一种新型可抑制脲酶的微生物菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产脲酶抑制剂的微生物菌株及其在田间的应用。

背景技术

在我国农业化学氮使用中，碳铵和尿素是主要氮肥施用类型，全国尿素施用以玉米的需求量最大，其次为水稻和小麦。尿素是生理中性肥料，尿素肥料有许多优点：氮含量高(45％-46％)；造价低；易溶于水和易于处置(不易引起火灾或爆炸)。它还适于用来生产复合肥料；能以固态或液态的形式施入土壤，并能对某些作物用作叶面追肥。施用尿素肥料也存在不少问题，主要是它在土壤脲酶的作用下会迅速水解成碳酸铵，并由此而引起土壤pH的增高和氨的累积。这样就会伤害发芽幼苗和幼龄植株，产生亚硝酸盐和氨的毒害；并导致尿素氮以氨的形式呈气态损失。此外，因土壤脲酶的作用而引起尿素的迅速水解使土壤中氨的浓度和pH增高，延缓了微生物将亚硝酸盐氧化至硝酸盐的进程，导致氧化亚氮(N

脲酶抑制剂可以抑制脲酶活性而减缓尿素的水解速度以及氨的释放速率，进而减少氨挥发与硝化反应导致的氮素损失。脲酶抑制剂的作用效果在很大程度上受环境条件影响，如土壤酸碱度、水分状况、土壤温度、土壤通气性、土壤肥力以及土壤类型等。脲酶抑制剂的种类不同，所适合使用的环境条件也不相同，NBPT(正丁基硫代磷酸三胺)受土壤酸碱度的影响最小，不管是在偏酸性土壤还是在偏碱性土壤中使用NBPT都适合。PPD(苯基磷酰二胺)虽是一种抑制作用效果较好的脲酶抑制剂，但易于分解形成酚，而酚是一种效果差的脲酶抑制剂，大大降低了抑制效率。土壤脲酶活性随着氢醌(HQ)用量的增加而减弱，且氢醌受土壤环境因素如pH和通气性的影响较小，但HQ在通气性良好的条件下使用时，效果不及NBPT和PPD，在厌氧条件下使用时效果不及PPD。植物提取物类脲酶抑制剂相对安全，但植物生长周期长，原料来源不稳定，提取工艺较为复杂，规模化生产成本高、效率较低，且对脲酶的抑制作用较低。不同的脲酶抑制剂会受到不同环境因素的影响，局限其抑制作用效果，所以需要根据不同土壤条件筛选最适宜的脲酶抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可产生脲酶抑制剂的微生物菌株及其在田间的应用，以减少N

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明从土壤中分离、鉴定出一种可产生脲酶抑制剂的微生物菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年04月21日，分类命名为Priestiafilamentosa GW10，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022439。

本发明所提供的菌株Priestia filamentosa GW10从土壤中分离、筛选得到，具有产生脲酶抑制剂的活性，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

该菌株的筛选方法具体包括以下步骤：

1.取蔬菜种植地的土壤1g，置于100mL无菌生理盐水中，制成菌悬液，梯度稀释后涂布于平板初筛培养基中培养，在37℃下培养24h；平板初筛培养基的成分为：20g尿素、10g蔗糖、10g蛋白胨、3g牛肉膏、0.2g酚红、5g氯化钠和20g琼脂，去离子水1000mL，pH 6.2。

2.从步骤1培养所得菌落中挑取周围未变色菌落，转接于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，进行划线培养24h。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6。

3.从步骤1培养所得菌落中挑取周围变成粉红色的菌落，转接于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，进行划线培养24h。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6。

4.从步骤2培养的菌落中，挑取单菌落，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6)中，37℃、200rpm培养24h，获得各菌落的发酵液。

5.从步骤3培养的菌落中，挑取单菌落，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6)中，37℃、200rpm培养24h，获得脲酶菌株发酵液。

6.从步骤4获得的发酵液中，各取1mL，置于1.5mL的eppendorf管中，12000rpm离心3min后，取上清液，制成待选样品液。

7.从步骤5获得的发酵液中，取1mL，置于1.5mL的eppendorf管中，12000rpm离心3min后，取上清液，制成脲酶粗提液。

8.将从步骤6获得的待选样品液，与步骤7获得的脲酶粗提液混合，检测脲酶活性，筛选出产脲酶抑制剂的菌株Priestia filamentosa GW10。

本发明提供的菌株Priestia filamentosa GW10具有产生脲酶抑制剂的活性，其可应用于抑制土壤脲酶活性中。

本发明提供的菌株Priestia filamentosa GW10制成菌剂施用于土壤中，可以明显减少N

本发明提供的菌株Priestia filamentosa GW10可结合氮肥在土壤中施用，以缓解土壤中脲酶对氮肥的不利影响、提高氮肥利用率。

本发明的优点和有益效果：本发明产脲酶抑制剂菌株Priestia filamentosaGW10的发酵液喷施于施用尿素的田中，可有效的减少N

菌株保藏信息

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年04月21日；分类命名：Priestia filamentosa GW10；保藏编号：CCTCC NO：M2022439。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。具体实施例仅用于解释本发明，不用于限定本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种产脲酶抑制剂的菌株Priestia filamentosa GW10，该菌株通过以下步骤筛选得到：

1.不产脲酶菌株的筛选

1.1不产脲酶菌株的初筛

称取山东省寿光市蔬菜种植地的土壤1g，加入到盛有100mL无菌生理盐水和15粒玻璃珠的250mL三角瓶中，100rpm摇床上摇动5min，制成菌悬液，再将此菌悬液利用无菌生理盐水进行梯度稀释，稀释的倍数为10

1.2不产脲酶菌株的培养

从步骤1.1培养所得菌落中挑取周围未变色菌落，转接于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，进行划线培养，37℃倒置培养24h后，置于4℃冰箱中保藏备用。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6。

1.3从步骤1.2培养的菌落中，挑取单菌落，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6)中，37℃、200rpm培养24h，获得发酵液。

1.4从步骤1.3获得的发酵液中，各取1mL，置于1.5mL的eppendorf管中，12000rpm离心3min后，取上清液，制成待测样品。

2.产脲酶菌株的筛选

2.1产脲酶菌株的初筛

从步骤1.1培养所得菌落中挑取周围变成粉红色的菌落，转接于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，进行划线培养。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6。

2.2产脲酶菌株的培养

从步骤2.1培养的菌落中，挑取单菌落，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6)中，37℃、200rpm培养24h，获得各菌落的发酵液。

2.3产脲酶菌株的复筛

从步骤2.2获得的发酵液中，各取1mL，置于1.5mL的eppendorf管中，12000rpm离心3min后，取上清液，制成脲酶粗提液。采用Solarbio的BC4110试剂盒，检测脲酶粗提液的脲酶活性。经检测，此脲酶粗提液的活性为0.34U/g。

3.产脲酶抑制剂的菌株筛选

取0.5mL产脲酶菌株发酵液加入到1.5mL的eppendorf管中，加入上述步骤1.4获得的不产脲酶菌株的待测样品各0.5mL，混匀，作为试验组，采用Solarbio的BC4110试剂盒，检测试验组的脲酶活性。以不加不产脲酶菌株的待测液为对照，测定其脲酶活力，计算得到脲酶活力的降低值，从而筛选出具有产脲酶抑制剂的菌株Priestia filamentosa GW10。

产脲酶抑制剂的菌株Priestia filamentosa GW10，其16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国.武汉.武汉大学)，保藏日期为2022年04月21日，分类命名为Priestia filamentosa GW10，保藏编号为CCTCC NO：M2022439。

实施例2

本实施例提供了Priestia filamentosa GW10的发酵液，在37℃时对脲酶活力的抑制效果。

1.微生物脲酶抑制剂的发酵

挑取Priestia filamentosa GW10单菌落，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、去离子水1000mL，pH 7.4-7.6)中，37℃、200rpm培养24h，获得发酵液。

2.本实验的脲酶采用实施例1中步骤2所得的脲酶粗酶液，以1％NBPT(正丁基硫代磷酸胺)为对照，本实验持续7天，每天取样测定脲酶活性，并计算得到脲酶活力降低的百分值，结果如表1所示。结果显示GW10的发酵液对脲酶的抑制率可达9.06％。随着时间的推移，GW10的发酵液对脲酶的抑制率逐渐降低。

表1脲酶抑制百分率

实施例3

本实施例提供了Priestia filamentosa GW10作为菌剂在田间施用，减少N

将Priestia filamentosa GW10接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，200rpm、37℃摇床培养24h作为种子液。

将种子液以体积浓度1％-10％的接种量接种至装有3L发酵培养基的发酵罐(5L)中进行发酵培养。培养温度为37℃，搅拌桨转速为100-200rpm，通气量为0.5-1.0vvm，培养时间为24h-48h。发酵培养基组成是(g/L)：尿素20，蔗糖10，氯化钾5，硫酸镁0.6，氯化钙0.6，磷酸氢二钠1，磷酸二氢钠1，pH 6-8。

将所得发酵液用小型喷雾器均匀喷施于田块中，田块的尿素施用量为20kg/亩，以未喷施菌剂的田块为阴性对照，以喷施1％的NBPT为阳性对照，每种处理重复三次。在施用尿素后的五天中，每天采集气体，五天结束后改为每周采集气体一次，监测供试田块中N

表2各处理N

表3各处理CH

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。