经表观遗传学改造利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法
文献发布时间：2023-06-19 16:04:54
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种经表观遗传学改造利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法。
背景技术
6-甲基水杨酸为重要化工原料。目前6-甲基水杨酸的生产主要通过2-氨基-6-甲基苯甲酸经过重氮化反应之后再水解即可获得目标产物。尽管化学合成效率比较高，但是化学合成存在反应副产物分离困难，对生产设备要求高，环境不友好等缺点。
植物内生真菌生长迅速，易于进行大规模培养，植物内生菌已经发展成为小分子的细胞工厂。利用表观遗传修饰剂对内生真菌进行改造，有望激活内生真菌的沉默基因，改变微生物的代谢途径，获得新的代谢产物。
发明内容
本发明提供了一种经表观遗传学改造利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法，步骤包括：
(1)从钩藤植物中分离纯化获得内生真菌；
(2)制备种子液：取活化的所述内生真菌菌种加入含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，培养3～7天获得种子液；
(3)扩大培养：将种子液接种到含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，在25～30℃，150～200rpm/min条件下培养5～15天，获得发酵液；
(4)提取分离；培养完成后使用乙酸乙酯萃取所述发酵液3次以上，合并乙酸乙酯提取液，旋干，把旋干获得的浸膏先使用硅胶柱进行除杂，再通过重结晶获得6-甲基水杨酸目标产物。
进一步地，所述内生真菌为Shiraia sp.。
进一步地，所述PDB培养基的配制方法为：200g新鲜土豆切碎，置于500mL去离子水中煮沸20min，用纱布过滤弃土豆泥，往滤液中加入20g葡萄糖，充分溶解用去离子水定容至1L，再使用5M NaOH溶液或5M盐酸溶液调节培养基pH为5～8，获得所述PDB培养基。
进一步地，所述表观遗传修饰剂为5-氮胞苷，加入表观遗传修饰剂的PDB培养基中所述5-氮胞苷含量为50～500μM。
进一步地，所述步骤(3)中，所述种子液的接种比例为5％～20％。
进一步地，所述步骤(3)中，所述培养条件为：27℃，180rpm/min，培养7天。
进一步地，所述步骤(3)中，PDB培养基中还加入有丹参提取物，所述丹参提取液的制备方法为：将丹参粉碎，过100目筛网，过筛粉末按固液质量比固/液＝1/8的比例浸泡在体积分数为75％的乙醇水溶液中，50±5℃恒温提取6h以上，离心，取上清液，减压浓缩，干燥，即获得所述丹参提取物。
进一步地，所述丹参提取物的加入量为PDB培养基中5-氮胞苷质量的1/2。
本发明的有益效果在于：通过试验发现，在不添加表观遗传修饰剂5-氮胞苷的情况下，发酵内生真菌为Shiraia sp.，却无法获得6-甲基水杨酸。而加入5-氮胞苷后，内生真菌生产6-甲基水杨酸的产率高达226.4mg/L，目标产物产量高，产品纯度高，操作简单，技术要求低，能够进行工业化大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例2发酵产物6-甲基水杨酸的1HNMR谱图；
图2为本发明实施例2发酵产物6-甲基水杨酸的13CNMR谱图。
具体实施方式
下面结合实施例进行详细的说明：
实施例1
一种经表观遗传学改造利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法，步骤包括：
(1)从钩藤植物中分离纯化获得内生真菌，生物公司通过18S rDNA鉴定所述内生真菌为Shiraia sp.；
(2)制备种子液：取活化的所述内生真菌菌种加入含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，培养5天获得种子液；所述PDB培养基的配制方法为：200g新鲜土豆切碎，置于500mL去离子水中煮沸20min，用纱布过滤弃土豆泥，往滤液中加入20g葡萄糖，充分溶解用去离子水定容至1L，再使用5M NaOH溶液或5M盐酸溶液调节培养基pH为7，获得所述PDB培养基；所述表观遗传修饰剂为5-氮胞苷，加入表观遗传修饰剂的PDB培养基中所述5-氮胞苷含量为50μM；
(3)扩大培养：将种子液接种到所述含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，在25℃，150rpm/min条件下培养5天，获得发酵液；其中所述种子液的接种比例为10％；
(4)提取分离；培养完成后使用乙酸乙酯萃取所述发酵液3次，合并乙酸乙酯提取液，旋干，把旋干获得的浸膏先使用硅胶柱进行除杂，再通过重结晶获得6-甲基水杨酸目标产物。
实施例2
一种经表观遗传学改造利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法，步骤包括：
(1)从钩藤植物中分离纯化获得内生真菌，生物公司通过18S rDNA鉴定所述内生真菌为Shiraia sp.；
(2)制备种子液：取活化的所述内生真菌菌种加入含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，培养5天获得种子液；所述PDB培养基的配制方法为：200g新鲜土豆切碎，置于500mL去离子水中煮沸20min，用纱布过滤弃土豆泥，往滤液中加入20g葡萄糖，充分溶解用去离子水定容至1L，再使用5M NaOH溶液或5M盐酸溶液调节培养基pH为7，获得所述PDB培养基；所述表观遗传修饰剂为5-氮胞苷，加入表观遗传修饰剂的PDB培养基中所述5-氮胞苷含量为200μM；
(3)扩大培养：将种子液接种到所述含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，在27℃，180rpm/min条件下培养7天，获得发酵液；其中所述种子液的接种比例为10％；
(4)提取分离；培养完成后使用乙酸乙酯萃取所述发酵液3次，合并乙酸乙酯提取液，旋干，把旋干获得的浸膏先使用硅胶柱进行除杂，再通过重结晶获得6-甲基水杨酸目标产物。
本实施例所得目标产物核磁共振氢谱碳谱如图1、图2所示。
实施例3
一种经表观遗传学改造利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法，步骤包括：
(1)从钩藤植物中分离纯化获得内生真菌，生物公司通过18S rDNA鉴定所述内生真菌为Shiraia sp.；
(2)制备种子液：取活化的所述内生真菌菌种加入含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，培养5天获得种子液；所述PDB培养基的配制方法为：200g新鲜土豆切碎，置于500mL去离子水中煮沸20min，用纱布过滤弃土豆泥，往滤液中加入20g葡萄糖，充分溶解用去离子水定容至1L，再使用5M NaOH溶液或5M盐酸溶液调节培养基pH为7，获得所述PDB培养基；所述表观遗传修饰剂为5-氮胞苷，加入表观遗传修饰剂的PDB培养基中所述5-氮胞苷含量为300μM；
(3)扩大培养：将种子液接种到所述含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，在28℃，180rpm/min条件下培养10天，获得发酵液；其中所述种子液的接种比例为10％；
(4)提取分离；培养完成后使用乙酸乙酯萃取所述发酵液3次，合并乙酸乙酯提取液，旋干，把旋干获得的浸膏先使用硅胶柱进行除杂，再通过重结晶获得6-甲基水杨酸目标产物。
实施例4
一种经表观遗传学改造利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法，步骤包括：
(1)从钩藤植物中分离纯化获得内生真菌，生物公司通过18S rDNA鉴定所述内生真菌为Shiraia sp.；
(2)制备种子液：取活化的所述内生真菌菌种加入含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，培养5天获得种子液；所述PDB培养基的配制方法为：200g新鲜土豆切碎，置于500mL去离子水中煮沸20min，用纱布过滤弃土豆泥，往滤液中加入20g葡萄糖，充分溶解用去离子水定容至1L，再使用5M NaOH溶液或5M盐酸溶液调节培养基pH为7，获得所述PDB培养基；所述表观遗传修饰剂为5-氮胞苷，加入表观遗传修饰剂的PDB培养基中所述5-氮胞苷含量为500μM；
(3)扩大培养：将种子液接种到所述含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，在30℃，200rpm/min条件下培养15天，获得发酵液；其中所述种子液的接种比例为10％；
(4)提取分离；培养完成后使用乙酸乙酯萃取所述发酵液3次，合并乙酸乙酯提取液，旋干，把旋干获得的浸膏先使用硅胶柱进行除杂，再通过重结晶获得6-甲基水杨酸目标产物。
对比例1
一种经表观遗传学改造利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法，步骤包括：
(1)从钩藤植物中分离纯化获得内生真菌，生物公司通过18S rDNA鉴定所述内生真菌为Shiraia sp.；
(2)制备种子液：取活化的所述内生真菌菌种加入含有表观遗传修饰剂的PDB培养基中，培养5天获得种子液；所述PDB培养基的配制方法为：200g新鲜土豆切碎，置于500mL去离子水中煮沸20min，用纱布过滤弃土豆泥，往滤液中加入20g葡萄糖，充分溶解用去离子水定容至1L，再使用5M NaOH溶液或5M盐酸溶液调节培养基pH为7，获得所述PDB培养基；所述表观遗传修饰剂为5-氮胞苷，加入表观遗传修饰剂的PDB培养基中所述5-氮胞苷含量为200μM；
(3)扩大培养：将种子液接种到所述含有表观遗传修饰剂和丹参提取物的PDB培养基中，在27℃，180rpm/min条件下培养7天，获得发酵液；其中所述种子液的接种比例为10％；其中所述丹参提取液的制备方法为：将丹参粉碎，过100目筛网，过筛粉末按固液质量比固/液＝1/8的比例浸泡在体积分数为75％的乙醇水溶液中，50±5℃恒温提取6h，离心，取上清液，减压浓缩，干燥，即获得所述丹参提取物；丹参提取物的加入量为PDB培养基中5-氮胞苷质量的1/2；
(4)提取分离；培养完成后使用乙酸乙酯萃取所述发酵液3次，合并乙酸乙酯提取液，旋干，把旋干获得的浸膏先使用硅胶柱进行除杂，再通过重结晶获得本对比例的6-甲基水杨酸目标产物。
对比例2
一种利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法，步骤包括：
(1)从钩藤植物中分离纯化获得内生真菌，生物公司通过18S rDNA鉴定所述内生真菌为Shiraia sp.；
(2)制备种子液：取活化的所述内生真菌菌种加入PDB培养基(不含5-氮胞苷和丹参提取物)中，培养5天获得种子液；所述PDB培养基的配制方法为：200g新鲜土豆切碎，置于500mL去离子水中煮沸20min，用纱布过滤弃土豆泥，往滤液中加入20g葡萄糖，充分溶解用去离子水定容至1L，再使用5M NaOH溶液或5M盐酸溶液调节培养基pH为7，获得所述PDB培养基；
(3)扩大培养：将种子液接种到所述PDB培养基(不含5-氮胞苷和丹参提取物)中，在27℃，180rpm/min条件下培养7天，获得发酵液；其中所述种子液的接种比例为10％；
(4)提取分离；培养完成后使用乙酸乙酯萃取所述发酵液3次，合并乙酸乙酯提取液，旋干，把旋干获得的浸膏先使用硅胶柱进行除杂，再通过重结晶获得本对比例的6-甲基水杨酸目标产物。
对比例3
一种利用内生真菌生产6-甲基水杨酸的方法，步骤包括：
(1)从钩藤植物中分离纯化获得内生真菌，生物公司通过18S rDNA鉴定所述内生真菌为Shiraia sp.；
(2)制备种子液：取活化的所述内生真菌菌种加入含有丹参提取物的PDB培养基(不含5-氮胞苷)中，培养5天获得种子液；所述PDB培养基的配制方法为：200g新鲜土豆切碎，置于500mL去离子水中煮沸20min，用纱布过滤弃土豆泥，往滤液中加入20g葡萄糖，充分溶解用去离子水定容至1L，再使用5MNaOH溶液或5M盐酸溶液调节培养基pH为7，获得所述PDB培养基；所述丹参提取液的制备方法为：将丹参粉碎，过100目筛网，过筛粉末按固液质量比固/液＝1/8的比例浸泡在体积分数为75％的乙醇水溶液中，50±5℃恒温提取6h，离心，取上清液，减压浓缩，干燥，即获得所述丹参提取物；加入丹参提取物的PDB培养基中所述丹参提取物含量为100μM；
(3)扩大培养：将种子液接种到上述含有丹参提取物的PDB培养基(不含5-氮胞苷)中，在27℃，180rpm/min条件下培养7天，获得发酵液；其中所述种子液的接种比例为10％；
(4)提取分离；培养完成后使用乙酸乙酯萃取所述发酵液3次，合并乙酸乙酯提取液，旋干，把旋干获得的浸膏先使用硅胶柱进行除杂，再通过重结晶获得本对比例的6-甲基水杨酸目标产物。
分别测量各实施例和对比例所得6-甲基水杨酸的重量，计算发酵产量(单位体积培养基获得目标产物的重量)，结果如下表所示。
由表可知，在不添加表观遗传修饰剂5-氮胞苷的情况下，发酵内生真菌为Shiraiasp.，却无法获得6-甲基水杨酸。而加入5-氮胞苷后，内生真菌生产6-甲基水杨酸的产率可高达226.4mg/L，目标产物产量高。对比实施例2和对比例1可知，丹参提取物对含有表观遗传修饰剂的PDB培养基发酵体系的发酵效果具有促进作用，使得目标产物6-甲基水杨酸产量进一步提高。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。