一种猫细小病毒中和性单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种猫细小病毒中和性单克隆抗体及其应用。

背景技术

猫细小病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)，旧名猫瘟热病毒，又名猫全白细胞减少症病毒、猫泛白细胞减少症病毒，感染的临床表现主要有突发高热、顽固性呕吐、腹泻、脱水及白细胞严重减少，该病毒具有高度接触传染性，其中幼年动物的发病率和死亡率最高，对猫而言，各种年龄的猫均可感染，主要感染1岁以下的幼猫。以3-5个月龄未接种疫苗的幼猫最易感，感染率可达70％，病死率为50％-60％。该病毒宿主范围广泛，包括家养和野生猫科动物和一些野犬科动物，例如浣熊和狐狸，犬除外，是目前肉食兽细小病毒感染范围最宽、致病性最强的一种病毒。

FPV对外界因素具有强大的抵抗力，常温下能够存活至少一年。它还具有耐高温(80℃持续30分钟)和低pH值(3.0)的能力。在受FPV感染的猫中，大量的病毒存在于病猫的排泄物中，包括唾液，尿液，粪便和呕吐物中。FPV具有极高的传染性，可以通过患猫直接接触传染，或者通过垫料、用具、螨虫或人作为媒介机械传播，感染的主要门户是通过胃肠道，而较不常见的是通过吸入雾化的病毒粒子而进入呼吸道。

由于FPV的传染性极强，因此感染FPV的患猫需要隔离饲养，并且需要经常对饲养环境进行消毒，以降低环境中的病毒含量。目前对于该病多采用免疫预防，但是免疫幼猫仍会发生该病，因此除了要积极预防外，有必要进行有效的治疗。目前除采用免疫和药物治疗外，通常还进行一些辅助护理方法如补液(补充电解质和葡萄糖)、抗菌和驱虫、止吐与胃肠道保护剂等。有效的中和抗体治疗方法还未广泛用于临床病例。

发明内容

本发明的目的是提供一种猫细小病毒中和性单克隆抗体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的单克隆抗体可以有效中和猫细小病毒。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种杂交瘤细胞株，于2022年5月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022111。

本发明还提供一种猫细小病毒中和性单克隆抗体，所述猫细小病毒中和性单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞分泌产生。

本发明还提供上述的单克隆抗体在制备猫细小病毒预防或治疗药物中的应用。

本发明还提供上述的猫细小病毒中和性单克隆抗体的制备方法，包括将上述的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，获得小鼠腹水，再经纯化，即可得到所述猫细小病毒中和性单克隆抗体。

进一步地，所述纯化采用ProteinA+Protein G亲和层析法。

本发明公开了以下技术效果：

本发明的杂交瘤细胞能够分泌产生猫细小中和单克隆抗体，该单克隆抗体经体外细胞水平中和试验和动物保护性实验证明，具有很高的中和活性，能够特异性地治疗FPV，并且制备简单、操作方便，对于预防和治疗该病具有重大意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是FPV分离株感染细胞后不同时间点IFA检测；

图2是单克隆抗体中和效价检测，其中A：腹水的中和保护率，B：抗体的中和保护率，C：50％中和保护效价；

图3是PCR检测感染前实验动物粪便，其中M：2000bp DNA Marker，1-6：6只猫感染前的粪便样本；

图4是PCR检测感染后实验动物粪便，其中M：2000bp DNA Marker，1-17：粪便样品；

图5是感染FPV后猫的临床症状及特征，其中FPV为阳性组，FP-9mAb为治疗组，Mock为阴性组；

图6是感染FPV后猫的临床指标变化，其中A-F分别为A：体温，B：体重，C：临床评分，D：白细胞数，E：存活率，F：抗体稀释倍数；

图7是感染FPV后猫的病理剖检图；

图8是感染FPV后猫的组织病理学变化(HE染色)；

图9是感染FPV后猫的组织病理学变化(免疫组化)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中，FPV易感细胞CRFK购自中国典型培养物保藏中心。

实施例1

1.猫细小病毒的纯化

(1)在6孔培养板中将FPV易感细胞CRFK培养至单层，将猫细小病毒接种至CRFK中，在37℃培养箱中吸附1-2h后弃掉培养液，用PBS洗三遍CRFK细胞。加入含2％胎牛血清的DMEM维持液继续于37℃静置培养，因细胞病变难以观察，通过不同时间点进行间接免疫荧光来确定病毒增殖情况，结果如图1所示，发现在60h时病毒量最多，之后细胞开始脱落。因此，60h时将第一代的培养物取出在-80℃与常温之间反复冻融3次，8000rpm，4℃离心15min，取上清，分装至无菌EP管中，即为原始毒，记为P0代毒。

(2)对分离病毒进行噬斑纯化：将CRFK消化均匀后调节细胞密度，以1×10

2.免疫动物

用上述纯化的FPV病毒免疫6周龄BALB/c雌性小鼠：100μL病毒粒子与等体积弗氏完全佐剂乳化后于小鼠颈背部多点注射，2周后进行第二次免疫，佐剂使用弗氏不完全佐剂，方式与剂量同上，二免1周后进行眼睑采血，分离血清检测血清抗体效价，若效价>10

3.细胞融合及选择性培养

采用PEG细胞融合方法：免疫小鼠采血后安乐死，75％酒精浸泡15min。剪刀剪开腹部皮肤，另取无菌剪刀镊子钝性剥离腹部皮肤，换一套器械(过火焰)，剪开腹膜，再换器械(过火焰)，将脾脏轻轻夹住，用剪刀分离周围粘连组织。剪破脾脏外膜，放入细胞滤网(40μm)，碾碎后滤入50mL离心管，用1640清洗滤网，滤液同样滤入离心管，标记收集脾细胞的离心管。一个T75细胞培养瓶的SP2/0细胞，先用1640洗，然后加10mL 1640拍下细胞，再用移液管轻轻将壁上其他细胞吹下，加到50mL空的离心管中，再加10mL 1640冲洗，收集至50mL离心管内。标记收集SP2/0的离心管。将装有脾细胞和SP2/0的两只离心管室温1200r/min离心10min，分别弃上清；然后分别加2mL 1640用2mL移液管重悬(动作一定要轻)，再分别加入40mL 1640，离心，弃上清；每管各加1-2mL 1640轻轻重悬并将两种细胞混合至一个离心管内，再补加1640至40mL左右，离心，弃上清。管子向下倾斜吸走管壁多余液体(不然会影响PEG浓度)。将管子底部在手上摩擦，待到细胞呈粥状(倾斜时细胞液顺着流下即可)。离心管置于37℃水浴，用2mL移液管吸取PEG(0.8mL)计时1min，边晃离心管边加，在1min中加完。继续搅拌一分钟。终止反应：取装有40mL 1640的离心管第1min加1mL 1640，第2min加1mL1640，边加边搅拌，第3-4min每40s加1mL共三组，第5分钟，12s加5mL，最后将剩余30mL 1640用移液管匀速加入；37℃温箱放置10min，离心1000r/m 10min，弃上清，37℃放置5-8min，用40mL 1×HAT完全培养基轻轻重悬，倒入平皿内，用排枪每孔100μL，轻轻缓慢加入前一天晚上铺好的饲养细胞的96孔板内。

4.杂交瘤细胞阳性孔的筛选及细胞克隆

第一次筛选，CRFK细胞培养于96孔细胞培养板，生长至50％时接毒，60h后进行间接免疫荧光融合细胞上清，挑选出高阳性荧光的细胞孔进行有限稀释，具体如下：细胞进行2倍比稀释，挑选出稀释后细胞数为30-40个的孔，将其转移至2.4mL完全培养基中，分装至96孔板的24个孔中，100μL/孔继续进行培养。然后进行第二次和第三次筛选，步骤同上，每次挑选高阳性荧光并且是单细胞集落的孔进行亚克隆。筛选出单克隆细胞。

本发明筛选出的杂交瘤细胞FP-9-2022株，于2022年5月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022111。

5.单克隆抗体腹水制备及纯化

FP-9-2022细胞在完全1640培养基中扩大培养，然后将生长状态良好的细胞用1640培养基清洗2次，并用1640培养基重悬，对7周龄雌鼠进行腹腔注射，每只小鼠注射2.0×10

得到腹水后，用ProteinA+Protein G亲和层析法纯化抗体。具体操作如下：用磷酸盐缓冲液对腹水进行10倍稀释，用0.45μm滤膜过滤，在4℃条件下用50mL磷酸盐缓冲液平衡纯化柱，然后上样，样品上完后用30mL的磷酸盐缓冲液冲洗柱中未结合的蛋白。在蛋白纯化系统进行抗体的洗脱，并将洗脱液收集到事先准备好的EP管中。SDS-PAGE凝胶鉴定，选择目的抗体较纯的液体用10kDa超滤管在4℃4500r/min离心进行浓缩，分装于-20℃保存备用，标记为FP-9mAb。

经过测序，FP-9mAb的轻链序列(SEQ ID NO：1)为：

AspIleGlnMetThrGlnSerProAlaLeuLeuSerAlaSerValGlyGluThrValThrIleThrCysArgAlaSerGluAsnIleTyrSerTyrLeuGluTrpLeuGlnGlnArgGlnGlyLysSerProGlnLeuLeuValTyrAsnAlaLysThrLeuAlaAlaGlyValProSerArgIleSerGlySerLeuSerGlyThrGlnPheSerLeuLysLeuAsnSerLeuGlnProGluAspPheGlySerTyrTyrGlnHisHisTyrSerProTyrPheGlyGlyGlyThrLeuLeuMetLys。

FP-9mAb的重链序列(SEQ ID NO：2)为：

GlnValGlnLeuGlnLeuProGlyThrGluLeuValLysProGlyAlaSerValArgMetSerCysLysAlaSerGlyTyrAlaPheThrSerTyrTrpIleHisTrpValLysGlnArgLeuGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyGluIleAsnProSerThrGlyArgSerAsnSerAsnGluLysPheLysThrLysAlaThrLeuThrValAspLysTyrLeuSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerLeuTyrTyrCysAlaArgLysLeuTyrLeuPheProLeuTrpGlyGlyThrLeuThrValLeuAlaAlaLys。

6.单克隆抗体中和效果

为了确定攻毒治疗试验所需的FP-9mAb用量，通过中和试验比较FP-9mAb(初始浓度为2.4mg/mL)、腹水(Ascites)的中和效价，结果如图2所示：FP-9mAb的中和效价为212.33，FP-9mAb的50％中和效价(NC

7.单克隆抗体动物保护试验

PCR检测实验动物是否为FPV阴性，并且在试验中通过PCR检测猫排泄物来观测FPV感染是否成立及抗体治疗效果，PCR检测所用引物为，上游引物FPV-F：GTAACACCTTGGTCATTGGTTG，下游引物FPV-R：CATCATCTGGATCTGTACCATG；反应体系为，2×Taqmix 5μL、FPV-F 1μL、FPV-R 1μL、模板1μL、无菌水2μL；反应条件为，98℃3min，30-35个循环(循环反应为98℃15s、55℃15s、72℃30s)，72℃延伸5min，16℃2min降温。3-5个月的猫6只，饲养观察3天，采集血液和采集粪便，检测FPV抗体呈阴性，PCR结果呈阴性，方可使用(结果见图3)。在感染后每日监测6只猫体温、体重，收集粪便作PCR检测(结果见图4)，可见试验模型成立，通过mAb治疗后，FPV不随粪便排出。其中，治疗组的猫在攻毒前一天、攻毒当天，攻毒后一天(共计3天)分别静脉注射1.2mg的单克隆抗体，无其它治疗措施。阳性组发病死亡及实验结束后，对3组猫进行病理剖检，采集肠道、胃、脾脏等组织，并做组织病理学检查。

动物分组情况见表1。

表1

临床症状观察和评分体系，评分标准参照欧洲药典的有关规定对FPV临床症状进行计分，主要包括精神状态、体重、体温、呕吐情况、腹泻等指标，分值越高，症状越严重，死亡记为10。临床观察结果如图5所示，治疗组和阴性组未表现任何FPV感染的临床症状。而阳性组则表现出明显的临床症状，在攻毒后第7天出现腹泻症状，第10天出现呕吐症状，第11天便血，随着病程的发展，实验动物食欲废绝、日渐消瘦、被毛杂乱、严重脱水，直至第15天死亡。治疗组和阴性组的体温、体重、临床打分均处于正常变化范围之内，而白细胞计数也处于正常范围内(5-18.9×10

表2

8.组织病理学观察：把新鲜的各部分组织经多聚甲醛固定后，用常规石蜡进行包埋，然后切成4μm薄片，进行HE染色，最后在光学显微镜下观察并记录组织学病理变化，如图8所示，治疗组和阴性组无明显眼观异常，而阳性组肠绒毛断裂、肠腺上皮细胞凋亡、胃腺结构紊乱、有大量的红细胞浸润、胃黏膜破溃、隐窝减少，脾和淋巴结淋巴细胞显著减少。免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡至水，用清水冲洗切片5min，3％过氧化氢室温处理30min，再用0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗涤两次，每次5min，将切片放入抗原修复缓冲液中进行热修复，然后取出放置室温自然冷却后用0.01mol/LPBS洗涤3次，每次5min，小心吸去残液，然后将切片置于湿盒中，滴加稀释好的正常山羊血清37℃封闭1h，小心吸去残液，甩干后滴加1：100稀释的FPV单克隆抗体，4℃孵育过夜，用0.01mol/LPBS洗涤切片2次，每次5min，滴加HRP标记的羊抗鼠IgG室温作用30min，用0.01mol/LPBS洗涤切片2次，每次5min，然后用DAB/AEC避光显色1min，再用清水冲洗5min，依次进行苏木素衬染2min、流水冲洗5min、盐酸分化15s、流水再次冲洗10min、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光学显微镜观察阳性信号，结果如图9所示，治疗组和阴性组均未观察到阳性信号，说明均未被FPV侵染，FP-9mAb能使猫免受FPV感染，具有很好的保护作用。因FPV常侵染分裂生长旺盛的细胞，在阳性组，我们可以观察到阳性信号位于肠隐窝的上皮细胞，在胃中，阳性信号位于胃腺上皮细胞，在脾脏和淋巴结中，阳性信号位于淋巴母细胞，颜色为深棕色。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种猫细小病毒中和性单克隆抗体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Glu Trp Leu Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly

50 55 60

Ser Leu Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Gln His His Tyr Ser Pro Tyr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Leu Leu Met Lys

100

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Leu Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Leu Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Arg Ser Asn Ser Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Tyr Leu Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Lys Leu Tyr Leu Phe Pro Leu Trp Gly Gly Thr Leu Thr Val Leu

100 105 110

Ala Ala Lys

115