一种全血中乳酸检测方法

技术领域

本发明涉及分离、分析检测技术领域，具体涉及一种用于全血中乳酸检测方法。

背景技术

乳酸，Lactic Acid，C

血乳酸临床浓度范围：0.5～5.5mmol/L(45～495mg/L)；窒息患者血液乳酸值会上升，pH会下降，BE值会下降，氧分压(PaO2)降低，1min Apgar评分变低。吸氧浓度(FiO2)的比例通过以下公式计算:FiO2＝(21+氧气流量(L/min)×4)/100，则氧合指数PaO2/FiO2≤100mmHg为严重急性呼吸窘迫综合征的标准之一。临床研究的52例病例中，血乳酸低于1.4mmol/L(126ppm)，病死率为0；低于4.4mmol/L(400ppm)，病死率为22％；低于8.7mmol/L(800ppm)，病死率为78％；超过13mmol/L(1170ppm)，病死率为100％。乳酸水平与病人的预后有密切关系，乳酸浓度变化对治疗效果是一个很好的评价。

张明等人发明的一种医疗检验用血气分析仪(专利号ZL201821788414.5)，本实用新型公开了种医疗检验用血气分析仪，包括血气分析仪本体，血气分析仪本体前侧上端安装有显示屏，血气分析仪本体前侧下端安装有检验端口和检验结果出纸端口，血气分析仪本体靠近检验端口的一侧外壁上安装有保护盖组件，血气分析仪本体底部固定有承载板，承载板下端安装有支撑柱和移动机构。

Barbara Lynn EATON等人发明的(专利号US2018/0291430A1)，一种在受试者中诊断细菌性阴道病的化验方法。在一个样本中，本发明还公开了检测样品中乳酸菌属、阴道加德纳氏菌属和/或卵黄属核酸的方法和组合物。

甘宜梧等人发明的一种稳定性强的乳酸检测试剂(专利号ZL201410697752.8)，属于临床体外检测技术领域。所述试剂包括：试剂R1和试剂R2两种组分，各组分合理搭配使整个试剂体系处于稳定状态，本发明试剂有优异的稳定性效果。

血乳酸测试仪采用酶–电流检测法可进行血乳酸浓度的快速测定，评价专业运动员训练强度、机能状况，对血液中逐渐变化的乳酸盐含量进行测试。但受仪器、耗材、资源、成本等限制，临床不具备广泛使用条件。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：全血中中乳酸纯化、传统的乳酸进样器乳酸转移效率低、检测灵敏度不高、分析时间长、存在记忆效应等问题。具体内容包括：

一种全血中乳酸检测方法，其特征在于：

1)取乳酸标准品溶于10个以上健康人的混合血液中，配制成乳酸含量在50-1000μg/ml范围内的至少5个不同乳酸含量的全血溶液；

2)用负离子模式光电离离子迁移谱分析检测仪对步骤1)获得的含乳酸的溶液进行检测分析，获得检测信号；记录负离子模式下乳酸的出峰迁移时间和乳酸峰连续0-30S内信号跟踪变化趋势曲线；软件调取乳酸峰跟踪变化趋势曲线可得到信号强度数据加和数值即乳酸不同浓度对应峰面积。

3)拟合1)和2)中不同乳酸浓度对应的跟踪信号峰面积数值，获得标准曲线方程。标准曲线方程带入未知浓度乳酸样品的峰面积，计算出乳酸浓度从而实现定量分析。

4)提取待测血液样品中的乳酸，得到含乳酸的溶液；

5)用负离子模式光电离离子迁移谱分析仪对步骤4)获得的含乳酸的溶液进行检测分析；获得检测信号；根据其获得的样品峰迁移时间与上述步骤2)的谱图乳酸信号峰迁移时间对比，软件调取目标峰峰面积按照3)中方法计算血乳酸浓度。

对步骤1)和对步骤4)提取过程为，血液样品提取溶剂是乙酸乙酯或甲基叔丁基醚中的一种或二种；提取溶液经超声(2-5min，功率500-600w)、离心(2-5min，转速10000-12000rmp)、上清液经过滤膜后(孔径0.22μm)后，获得含乳酸的溶液，每0.5-1mL血液用0.5-1mL提取剂(优选：体积比，1:1)。

具体过程，

1)乳酸标准样品分析试验；取乳酸标准品溶于10个以上健康人的混合血液中，用逐级稀释法配制100、200、400、600、800、1000μg/ml全血溶液；每0.5-1mL血液用0.5-1mL提取剂(体积比，1:1)按照权利要求2提取过程，量取2-5μL含乳酸的溶液再用负离子模式光电离离子迁移谱分析检测仪进行检测分析，获得检测信号；记录负离子模式下乳酸的出峰迁移时间和乳酸峰连续30S内信号跟踪变化趋势曲线；

2)全血样品分析试验：准确量取一定量待测血液样品，按照上述权利要求2提取过程做乳酸提取前处理，然后量取2-5μL含乳酸的溶液进样分析；在离子迁移谱负离子模式下进行检测分析，获得检测信号；根据其获得的样品峰迁移时间与上述的谱图乳酸信号峰迁移时间对比，选择定量分析目标峰跟踪信号强度数据用于定量分析。

采用的离子迁移管包括作为气体接口的4个通孔，于离子迁移管电离区(2)设有用于连接抽气泵进气口的离子迁移管出气接口(4)，用于连接化学掺杂剂(dopant)源的接口(5)，离子迁移管样品进样口管(6)；于离子迁移管迁移区(3)设有漂气入口(8)；离子迁移管内的气流循环场为除了出气接口(4)是出气口外，其余都是进气口。

化学掺杂剂(dopant)接口(5)位于通孔(4)和(6)之间，化学掺杂剂为丙酮或丁酮中的一种或二种。

离子迁移管样品进样口管(6)为金属，内部嵌套与之同轴的变径绝缘内套管(7)；微量进样器(9)内含样品，前端针头插入变径绝缘内套管内。内套管进入迁移管端释放样品，以达到最优电离效果。

所述变径绝缘内套管(7)是由二内径大小不同的空心管的一个的开口端与另一个的开口端端面密闭相连而成的中空管，中空管内二空心管连接处形成的环状面即为阶梯台面，阶梯台面与中空管的轴线相垂直；内径大的空心管位于离子迁移管外部的一端设置，内径小的空心管位于电离区一端设置；样品前端置于内径小的空心管一侧，样品前端开始依次在电离区实现电离。

全血中乳酸的样品提取液2-5μl注入变径绝缘内套管(7)后，内套管下端一端口正好位于离子迁移管的核心光电离区，样品再由连接于通孔4的抽气泵小气流(100-200ml/min)抽气缓慢热解吸气化。

方法中数据采集时间为0-30S，定量分析按照0-30S内跟踪信号累计峰强度来计算。

实验中使用的迁移管为抽气进样方式；漂气为500-600ml/min；dopant气为50-100ml/min；携带样品的载气为100-200ml/min；实验中泵抽气流速为漂气、dopant气和载气的加和，气流为650-900ml/min；实验中的迁移管是圆筒结构，若灯窗半径设定为“R”(通常为0.5-1cm)，电离区半径为(1-8)R，迁移区半径大于电离区半径且小于10R；电离区轴向距离设定为L(通常设计为2-3cm)，迁移区长度设计为3-4L。

本发明的优点

1.离子迁移谱仪作为全血中乳酸的分析手段，前处理进行了试剂筛选，又完成了提取过程的深度纯化，有利于提取液中心点直接进样。

2.本测量方法无外置进样器，避免了传统进样器的样品转移损失，提高了全血中乳酸分析检测灵敏度；样品光电离中心点直接进样，提高了电离效率。

3.本发明中的样品，由出气管外设的抽气泵小气流载带完成缓慢渐进式热解吸气化，有利于解决电离区材料对乳酸的吸附，避免了记忆效应。

附图说明

图1为检测乳酸的离子迁移谱仪装置结构原理示意图；

图1-1中，1为VUV灯光电离源；2为离子迁移管电离区；3为离子迁移管迁移区；4为连接抽气泵的离子迁移管出气接口；5为连接化学掺杂剂(dopant)接口；6为离子迁移管样品进样口管；7为变径绝缘内套管；8为漂气入口；9为微量进样器；10为放大器；11为A/D转换器；12为数据处理系统；13为离子门；14为泵。

图1-2为变径内套管阶梯式结构示意图。7-1为内套管上层圆台结构；7-2为一阶台面。

图1-3为掺杂剂筒装置示意图，图中：51为掺杂剂筒(左、C图)，52为dopant气空气气源入口，53为dopant气出口，54为四氟管，55为样品瓶(右、D图)，56为化学掺杂剂丙酮。

图2为离子迁移谱仪检测乳酸血样定性分析的离子迁移谱图。

图3为离子迁移谱仪检测乳酸血样定量分析的标准曲线拟合图。

图4为离子迁移谱仪检测乳酸血样的跟踪信号离子迁移谱图。

具体实施方式

以下实施例中所涉及离子迁移谱的操作均使用图1所示结构的离子迁移谱仪装置进行检测；

离子迁移管为VUV灯光电离源，圆形灯窗截面半径6mm，包括同轴的圆筒形电离区和圆筒形迁移区，电离区长度25mm，内筒直径20mm；迁移区长度90mm，内筒直径25mm。于电离区和迁移区之间设置有离子门，于电离区远离离子门的一侧设有光电离源；于电离区的离子迁移管外壁面上设有离子迁移管样品进样口6；

在离子迁移管样品进样口6内插入有变径绝缘内套管7，变径绝缘内套管7一端处于离子迁移管的电离区，另一端处于离子迁移管外部；

变径绝缘内套管7是空心的、内径阶梯式变径结构；位于离子迁移管外部的另一端内径大于处于电离区一端的内径。

所述内径阶梯式变径结构的阶梯数或台阶数为1，是由二内径大小不同的二端开口的空心管中的一个空心管的一开口端与另一个空心管的一开口端端面密闭相连而成的二端开口的中空管，二空心管同轴，中空管内二空心管连接处形成的环状面即为阶梯台面，阶梯台面与中空管的轴线相垂直；内径大的空心管位于离子迁移管外部的另一端设置，内径小的空心管位于电离区一端设置；

变径绝缘内套管7处于电离区一端的内径为0.8mm，阶梯台面的径向宽度0.35mm，位于离子迁移管外部的另一端的内径为1.5mm。

电离区和迁移区均为同轴的圆柱状，其轴向中心线平行于水平面放置，进样口6位于离子迁移管的中上部；

在离子迁移管样品进样口6内插入变径绝缘内套管7，变径绝缘内套管内的阶梯式变径的阶梯台面可作为全部或部分液体进样样品的存放台，离子迁移管液体进样样品进样时，可将液体进样样品滴加到阶梯台面，然后进样口6与载气气源相连即可，进样口6无需单独再连接进样器；

进样口6为圆形通孔，变径绝缘内套管7为圆形管，变径绝缘内套管7外径“r1”小于等于离子迁移管样品进样口6内径“r2”，即r1≤r2，r1和r2满足r2＝5mm，且r2与r1的差值0.05mm；二者之间的空隙可实现向迁移管内抽气补气作用，减少样品气流。

于变径绝缘内套管7位于离子迁移管外部的另一端外壁面上沿径向方向设有中空的环状倒圆锥台形突起，突起沿变径绝缘内套管的轴线方向的截面为二个以变径绝缘内套管轴线为对称轴的对称直角三角形，三角形的一条径向方向的直角边A位于远离离子迁移管的一侧，直角边A对应的顶角A位于靠近离子迁移管的一侧，三角形的另一条直角边与变径绝缘内套管的轴线平行；直角边A的长度大于r2与r1的差值；

在环状倒圆锥台形突起的外壁面上沿轴线方向(从圆锥台的下底边向上底边的方向)设有1个，凹槽从直角边A向顶角A处(即从圆锥台的下底边向上底边的方向)的径向截面面积逐渐变小，凹槽径向截面上的宽度0.15mm，凹槽深度0.10mm；抽气泵工作时，凹槽也可以实现补气功能。

离子迁移管包括分别于左右二端相对设置的光电离源(如：VUV灯光电离源)和法拉第盘，以及位于光电离源和法拉第盘之间的离子门，光电离源与离子门之间的区域为电离区，离子门与法拉第盘之间的区域为迁移区；

于离子迁移管外壁面上电离区靠近光电离源一侧向离子门一侧依次设有三个通孔，分别为用于连接抽气泵的离子迁移管出气接口4，用于连接化学掺杂剂(dopant)源的接口5，离子迁移管样品进样口6；这三个通孔与离子迁移管外壁面上迁移区靠近离子检测器一侧设有的漂气入口8共同组成离子迁移管的气路循环系统对外接口；离子迁移管出气接口4连接抽气泵进气口作为离子迁移管气体流出口，其余均为气体流入口。

变径绝缘内套管7的材料为聚四氟乙烯。

其中变径绝缘内套管7长度6cm，处于离子迁移管外部的一端作为样品进样口的端口，处于电离区的另一端端口插入位置刚好位于光电离源圆形光窗发射出的圆柱状光路(光照射区域)靠近变径绝缘内套管的一侧侧面至中心轴线之间的区域；圆柱状光路的半径等于光电离源(如：VUV灯)圆形光窗半径，圆柱状电离区的半径是在1.5倍光窗半径。

光电离源灯窗距离离子门轴向距离设定为“L”，变径绝缘内套管7处于电离区的另一端端口于离子迁移管内的轴向位置与光电离源灯窗的距离为18/25L，径向位置处于灯窗发射出的光路中心轴线。实施例中灯窗距离离子门轴向距离“L”为25mm，中心点进样位置为18mm点处。

液体样品、或固体样品用有机溶剂稀释后提取的液相部分、或液体样品用有机溶剂溶解后浸提的液相部分作为液体进样样品，液体进样样品装入于带有注射器针头的注射器筒体内，注射针头出口插入变径绝缘内套管后推出注射器筒体内的样品，随后样品富集于变径绝缘内套管内的阶梯面，在载气的作用下，持续气化于电离区发生高效热电离；

液体进样样品在装入微量进样器之前要通过滤膜进行过滤样品的前处理过程，微孔滤膜孔径0.22μm，微量进样器注入变径绝缘内套管中的样品量为2μl。

光电离离子迁移谱分析仪，靠近VUV灯的电离区三个通孔管分别为连接抽气泵离子迁移管出气接口4；连接化学掺杂剂(dopant)接口5；离子迁移管样品进样口管6。实施例中离子迁移管漂气(空气)气流为600sccm，抽气泵抽气流速为850sccm，dopant气(以空气为载气)流速为50sccm，样品载气(空气)为200sccm。离子迁移管温度控制设定100℃，离子门开门时间设定50μs。

在离子迁移管连接化学掺杂剂(dopant)接口5通过管路与一掺杂剂筒装置(如图1-3)连接，掺杂剂筒装置包括一上端开口的圆筒状掺杂剂筒(如图1-3左、C图)，掺杂剂筒51上开口端外壁面带有外螺纹，于掺杂剂筒上开口端螺合有一带内螺纹的圆柱状密封盖，通过密封盖将掺杂剂筒上开口端密封，于圆掺杂剂筒的下部侧壁面上设有一个下通孔作为dopant气空气气源入口52与空气气源相连，于圆掺杂剂筒的上部侧壁面上设有一个上通孔作为dopant气出口53通过导管与化学掺杂剂(dopant)接口5相连，掺杂剂筒内装一个中空密闭的样品瓶(如图1-3右、D图)，于样品瓶内装置有化学掺杂剂丙酮56，于样品瓶55顶部插入有一根(外径

以下实施例中离子迁移谱的实验条件均为：电离源为光电离源的离子迁移谱，乳酸样品中心点直接进样方式。实验时迁移管温度保持在100℃，样品载气(空气)、漂气(空气)、dopant气(丙酮)气流分别为200、600、50mL/min。

发明中的离子迁移谱仪，VUV灯光电离源；离子迁移管检测器从左到右依次是VUV灯(1)、电离区结构(2)、迁移区结构(3)，位于电离区(2)和迁移区(3)之间的是离子门(13)。样品在电离区由VUV灯光电离源照射下发生电离，依次通过离子门进入迁移区，在迁移区因迁移速度不同最后被离子接收器接收并传输处理。试验中的离子迁移管灯窗截面半径6mm，电离区长度25mm，内筒直径20mm；迁移区长度90mm，内筒直径25mm。灯窗距离离子门轴向距离“L”为25mm，中心点进样位置为18mm点处。

为了实现全血中乳酸的准确、快速、灵敏检测，本发明用离子迁移谱仪作为分析手段，将乳酸标准品溶于全血中(配成浓度为100、200、400、600、800、1000μg/mL的乳酸溶液)，作为标准样品，由负离子模式下离子迁移谱仪为检测仪器，分别获得检测信号，软件自动识别相关信息可获得标准曲线方程，未知乳酸浓度样品带入标准曲线方程，可直接计算全血中乳酸含量。

实施例1

初始实验探索了甲醇、乙腈、正己烷、四氯化碳、乙酸乙酯或甲基叔丁基醚等溶剂做全血中乳酸的提取剂。取乳酸浓度为1000μg/mL全血样品(10个18-60岁健康人的混合血液为溶剂)lmL于样品瓶中，分别添加1mL上述不同溶剂，超声2min(功率500w)，离心2min(转速12000rmp)，离心后取上清液过膜(有机膜，孔径0.22μm)，2μL中心点进样进入离子迁移管电离区。甲醇、乙腈因与血液互溶所以不合适；正己烷、四氯化碳几乎不提取乳酸，所以不适合。通过比较乙酸乙酯或甲基叔丁基醚乳酸提取信号检测强度效果，相同乳酸浓度、乙酸乙酯中乳酸检出信号最强，因此后续实例中实验均选用乙酸乙酯。

实施例2

乳酸样品定性分析检测：

微量进样器准确量取400μg/mL的乳酸标准样品(10个18-60岁健康人的混合血液为溶剂)lmL于样品瓶中，添加1mL乙酸乙酯，超声2min(功率500w)，离心2min(转速12000rmp)，离心后取上清液过膜(有机膜，孔径0.22μm)，提取液2μL注入离子迁移管电离区，样品分子在电离区被直接被电离成正、负离子，热载气通过周期性开启的离子门，进入由均匀电场构成的漂移区，在漂移区得到分离与检测获得检测信号。图2给出了用本发明装置负离子模式离子迁移谱检测乳酸的离子迁移谱图，从图中可以看出，负离子模式乳酸检测目标峰为4.555ms。

实施例3

乳酸标准样品前处理方法：

微量进样器准确量取100、200、400、600、800、1000μg/ml一系列浓度乳酸标准样品(10个18-60岁健康人的混合血液为溶剂)lmL于样品瓶中，添加1mL乙酸乙酯，超声2min(功率500w)，离心2min(转速12000rmp)，离心后取上清液过膜(有机膜，孔径0.22μm)，提取液2μL注入离子迁移管电离区。

乳酸标准样品定量分析检测：

用负离子模式光电离离子迁移谱分析检测仪对上述前处理获得的含乳酸的溶液进行检测分析，获得检测信号；记录负离子模式下乳酸的出峰迁移时间和乳酸峰连续0-30S内信号跟踪变化趋势曲线；软件调取乳酸峰跟踪变化趋势曲线可得到信号强度数据加和数值即乳酸不同浓度对应峰面积。

100、200、400、600、800、1000μg/ml一系列浓度实验发现乳酸峰(4.555ms)在100-1000μg/ml浓度范围内符合线性方程关系，如图3。方程为：Y＝4646.44+2.28*X，相关系数为0.9865。

实施例4

全血中乳酸样品的检测：

准确量取已知乳酸浓度全血样品(如：200μg/mL，10个18-60岁健康人的混合血液为溶剂配制)lmL于样品瓶中，添加1mL乙酸乙酯，超声2min(功率500w)，离心2min(转速12000rmp)，离心后取上清液过膜(有机膜，孔径0.22μm)；

用本发明装置，2μL中心点进样进入离子迁移管电离区被电离成正、负离子，通过周期性开启的离子门，进入由均匀电场构成的漂移区，在漂移区得到分离与检测获得仪器背景检测信号。检测的离子迁移谱图，连续采集4.555ms信号峰0.5min，如图4所示。

记录的乳酸峰累计加和信号依次为4812mv、5017mv和5528mv，带入标准曲线方程为：Y＝4646.44+2.28*X，计算获得乳酸浓度207μg/mL，与真值200μg/mL接近。