一种雷公藤红素凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药学领域，具体地说，是关于一种雷公藤红素凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

银屑病(Psoriasis)是皮肤科常见的慢性系统性炎症性疾病，由遗传、免疫、环境等因素共同诱发。主要特征为角质形成细胞(Keratinocytes,KC)过度增殖与分化，皮肤出现红色丘疹或斑块，上覆多层银白色鳞屑。临床分为寻常型、脓疱型、红皮病型以及关节型等四种类型。全球流行病学调查显示，成人银屑病患病率0.51％～11.43％，儿童0％～1.37％；在我国，银屑病患病率从1984年的0.123％上升至2012年的0.47％。目前的治疗方案包括糖皮质激素、维A酸类药物、免疫抑制剂以及生物制剂等药物，因其高额的经济成本和严重的安全性问题，临床应用受限。银屑病也因此成为皮肤科领域的疑难疾病，新的治疗药物亟待开发。

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)是祖国医学的一味传统中草药，属于卫矛科雷公藤属植物。药理学研究发现，雷公藤具有免疫抑制、抗肿瘤、抗炎、镇痛、杀虫等作用。临床可用于风湿病、皮肤病、肾病及肿瘤等常见病和疑难杂病的治疗。雷公藤发挥作用的主要活性成分-雷公藤红素(Celastrol，Cel)，在2007年，与青蒿素一同被列为最具发展潜力的天然药物之一。然而，雷公藤发挥疗效的主要活性物质亦是其毒副作用发生的原因。我们的前期研究发现，雷公藤口服用药引起不良反应的总体发生率为30.75％，其中重度为4.68％。因此，雷公藤制剂减毒、剂型改良及优化是研究的一大热点。

树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是功能最强的一群抗原提呈细胞，启动调节自身免疫反应。DC根据细胞表面标志与发育起源可分为经典树突状细胞(conventionaldendritic cell，cDC)、浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)、朗格汉斯细胞(langerhans cells，LCs)以及炎性树突状细胞(inflammatory dendritic cell，iDC)。在皮肤免疫中，LCs作为表皮层唯一的抗原提呈细胞。文献(Yoshiki R,Kabashima K,Honda T,Nakamizo S,Sawada Y,Sugita K,Yoshioka H,Ohmori S,Malissen B,Tokura Y,Nakamura M.IL-23from Langerhans cells is required for the developmentofimiquimod-induced psoriasis-like dermatitis by induction ofIL-17A-producinggammadelta T cells)和文献(Xiao C,Zhu Z,Sun S,Gao J,Fu M,LiuY,Wang G,Yao X,LiW.Activation ofLangerhans cells promotes the inflammation in imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis.J Dermatol Sci 2017,85(3):170-177.)中发现当炎症发生时，LCs将集中于表皮的抗原呈递至T淋巴细胞，促进细胞增殖分化。在IMQ诱导的小鼠银屑病模型中，LCs的缺失导致小鼠皮肤产生IL-17的γδT细胞减少，这一过程通过LCs分泌IL-23实现。本发明发现雷公藤红素凝胶通过靶向LCs，减少其分泌的IL-23、IL-1β等炎症因子，从而降低IL-17、IFNγ依赖的γδT细胞数量，改善IMQ诱导的银屑病样炎症反应。且无不良反应的发生。另外，雷公藤红素凝胶还能减轻银屑病样小鼠的复发。

中国专利CN111297798A，公开日：2020.06.19，公开了一种雷公藤红素微乳凝胶剂及其制备方法，雷公藤红素微乳胶剂按照质量百分比由以下组分组成：雷公藤红素0.5～3％、表面活性剂18～28％、助表面活性剂18～28％、油相物质6～12％、水22～46.5％、凝胶基质0.5～3％、白及多糖0.25～2％，远红外陶瓷粉0.25～2％，通过微乳剂的方式明显提高了雷公藤红素的溶解度，远红外陶瓷粉使得雷公藤红素微乳凝胶剂具有更好的透皮给药特性，可以开发为治疗糖尿病皮肤溃烂外用给药制剂。

本发明以凝胶为载体，将雷公藤红素制备为凝胶制剂进行局部用药，而目前尚未见与本发明类似的简便的制备方法，也未见如本发明的凝胶用于治疗银屑病。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种雷公藤红素凝胶的制备方法。

本发明的第二个目的是，提供一种雷公藤红素凝胶。

本发明的第三个目的是，提供雷公藤红素凝胶的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种雷公藤红素凝胶的制备方法，包括以下步骤：

a)将雷公藤红素粉末过100目筛后收集颗粒，取适当数量加入二甲基亚砜中，充分搅拌溶解后制成雷公藤红素溶液，备用；

b)适量卡波姆974边搅拌边加入纯水中，配成卡波姆混悬液，放置过夜，使其充分溶胀；

c)将a)中获得的雷公藤红素溶液加入b)获得卡波姆混悬液中，搅拌均匀；

d)加入适量三乙醇胺，调节pH，搅拌均匀即得雷公藤红素凝胶。

更优选地，所述步骤a)中的雷公藤红素溶液浓度为0.06％。

更优选地，其特征在于，所述步骤b)中卡波姆混悬液的浓度为0.8％。

更优选地，所述步骤c)pH调至7.0。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种雷公藤红素凝胶，由上述任一所述方法制备而成。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

雷公藤红素凝胶在制备治疗银屑病药物中的应用。

更优选地，所述的雷公藤红素凝胶为外用制剂。

更优选地，所述雷公藤红素凝胶治疗银屑病的靶细胞为朗格汉斯细胞。

更优选地，所述雷公藤红素凝胶是通过朗格汉斯细胞和γδT细胞的交互来发挥疗效。

本发明优点在于：

1.现有专利雷公藤红素外用制剂制备较复杂，本项目以凝胶为载体，简便易得，安全性较高。

2.雷公藤红素凝胶治疗能降低银屑病不良反应的发生，局部应用于咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠后，小鼠皮损明显减轻，复发程度降低。表明该药物有望成为银屑病治疗的新药在临床应用。

3.本项发明从细胞生物学角度探索雷公藤红素凝胶治疗银屑病的作用机制。应用转基因小鼠、流式细胞术验证雷公藤红素凝胶治疗银屑病的机制在于降低朗格汉斯细胞分泌的IL-23、IL-1β等炎症因子，进一步减少γδT细胞分泌的IL-17，从而减轻银屑病的发生，降低复发率，不良反应减少。

附图说明

附图1为雷公藤红素凝胶改善IMQ诱导的小鼠银屑病皮肤炎症。(A)IMQ造模雷公藤红素凝胶治疗示意图；(B)整个实验期间小鼠的耳朵厚度；(C)流式细胞仪检测小鼠耳内病变单核细胞和巨噬细胞数量的变化；(D)进行流式细胞术以检测小鼠耳部皮肤病变中CD4

附图2为雷公藤红素凝胶降低银屑病小鼠皮损和DLN中的IL-17水平。(A)PCR检测雷公藤红素凝胶给药后小鼠耳部病变区域炎症因子的变化；(B)和(C)雷公藤红素凝胶处理后小鼠耳部皮肤表皮和真皮中IL-17+γδT细胞的流式细胞术检测；(D)和(e)Cel处理后小鼠耳DLN中γδT细胞和IL-17+γδT细胞的流式细胞术检测。数据显示为平均值±平均值的标准误差(SEM)(n＝4只小鼠/组)。*p<0.05，**p<0.01，ns，无意义。Cel,celastrol；DLN，引流淋巴结；Il-17，白细胞介素17。

附图3为雷公藤红素凝胶通过靶向朗格汉斯细胞分泌的IL-23和IL-1β来缓解银屑病样炎症。(A)qPCR和(B)ELISA检测IL-17、IL-23和IL-1β的表达(n＝6只小鼠/组)；(C)流式细胞仪分选不同类型DC后，ELISA检测IL-23和IL-1β的表达水平；(D)Cel处理后，通过流式细胞术在小鼠皮肤中分选LC并与γδT细胞共培养5天，然后在体外用IL-23和IL-1β刺激5小时。检测炎性细胞因子的相对mRNA表达。数据显示为平均值(SEM)的平均值±标准误差(每组n＝20只小鼠)。*p<0.05，**p<0.01，ns，无意义。

附图4为雷公藤红素凝胶通过靶向朗格汉斯细胞改善银屑病样炎症。(A)腹腔注射白喉毒素后Langerin-DTR小鼠中LC的流式细胞术检测；(B)从第0天开始每隔一天测量一次耳部皮肤厚度(雷公藤红素凝胶vs.凝胶基质，

***p<0.001)；(C)流式细胞仪用于检测小鼠耳部病变中免疫细胞和中性粒细胞的变化；(D)小鼠耳部病变表皮和真皮中IL-17

p<0.01，ns，无意义。

附图5为雷公藤红素凝胶通过靶向LC中的IL-23表达来缓解银屑病样炎症。(A)ELISA以检测共培养系统中的IL-17表达；(B每日测量耳朵肿胀；(C)耳部病变的H&E染色；(D)和(E)流式细胞仪用于检测小鼠耳部病变表皮和真皮中的IL-17

附图6为雷公藤红素凝胶抑制银屑病样炎症复发，(A)在实验期间每天测量耳朵肿胀；(B)耳部病变的H&E染色。(C)和(D)流式细胞仪检测皮肤病变中的中性粒细胞和树突状细胞。(E)和(F)流式细胞仪检测小鼠耳部病变表皮和真皮中的IL-17+γδT细胞。数据显示为平均值±平均值的标准误差(SEM；n＝4)。

附图7为雷公藤红素凝胶治疗IMQ所致银屑病皮炎的作用机制。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1雷公藤红素凝胶的制备和应用

1方法和材料

1.1动物模型

本实验将选用C57BL/6小鼠及条件性敲除LCs的Langerin-DTR小鼠作为实验动物。Langerin-DTR小鼠是将人白喉毒素受体(diphtheria toxin receptor，DTR)敲入小鼠Langerin启动子区来耗竭LCs，达到条件性敲除的目的。两种小鼠统一采用咪喹莫特造模以诱导银屑病样模型。咪喹莫特(IMQ)诱导小鼠银屑病模型：C57BL/6及Langerin-DTR小鼠适应性饲养至少一周后，刮除所有小鼠背部的毛；接下来连续5天，所有需要造模的小鼠背部和双耳每天外涂一次咪喹莫特乳膏(0.25g，四川明欣药业有限责任公司)，每次剂量约62.5mg；空白对照小鼠外涂空白乳膏。第5天造模成功后，进行随机分组。整个造模周期拍照记录皮损变化。小鼠耳部皮损运用游标卡尺精确量取耳朵数据，以耳朵数据变化差值代表皮肤炎症程度。复发的研究分组为IMQ+凝胶基质，IMQ+雷公藤红素凝胶，IMQ+卤米松。该项实验方案通过了上海中医药大学附属岳阳医院伦理委员会的审批(No.18878)。

1.2凝胶制备

将雷公藤红素粉末过100目筛后收集颗粒，取适当数量加入二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)中，充分搅拌溶解后制成不同浓度雷公藤红素溶液，备用；将适量卡波姆974边搅拌边加入纯水中，配成0.8％卡波姆混悬液，放置过夜，使其充分溶胀；再将不同浓度雷公藤红素溶液加入卡波姆混悬液中，搅拌均匀；最后加入适量三乙醇胺，将pH调至7.0，搅拌均匀即得雷公藤红素凝胶。

1.3单细胞悬液制备

耳部皮肤：将小鼠的耳部皮肤样品分成表皮真皮两半。去除耳朵皮肤内侧的软骨组织。将做真皮朝下漂浮在0.5％胰蛋白酶溶液中(用2.5％胰蛋白酶-EDTA[1X][25200-056；Gibco,NewYork,USA]稀释)并置于37℃培养箱中40分钟。接下来，分离真皮和表皮，用剪刀将皮肤组织切成小块，放入含有1.5mg/mL(真皮)或1mg/mL(表皮)4型胶原酶(49A19027；Worthington,Lakewood,NJ，美国)的培养基中，然后在37℃培养箱中孵育90分钟(真皮)或80分钟(表皮)以进行消化和短暂混合。消化后，通过尼龙过滤器过滤获得单细胞悬液。引流淋巴结(DLN)：收集存在于小鼠耳后的DLN，并将其置于含有2％胎牛血清(FBS)(2036224C；Gibco)。接下来，使用针尖将这些淋巴结磨成小块，然后转移到带有尼龙过滤器的15mL离心管中进行离心。然后，去除上清液并加入1.5mL Eppendorf管中进行染色。最后使用流式细胞术进行分析。

2统计学方法

数据处理采用SPSS 23.0统计软件，实验结果以平均数±标准误(X±SEM)表示，计数资料用率表示。若计量资料符合正态分布且方差齐，则运用t检验/单因素方差分析进行比较；若方差不齐，则校正方差后进行方差分析；重复测量数据采用重复测量的方差分析；不服从正态分布者，采用非参数检验。以p<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1雷公藤红素凝胶改善咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病样炎症

雷公藤红素凝胶能够改善IMQ诱导的小鼠银屑病皮肤炎症，具体改善情况见图1，(A)为IMQ造模雷公藤红素凝胶治疗示意图，在IMQ建模的第5天开始将雷公藤红素或凝胶基质局部应用到耳部皮肤，并持续到第13天，于第13天取材。(B)为整个实验期间小鼠的耳朵厚度。与基质组对比，Cel明显降低耳朵厚度(p<0.001)。(C)为流式细胞仪检测小鼠耳内病变单核细胞和巨噬细胞数量的变化。与基质组对比，Cel明显降低皮损区单核细胞数量(p<0.01)。(D)进行流式细胞术以检测小鼠耳部皮肤病变中CD4

3.2雷公藤红素凝胶减少咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠皮损及引流淋巴结IL-17的分泌

雷公藤红素凝胶能够降低银屑病小鼠皮损和DLN中的IL-17水平，具体见图2，其中(A)为PCR检测雷公藤红素凝胶给药后小鼠耳部病变区域炎症因子的变化。(B)和(C)雷公藤红素凝胶处理后小鼠耳部皮肤表皮和真皮中IL-17+γδT细胞的流式细胞术检测，(D)和(E)Cel处理后小鼠耳DLN中γδT细胞和IL-17+γδT细胞的流式细胞术检测。结果显示，Cel凝胶明显降低皮损区IL-17a(p<0.05)、IL-1β(p<0.01)、IL-23a(p<0.05)的表达；同时，Cel治疗后，小鼠皮损区的表皮、真皮、DLN中IL-17+γδT细胞数量减少(p<0.01)。

3.3雷公藤红素凝胶靶向LC分泌的IL-23和IL-1β改善银屑病样炎症

雷公藤红素凝胶通过靶向朗格汉斯细胞分泌的IL-23和IL-1β来缓解银屑病样炎症。小鼠用IMQ模塑5天，然后用凝胶基质或雷公藤红素凝胶处理8天。在雷公藤红素凝胶和凝胶基质处理后的第13天，通过流式细胞术对来自C57BL/6小鼠的所有皮肤细胞和没有DCs的皮肤细胞进行分类，具体情况见图3，其中(A)为qPCR和(B)ELISA检测IL-17、IL-23和IL-1β的表达(n＝6只小鼠/组)，(C)为流式细胞仪分选不同类型DC后，ELISA检测IL-23和IL-1β的表达水平，(D)为Cel处理后，通过流式细胞术在小鼠皮肤中分选LC并与γδT细胞共培养5天，然后在体外用IL-23和IL-1β刺激5小时。检测炎性细胞因子的相对mRNA表达。结果显示，去除了DC的皮损区，在Cel治疗后，IL-17、IL-23和IL-1β的表达没有明显差异；朗格汉斯细胞分泌的IL-23和IL-1β的表达在Cel治疗后明显降低(p<0.001)。

3.4雷公藤红素凝胶靶向LC改善银屑病样炎症

雷公藤红素凝胶通过靶向朗格汉斯细胞改善银屑病样炎症的情况见图4，其中(A)为腹腔注射白喉毒素后Langerin-DTR小鼠中LC的流式细胞术检测。在IMQ建模的第5天开始将雷公藤红素凝或凝胶基质局部应用到C57BL/6或Langerin-DTR小鼠的耳部皮肤，并持续到第12天(n＝4只小鼠/组)。第13天，处死小鼠，(B)为从第0天开始每隔一天测量一次耳部皮肤厚度(雷公藤红素凝胶vs.凝胶基质,***p<0.001)，(C)为流式细胞仪用于检测小鼠耳部病变中免疫细胞和中性粒细胞的变化，(D)为小鼠耳部病变表皮和真皮中IL-17

3.5雷公藤红素凝胶通过靶向LC中的IL-23表达来缓解银屑病样

雷公藤红素凝胶通过靶向LC中的IL-23表达来缓解银屑病样炎症的具体情况见图5，其中(A)为通过流式细胞术从20个C57BL/6小鼠皮肤样本中分选出LC，并与γδT细胞共培养5天。进行ELISA以检测共培养系统中的IL-17表达。模拟组由体外IL-23和IL-1β刺激5h的共培养细胞组成；IL-1β和IL-23组分别包含用IL-1β和IL-23刺激的细胞。在建模开始时，给小鼠皮下注射rIL-23或PBS，(B)为每日测量耳朵肿胀，(C)为耳部病变的H&E染色；(D)和(E)流式细胞仪用于检测小鼠耳部病变表皮和真皮中的IL-17

3.6雷公藤红素凝胶抑制银屑病样炎症复发

雷公藤红素凝胶与类固醇治疗一样有效，可以抑制银屑病的复发。C57BL/6小鼠的耳部皮肤分别用凝胶基质、雷公藤红素凝胶和卤米松处理，在从模型建立到第21天应用IMQ5天后。所有小鼠从第22天到第35天未接受任何治疗，IMQ从第35天到第43天继续施用。第43天处死小鼠，具体见图6，其中(A)为在实验期间每天测量耳朵肿胀的情况；(B)为耳部病变的H&E染色。(C)和(D)流式细胞仪检测皮肤病变中的中性粒细胞和树突状细胞；(E)和(F)为流式细胞仪检测小鼠耳部病变表皮和真皮中的IL-17

3.7雷公藤红素凝胶治疗IMQ所致银屑病皮炎的作用机制

雷公藤红素凝胶治疗IMQ所致银屑病皮炎的作用机制见图7。首先，雷公藤红素凝胶减少LC分泌IL-23，导致皮肤和DLN中活化的γδT细胞和γδT细胞分泌IL-17的数量减少。随后，牛皮癣炎症得到缓解。其次，LCs的活性和迁移能力在此期间有所增加。大多数表皮常驻LC迁移到DLN。此外，表皮中的单核细胞数量减少，炎症因子(包括CXCL1、LCN2和S1008a)的表达减少。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。