介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物及微流控芯片平台的构建

技术领域

本发明涉及一种介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物及微流控芯片平台的构建。

背景技术

赖氨酸乙酰化（Lysine acetylation，Kac）是一种广泛的动态、可逆的蛋白质翻译后修饰（Post-Translational Modification，PTM），广泛参与基因转录、蛋白降解、细胞代谢、应激反应等多个细胞过程，在代谢相关疾病和神经退行性疾病中发挥重要调控作用。然而，由于乙酰化修饰蛋白质的含量很低，在鉴定过程中其信号会被大量的非乙酰化蛋白所干扰，给其鉴定及功能研究带来了很大的挑战，为了更好的研究它们，亟需开发高效、特异的赖氨酸乙酰化富集策略。目前常用的Kac肽富集方法包括琼脂糖富集、等电聚焦、强阳离子交换、免疫亲和法等。其中免疫亲和法是最常见且最有效的富集方法，但成本高且对环境敏感。同时，由于生物抗体的底物特异性强，需要对多种亲和试剂进行测试才能达到理想的富集性能。因此，开发一种特异性强、稳定性好、成本低且易于制备的材料对Kac肽的富集具有良好的现实意义。

分子印迹技术（Molecular Imprinting Technique，MIT）是一种模拟抗原/抗体相互作用原理以合成预先选择固定相的技术，广泛应用于材料合成、分离纯化、给药系统等领域。凭借量身定制的选择性等优势，已在靶向蛋白质组学领域展现出巨大的应用潜力。在MIT基础上制备的分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）具有分子形状、空间结构选择性的特点。与同样依赖于分子识别作用的抗体相比，MIP具有更好的热稳定性、物理和化学稳定性。近年来，将不同肽段中常见的短肽段作为单一模板进行固定，MIP能够实现多种修饰肽在特定位置上的富集。另外，董襄朝课题组使用表位印迹方法制备的MIP成功实现了组蛋白和HeLa细胞裂解液中乙酰化肽的特异性富集。该技术的应用不仅保证了目标肽的良好特异性和选择性，而且具有成本低、经济价值高的优势，对实现复杂蛋白质生物样品中目标肽的选择性富集具有巨大应用潜力。尽管MIP具有许多吸引人的特性，但MIP从复杂样品中捕获模板的能力有限，并且MIP的选择性和/或亲和力较低。为了提高MIP的印迹性能，纳米材料的引入逐渐受到重视。

SBA-15介孔分子筛材料具有均匀的六边形通道、高表面积、较厚的孔壁（3.1-6.4nm）、大孔径（46-300 Å）与窄尺寸分布。这些特性使其在吸附、催化、生物分离及纳米组装等方面具有极大的潜在应用价值。与空间结构和结合位点完全匹配模板分子的MIT相结合，制备基于介孔二氧化硅材料的MIP研究，目前已广泛应用于吸附分离、微型反应器、药物传递、择形催化等领域。同时，介孔二氧化硅材料也已经应用于对蛋白质酶解液中多肽的富集。高度有序的孔结构，可以通过尺寸排阻去除高分子量的物质以确保目标物的高选择性，大的表面积能够高容量富集可以通过孔隙的较小肽。若干扰肽进入孔隙，可通过不同官能团与表面基团的亲水/疏水作用进一步分离混合物。然而，基于SBA-15介孔分子筛的MIP应用于多肽分离和富集方面的研究鲜有报道。利用SBA-15介孔分子筛的高效性和孔径效应制备分子印迹聚合物，有望解决传统MIP中印迹位点“包埋”现象，实现蛋白质组学领域中多肽的特异性识别。中国专利CN113304708A公开了以SBA-15介孔分子筛为载体，2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸为单体，以N-乙酰神经氨酸为片段模板制备基于分子筛的表面定向印迹聚合物（SBA-15@MIP）。进而制备了SBA-15@MIP糖蛋白微反应器，用于蛋白质样品的N-糖肽的选择性富集。

微流控技术是指将微小流体的分析实验室功能集成到芯片上的技术，具有分析速度快、低成本、高通量、多功能集成等特点，在生物化学、医药、环境检测等领域广泛应用，已成为近年来备受关注的前沿分析技术之一。该技术能够实现样品处理、分离、分析等一系列过程的集成化，是一种能够快速准确完成分析过程的新兴技术，涉及表面化学、电化学、微加工等多学科领域。随着微加工技术的不断进步，微流控芯片内多功能组件的集成，更好地体现了其高效、操作简便、仿生等特点，使其在细胞培养研究、样品分析，以及模拟体内器官的组织结构、微环境和机械力实现类器官机能方面展现了突出的优势。

微流控芯片将生物和化学等领域所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离和检测等基本操作单元整合在小的操作平台上，在蛋白质分离分析中得到了广泛应用。在微流控芯片基础上搭建的多维分离系统，已经应用于固相萃取领域，实现了样品的在线自动化分离和富集，解决了多维系统步骤繁琐，各维度间运行条件不兼容，难以实现在线样品处理的问题。目前基于微流控芯片分析平台上的样品浓缩富集技术被广泛应用，是提高低丰度蛋白的预富集分析效率和灵敏度的一种行之有效的方法。CN106362810A报道了一种分子印迹聚合物膜修饰-两电极电化学微流控芯片及其制备方法，它是在金属电极上修饰有分子印迹聚合物。通过对将分子印迹技术引入到微流控芯片的制备中，构建了一种新型的微流控电化学传感器平台。

本方法首次掺杂SBA-15介孔分子筛并采用亲水性乙二醇二甲基丙烯酸酯交联剂，开发出一种新型的乙酰化分子印迹材料。并将其与蛋白质分级柱、芯片变性区、酶反应器进行在线整合，成功构建一种新型的蛋白质样品前处理平台，实现了蛋白质在线分级、变性、酶解和乙酰化修饰肽的高效富集。

发明内容

本发明的目的是提供一种SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物及微流控芯片平台的构建。将SBA-15介孔分子筛掺杂到乙酰化分子印迹聚合物中，可明显改善模板肽的印迹效果。同时在制备时加入聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDA），与二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）共交联可以增加聚合物的亲水性，有效减少NIP的吸附量，从而取得更加显著的印迹效果。

本发明提供的SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物的原料质量配比为：

SBA-15介孔分子筛 0.00-1.44%

KacQLAT 1.66-2.51%

丙烯酸锌 2.27-4.46%

聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 0.00-16.78%

二甲基丙烯酸乙二醇酯 17.37-14.85%

甲醇 31.43-41.26%

N, N-二甲基甲酰胺 28.13-36.93%

偶氮二异丁腈 0.40-0.524%

上述的各原料的质量组成之和为100%。

本发明提供的SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物的制备方法，具体包括下述步骤：

1）按计量将功能单体丙烯酸锌，模板KacQLAT，掺杂剂SBA-15介孔分子筛，引发剂偶氮二异丁腈，交联剂PEGDA与EDMA，溶于甲醇和N, N-二甲基甲酰胺的混合致孔剂溶液中；超声（功率150W）溶解10-15 min，使之溶解、澄清，通入氮气以除去液体中的氧气，密封，置于60℃水浴中反应12 h。

2）将上述得到的乙酰化分子印迹聚合物置于研钵中研细，先用乙腈冲洗，除去未反应的残留杂质。

不含SBA-15介孔分子筛的乙酰化分子印迹聚合物的合成除把SBA-15介孔分子筛去掉之外,其余步骤同上。

不含PEGDA的分子印迹聚合物的合成除把PEGDA的量用交联剂EDMA代替外,其余步骤同上。

非印迹聚合物（NIP）的合成除不加模板分子KacQLAT外,其余步骤同上。

本发明提供的一种SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物的电化学传感器的制备方法包括以下步骤：

(1) 用GCE氧化铝水浆在抛光布上对玻碳电极（GCE）进行抛光，然后用硫酸溶液、去离子水和乙醇分别清洗；

(2) 将SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物加入到壳聚糖溶液中，再加入的多壁碳纳米管DMF溶液以增加导电性，得到SBA-15@MIP混合物溶液；将SBA-15@MIP混合物溶液滴涂到步骤 (1)的GCE 的表面，玻碳电极在50℃下干燥15 min，将玻碳电极浸泡在乙腈/乙酸/水（5/5/90，v/v/v）中以去除模板KacQLAT，室温干燥，得到SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物的电化学传感器SBA-15@MIP/GCE。

(3) 电化学传感器检测：选择含KCl的K3[Fe(CN)6]的溶液作为电解质溶液；去除模板SBA-15@MIP/GCE与SBA-15@NIP/GCE放入含模板的50 mM Tris-HCl（pH 8.0）溶液中进行孵育；为了去除电极膜表面的非特异性吸附，将吸附后的电传感器放入Tris-HCl缓冲盐中；最后，将吸附完成的电传感器置于电解液中，平衡后通过DPV测量电传感器的电流响应；所有测试平行测量三次；电传感器吸附性能由电流的变化表征，电流变化量的计算是按照公式（1）

印迹因子（IF） 被用于评估 MIP 的印迹性能：

本发明提供了一种用于富集乙酰化肽的多功能微流控芯片集成平台（装置），主要包括蛋白质分级柱单元、变性芯片单元、酶反应器单元和SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹整体柱单元和微量数字注射泵以及FEP连接管线；变性芯片单元前连接蛋白质分级单元，后面依次连接酶反应器单元和SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹整体柱单元，四个单元用FEP管串联连接，然后芯片用夹具进行固定；通道入口的FEP管和入口D、E与用于调节流速的微量数字注射泵连接，液体最终出口端接小型离心管；SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹整体柱单元最后连接用于监测的液相色谱串联质谱装置；所述的蛋白质分级柱两端设入口A和出口B并连接；所述的变性芯片分为相互连接的变性I区和变性II区，变性I区的前端设入口C和还原剂的入口D，变性II区的前端设用于烷基化试剂的入口E，变性II区的后端设出口F，其中每个区分别包含可任意调节通道总长度多组蛇形通道；所述的酶反应器单元为设出口和入口的酶反应器构成；所述的乙酰化分子印迹整体柱单元为设出口和入口的SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹整体柱构成。所述的变性柱每条通道长2 cm，通道宽250 μm，深100 μm。

本发明提供了一种多功能微流控芯片集成平台在富集乙酰化肽方面的应用，具体的应用方法步骤包括：

1）先将蛋白质用去超纯水配制成1.5 mg/mL的浓度，使用数字注射泵以0.3 μL/min的流速从入口A注入50 μL，从B出口流出。同时，用50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）配制的20 mM DTT 和30 mM IAA以0.3 mL/min的流速分别从入口D和E注入50 μL到芯片。在第一个蛇形通道中完成蛋白质的还原，第二个蛇形通道中完成蛋白质的烷基化。然后，经过变性后的蛋白质溶液依次进入IMER进行酶解，SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹整体柱对酶解液中的乙酰化肽进行富集。然后，以离线的方式在1.0 μL/min的流速下，50 μL 50mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）和100 μL ACN/HAC/H

2）用超纯水对分级柱进行淋洗(0.3 μL/min, 20 μL)，并弃去淋洗液。然后，将入口A处的溶液换成H

本发明提供了含SBA-15介孔分子筛的乙酰化分子印迹聚合物的制备方法，通过实验设计，找到合成乙酰化分子印迹聚合物中的SBA-15介孔分子筛的最适宜掺杂量，掺杂剂类型（与钛纳米管TNTs做对比）进行了优化，制备了对模板具有良好印迹效果和选择性高的分子印迹聚合物。PEGDA是一种亲水的交联单体，它含有短的低聚物(乙二醇)侧链，已被并入聚合物中提高聚合物材料的亲水性，可以有效减少非亲水性肽的非特异性吸附。此外，它的加入可以增加印迹腔的亲水性，提高分子印迹聚合物对亲水模板分子的选择性。因此，亲水性交联剂PEGDA的加入可以显著提高此分子印迹聚合物对KacQLAT的印迹效果（IF =3.2）。将其与其他功能单元（蛋白质分级、变性、酶解功能单元），搭建了可用于乙酰化肽富集的微流控芯片集成平台。因此，本发明可用于乙酰化肽的高效分离和特异性富集。

附图说明

图1为本发明的MIP（a）、NIP（b）和SBA-15介孔分子筛（c）的扫描电镜图。

图2为本发明制备的乙酰化分子印迹聚合物考察掺杂剂类型对模板的印迹效果和吸附效果的对比图。

图3为本发明不同电极的循环伏安图（a. SBA-15@MIP/GCE模板分子提取之后；b.SBA-15@MIP/GCE模板分子提取之前；c. SBA-15@NIP/GCE；d. GCE）。

图4为本发明搭建的多功能微流控芯片集成平台示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：优化分子印迹聚合物的制备条件是为了提高其对模板分子的特异性，使印迹效果更加显著。为了考察功能单体/交联剂比例、掺杂剂类型对模板的印迹效果和吸附效果的影响。具体操作步骤如下：

a.SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物的制备方法：

将质量分数SBA-15介孔分子筛（8-12 nm）0.50%，模板KacQLAT（95%, 上海强耀生物科技有限公司，货号04010047537）1.44%，功能单体丙烯酸锌3.97%，交联剂PEGDA 15.81%和EDMA 9.50%，引发剂偶氮二异丁腈0.46%，溶于致孔剂甲醇36.05%和N, N-二甲基甲酰胺32.27%的混合溶液中；超声（功率150 W）溶解15 min，使之溶解、澄清，之后通入氮气，除去预聚合液中的氧气，再将预聚合液密封，置于60℃恒温水浴锅中反应12 h。

乙酰化赖氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-苏氨酸，命名参考文献Talanta 2020,224:121810 Wei et al.。具体地，乙酰化赖氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-苏氨酸（KacQLAT）。参考文献：“Wei Z H, Zhang X, Zhao X, Jiao Y J, Huang Y P, Liu Z S.Construction of a microfluidic platform integrating online proteinfractionation, denaturation, digestion, and peptide enrichment. Talanta,.”，摘要表述中“a lysine-glycine-glycine (KGG) imprinted monolith”。

b. 将上述得到的分子印迹聚合物（MIP）产物先用乙腈冲洗3次，除去未反应的残留杂质，50℃干燥2 h，置于研钵中研细，得到尺寸约5-10 μm的分子印迹聚合物。

非印迹聚合物（NIP）的合成除不加模板分子KacQLAT外,其余步骤同上。

结果表明，相对于NIP，MIP具有更多的孔结构，孔径大小为100 nm-250 nm，颗粒表面也更加粗糙；SBA-15介孔分子筛显示出有序的介孔结构（见图1）。不同的掺杂剂类型对比发现，掺杂SBA-15介孔分子筛的乙酰化分子印迹聚合物具有最高的印迹因子（见图2）。

SBA-15介孔分子筛含量为0.00%时，表示无掺杂SBA-15介孔分子筛的分子印迹聚合物的合成。与提供支持的实施例1中SBA-15介孔分子筛掺杂的分子印迹聚合物作比较，得到不同的掺杂剂对分子印迹聚合物的印迹效果的影响。

实施例2：所制备的基于分子印迹电极技术的电化学传感器在检测模板KacQLAT中的应用。具体步骤如下：

a. SBA-15@MIP/GCE电传感器的制备：

使用滴涂法制备SBA-15@MIP/GCE电传感器。首先，分别用1.0、0.3和0.05 μM的GCE氧化铝水浆在抛光布上对玻碳电极（GCE）进行抛光，然后用硫酸溶液（1 M）、去离子水和乙醇分别清洗10 min。之后，将2 mg印迹聚合物加入到 1 mL壳聚糖溶液（0.5% wt，含20 μL的乙酸）中，再加入 50 μL（1 mg/mL）的多壁碳纳米管DMF溶液以增加导电性。为了使聚合物和多壁碳纳米管均匀分散，将配置的混合物超声处理混合5 min。最后，将 10 μL SBA-15@MIP混合物滴涂到 GCE 的表面，50℃下干燥15 min。将干燥后的玻碳电极浸泡在乙腈/乙酸/水（5/5/90，v/v/v）中以去除模板肽KacQLAT，室温干燥，得到SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物的电化学传感器SBA-15@MIP/GCE。

b. 电化学传感器检测：

该检测在传统的三电极体系中完成，使用铂丝电极作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，所制备的基于分子印迹电极技术的电化学传感器作为工作电极，选择0.02mol/L KCl的5×10

电化学测量流程如下，首先，我们将去除模板的SBA-15@MIP/GCE与SBA-15@NIP/GCE 放入模板溶液（pH 8.0，50 mM Tris-HCl，20 mL）中进行孵育。之后，为了去除电极膜表面的非特异性吸附，将载药的电传感器放入Tris-HCl缓冲盐（pH 8.0，50 mM）中5 min。最后，我们将吸附完成的电传感器置于电解液中，平衡15 min后通过DPV测量电传感器的电流响应。本实验中所有测试平行测量三次。电传感器吸附性能由电流的变化表征，电流变化量的计算是按照公式（1）

印迹因子（IF） 被用于评估 MIP 的印迹性能，IF计算是按照公式（2）：

图3显示了基于分子印迹电极技术的电化学传感器在pH 8.0的50 mM Tris-HCl缓冲液中检测KacQLAT的循环伏安法曲线。

实施例3：为了降低样品消耗和损失、缩短分析时间和成本，实现自动化、集成化目标，搭建了多功能微流控芯片集成平台。具体步骤如下：

a. 样品在线处理：

变性芯片前连接蛋白质分级，后面连接酶反应器和乙酰化分子印迹富集柱，四个单元用细连接管进行在线串联，综合考虑变性通道的长度需求和尺寸要求及各储液池位置分布。在线变性柱分为变性I区和变性II区，每个区域均包含多组蛇形通道，每条通道长 2cm，可任意调节通道总长度，所有通道宽250 μm，深100 μm。制备好的芯片置于夹具上，将聚全氟乙丙烯（FEP）热缩管插入各通道末端的出入口（如图4所示的入口A、C、D、E，出口B、F），用螺母旋紧固定，通道入口的FEP管与微量注射泵连接，出口端接小型离心管。调节微量注射泵的流速，考察通路体积及流量的精准控制；将各个功能区之间用 FEP 管连接，打开总入口处的微量注射泵。

b. 蛋白质分级柱的制备：

将质量分数模板二氧化钛纳米1.20%，引发剂偶氮二异丁腈0.15%，功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯16.02%和乙二醇二甲基丙烯酸酯7.21%溶于致孔剂正十二醇47.28%和环己醇28.14%的混合溶液中；超声（功率150W）溶解15 min，使之溶解、澄清，之后通入氮气，除去预聚合液中的氧气，再将预聚合液注入干净的毛细管（内径=250 μm）中，将两端用橡胶封住，于60℃恒温水浴锅中反应3.5 h，合成的整体柱用乙腈冲洗，除去未反应的单体和致孔剂，然后4.5 mol/L氨水注入已合成的毛细管，60℃水浴2 h使聚合物表面接枝上氨基，用乙腈冲洗除去未反应的单体和致孔剂；

c. 酶反应器的制备：

将质量分数功能单体TRIM（三甲氧基丙基三甲基丙烯酸酯） 24.12%、引发剂偶氮二异丁腈0.22%溶解于致孔剂甲苯20.34%和异辛烷55.32%的混合溶液中；超声（功率150W）溶解15 min，使之溶解、澄清，之后通入氮气，除去预聚合液中的氧气，再将预聚合液注入干净的毛细管中，将两端用橡胶封住，注入毛细管（内径=250 μm）中，置于50℃水浴中反应 24h，反应结束后，用乙腈冲洗未反应的单体和致孔剂。

用20 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）配制10 mg/mL 胰蛋白酶和1 mg/mL三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（TCEP）溶液，将胰蛋白酶溶液与TCEP溶液以10:1（v/v）混合，置25℃反应3h，之后在4℃下以10000 r/min离心10 min，放置至室温后，取上清液，加入一定量的过硫酸铵和N,N-亚甲基双丙烯酰胺，使浓度分别为1 mg/mL 和2 mg/mL。将酶衍生液注入合成好的功能区整体柱中，用胶塞将通道两端密封，置25℃反应5 h。反应结束后用20 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）冲洗，4℃冷藏保存。

d. SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹整体柱的制备：

预聚合液的配制与SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹聚合物相同，再将预聚合液注入干净的毛细管（内径=250 μm）中，将两端用橡胶封住，于60

非印迹整体柱的合成除不加模板分子KacQLAT外,其余步骤同上。

图4显示了集成蛋白质分级-变性-酶解-乙酰化肽富集多功能为一体的微流控芯片平台的在线变性技术操作路线。

实施例4：将搭建好的微流控芯片平台用于黄斑变性病人血清提取蛋白的乙酰化肽富集

血清蛋白的提取：取5 mL黄斑变性患者全血置于抗凝管中；然后离心，转速调到3500~4000 r/min，时间为5 min；离心后的血液用准备好的吸管，吸取最上面的血清层，到空白试管里；取100 μL血清，加入200 μL血清蛋白提取试剂盒（上海贝博生物科技有限公司，货号BB-3137-1），冷藏沉淀0.5 h，转速以1000 r/min离心10 min，取上清，将上清液透析、冻干，得到血清提取蛋白。

1）先将血清提取蛋白质用超纯水配制成1.5 mg/mL的浓度，使用数字注射泵以0.3μL/min的流速从入口A注入50 μL，从B出口流出。同时，用50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）配制的20 mM DTT（二硫苏糖醇）和 30 mM IAA（碘乙酰胺）以0.3 mL/min的流速分别从入口D和E注入50 μL到芯片。在第一个蛇形通道中完成蛋白质的还原，第二个蛇形通道中完成蛋白质的烷基化。然后，经过变性后的蛋白质溶液依次进入IMER进行酶解，SBA-15介孔分子筛掺杂的乙酰化分子印迹整体柱对酶解液中的乙酰化肽进行富集。然后，以离线的方式在1.0μL/min的流速下，50 μL 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）和100 μL ACN/HAC/H

2）用超纯水对分级柱进行淋洗(0.3 μL/min, 20 μL)，并弃去淋洗液。然后，将入口A处的溶液换成H

将未处理的血清蛋白质，以及该平台处理后收集到的所有样品，经过冻干、除盐Millipore® ZipTips C18 column（Merck Millipore Led, Ireland），通过LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱法）进行鉴定。

我们将微流控芯片集成平台应用于人血清蛋白样品的预处理后，质谱鉴定结果表明，经过此平台处理后，Kac肽和Kac蛋白的鉴定容量提高1.6倍（44 vs 71）和2.0倍（22 vs43）。该平台蛋白质样品的处理过程包括蛋白质分级、变性、酶解、乙酰化肽富集，完成所有蛋白质样品处理过程，此平台仅需9.1 h。然而，若采用离线方法，样品处理至少需要22.4 h（变性1.3 h，酶解12 h，样品处理9.1 h），主要因为传统方法的变性和酶解不是在线完成，消耗时间比较长分别为1.3 h和12 h。由此可见，本平台将蛋白质样品的处理时间缩短了约2.5倍（从22.4 h到9.1 h）。此外，溶液酶解的样品消耗量为10 mg，而此微流控芯片集成平台的样品消耗量为0.075 mg，比传统方法减少了133倍。由此可见，该微流控芯片平台可显著提高乙酰化修饰的鉴定效果，以及蛋白样品的预处理效率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。