例

对比例1，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，自组装多肽混合物的底物原料中(步骤S202)未添加嗜热栖热菌发酵产物。

对比例2，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，自组装多肽混合物的底物原料中(步骤S202)未添加活性多肽。

对比例3，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，自组装多肽混合物的底物原料中(步骤S202)，采用等量的谷胱甘肽替代乙酰基六肽-8与棕榈酰五肽-4。

对比例4，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，自组装多肽混合物的底物原料中(步骤S202)，采用等量的乙酰基六肽-8替代谷胱甘肽。

对比例5，一种纳米金掺杂自组装多肽活性物，与实施例1的区别在于，纳米金掺杂自组装多肽活性物的原料中(步骤S202)未添加纳米金溶液。

性能检测试验

试验1：安全性测试

将上述所有的实施例和对比例制备的纳米金掺杂自组装多肽活性物进行浓度为20％的人体安全性斑贴测试，测试方法参照《2015化妆品安全技术规范》中的人体皮肤斑贴试验。

皮肤封闭型斑贴试验的方法为：选择年龄为18-60周岁的人员30名，选用面积不超过 50mm

表1皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准

表2人体安全性测试结果

实验结果表明，所有浓度为20％的实施例和对比例制备的纳米金掺杂自组装多肽活性物通过人体斑贴安全性测试。

试验2：皮肤皱纹修复性能测试

将上述所有的实施例和对比例制备的纳米金掺杂自组装多肽活性物进行人体皮肤皱纹测试，测试仪器为皮肤表面纹理分析系统VisioScan VC20plus，测试参数为SEw值。测试方法为：每组纳米金掺杂自组装多肽活性物稀释样品选用30名健康女性，年龄在35±2周岁，脸颊及眼角处涂抹样品，样品涂抹前和样品使用四周后用仪器进行皮肤皱纹程度的测试，平行测试3 次，取平均值，记录SEw值。

其中变化率即相对使用前的变化率，计算公式如下：

四周后的△(差值)＝L

使用四周后相对使用前的皮肤SEw值

式中，L

L

N——受试者人数。

测试结果如表3，SEw值表征皮肤算术平均粗糙程度，数值越低，皮肤皱纹程度越低， SEw值的变化率越高，样品对皮肤皱纹的修复效果越好。

表3皮肤皱纹测试结果

试验3：皮肤纹理度测试

将上述所有的实施例和对比例制备的纳米金掺杂自组装多肽活性物进行人体皮肤纹理度值测试，测试仪器为皮肤快速光学成像分析系统Derma TOP，并应用相应软件分析皮肤算术平均粗糙度Ra值。测试方法为：每组金纳米参与的多肽自组装产物稀释样品选用30名健康女性，年龄在30±2周岁，脸颊处涂抹样品，样品涂抹前和样品使用四周后用仪器进行皮肤粗糙度测试，平行测试3次，取平均值，记录Ra值。

其中变化率即相对使用前的变化率，计算公式如下：

四周后的△(差值)＝M

使用四周后相对使用前的皮肤粗糙度值

式中，M0——受试区使用化妆品前的Ra值。

M4——受试区使用化妆品四周后的Ra值。

N——受试者人数。

测试结果如表4，Ra值表征皮肤算术平均粗糙度，数值越低，皮肤纹理度越低，Ra值的变化率越高，样品对皮肤粗糙度的修复效果越好。

表4皮肤纹理度测试结果

试验4：人体经皮水分流失率测试

将上述所有的实施例和对比例制备的纳米金掺杂自组装多肽活性物用一定溶剂稀释后进行人体经皮水分流失测试，测试仪器为皮肤表面水分流失测试仪Tewameter TM300(德国CK公司)。

测试方法为：每组纳米金掺杂自组装多肽活性物稀释样品选用30名健康女性，年龄在30±2周岁，脸颊处涂抹样品，样品涂抹前(A

其中每组金纳米参与的多肽自组装产物样品用水进行稀释，配制比例为纳米金掺杂自组装多肽活性物：水＝1:5。

其中变化率即相对使用前的变化率，计算公式如下：

四周后的△(差值)＝A

使用四周后相对使用前的经皮水流失率值

式中，A

A

N——受试者人数。

经皮水分流失率越小，水分散失越少，锁水能力越强，皮肤的屏障越好；经皮水流失率值变化率越大，则样品保水锁水效果越好。经皮水分流失率统计结果，见表5。

表5人体经皮水分流失测试结果

试验5：自由基清除率测试

将上述所有的实施例和对比例制备的纳米金掺杂自组装多肽活性物进行DPPH自由基清除率的抗氧化测试，同时为了更直观的观察纳米金掺杂自组装多肽活性物的抗氧化能力，选用常见的抗氧化剂Vc作为对照。具体方法如下：

实验步骤：试管中加入2mL DPPH乙醇溶液和2mL待测样品(纳米金掺杂自组装多肽活性物、Vc溶液)，震荡混匀后避光反应30min，于517nm处测吸光值A，同时测2mL DPPH乙醇溶液和2mL无水乙醇混合液的吸光值A0，以及2mL无水乙醇和2mL待测样品混合液的吸光值Ab，计算DPPH·自由基清除率：

DPPH·自由基的清除率(％)＝(A0-(A-Ab))/A0×100

测试结果如表1所示，自组装产物的DPPH清除率越高，纳米金掺杂自组装多肽活性物的抗氧化性能越强。

表6自由基清除率测试结果

应用例

本应用例提供了一种含实施例1提供的纳米金掺杂自组装多肽活性物的修护乳，具体配方如下：

选取实施例1的产品，涂抹于志愿者眼周，使用4周后，眼周细纹变化如图1所示。

图1中，从左至右分别为受试者使用前、使用2周和使用4周时的眼周皱纹图(仪器为VisioScan VC98(Courage&Khazaka,德国)拍摄)。图1中白色(亮色)区域代表眼周细纹区域，由此可知，第2周和第4周眼部细纹有明显减少。

试验结果分析：

(1)结合实施例1～6和对比例1～4并结合表3～6可以看出，本申请通过采用嗜热栖热菌发酵产物以及乙酰基六肽-8，棕榈酰五肽-4、谷胱甘肽等活性多肽作为自组装多肽的底物，可有效的提升自组装所得产物的修复、保水、抗皱等功效。

上述原因可能在于，对于嗜热栖热菌发酵产物，其含有核酸、蛋白、脂类、多糖、次生代谢物、同时含有谷胱甘肽等天然多肽以及带不同电荷、不同疏水性的氨基酸，可改变活性肽之间的非共价相互作用，促进活性肽的自组装，丰富自组装产物和效用的多样性，最终，有效提升产物对皮肤的修护、保水、抗皱等功效。

对于乙酰基六肽-8，棕榈酰五肽-4、谷胱甘肽等活性多肽，乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽 -4与谷胱甘肽具有乙酰基和棕榈酰基等修饰基，一方面，有利于协同促进多肽的自组装，得到种类更丰富的自组装多肽；另一方面，乙酰基和棕榈酰基具有较好的亲油性，有利于自组装多肽活性物向皮肤深层的渗透，提高修护、保水、抗皱等功效。

(2)结合实施例1～6和对比例5并结合表3～6可以看出，本申请在自组装多肽中加入纳米金，可有效的提升自组装所得产物的修复、保水、抗皱等功效。其原因可能在于，纳米金与谷胱甘肽具有较高的亲和性，纳米金表面活性基团可与多肽分子中巯基结合，从而增加自组装多肽体系的稳定性，减少自组装多肽的变性的可能，保障纳米金掺杂自组装多肽活性物修护效果的发挥。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。