一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸FPP的报告系统、构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸FPP的报告系统、构建方法及其应用，并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白结构，报告系统在不同FPP水平以及不同发酵时间下的响应效果，属于生物工程技术领域。

背景技术

异戊二烯类化合物存在于所有生物体中，是最多样化的天然物质之一。目前已知至少有50，000种结构，其中许多结构在医疗和技术应用方面具有巨大潜力。在异戊二烯形成的一类最为重要的代谢物：萜烯类化合物中存在一个中心代谢物质：法尼基焦磷酸FPP，FPP作为合成倍半萜烯的关键性前体，参与包括胡萝卜素、番茄红素、罗汉果苷等多种高附加值产品。

随着生物技术的发展,合成生物学受到越来越多的关注。通过在微生物底盘细胞中重组天然化合物的生物合成途径，来快速、大量的获取天然产物及其中间体，为植物天然活性产物的开发与应用提供了新的方法。微生物具有生长速度快、发酵周期短、发酵成本低的优点，且相对于植物其遗传背景更清楚有利于遗传改造。基于这些优点，多种萜烯类化合物已成功在微生物底盘中生产，而想要在微生物底盘中更加高效地进行生产，精准的调控和检测细胞内的FPP含量就至关重要，基于这一需求，我们开发了一种使用分裂式荧光蛋白检测FPP的方法。

发明内容

本发明的目的是构建一种能够在细菌中快速响应法尼基焦磷酸FPP的报告系统并将其工业化应用。该报告系统由两个独立表达的蛋白FPPR1和FPPR2构成。将两个蛋白以基因簇的形式转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中构建获得。

为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下：

该报告系统通过如下步骤构建获得：

构建组成性表达FPPR的重组质粒：

(1)分别合成插入了FPP结合序列的麦芽糖结合蛋白及其锚定蛋白,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

(2)分别合成β-桶蛋白的N端以及C端序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

(3)将步骤(1)及(2)扩增得到的麦芽糖结合蛋白与β-桶蛋白的N端连接,获得FPPR1；将步骤(1)及(2)扩增得到的锚定蛋白与β-桶蛋白的C端连接，获得FPPR2；FPPR1、FPPR2的序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。

(4)根据具体使用环境，选择具有合适强度的组成性启动子，将FPPR1、FPPR2串联表达，并转入用于生产的底盘菌株使用。

本发明的有益效果是：本发明构建的传感器在野生型大肠杆菌BL21以及过表达FPP生产途径的大肠杆菌BL21-MVA中分别验证了可用性，该方法适于工业化生产中FPP的实时检测。

附图说明

图1FPPR重组载体谱图；

图2FPPR结合FPP时的结构示意图；

图3FPPR用于检测不同FPP水平的菌株；

图4FPPR荧光强度随发酵时间的变化情况。

具体实施方式

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

一般性说明：实施例所涉及材料包括RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、快切酶、无缝连接酶、质粒试剂盒、胶回收试剂盒，但不限于此。操作完全按照相应说明书进行。

E.coli JM109感受态细胞、E.coli BL21(DE3)感受态细胞按Competent CellPreparation Kit说明书制备,具体步骤如下：

1.使用无抗性LB平板培养基，用接种针挑取大肠杆菌(-80℃甘油保存菌)，平板培养基上分级划线，上述划线的平板培养基倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。

2.在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到20mL无抗性的LB培养基中，37℃振荡(约120rpm)培养。测定OD

3.取步骤(2)菌体培养液1ml于1.5mL离心管中，6000rpm 4℃离心6分钟，弃上清

4.在每个离心管中加入100μL冰中预冷的Solution A，轻弹动离心管使沉淀悬浮，避免剧烈振荡。

5.6000rpm 4℃离心6分钟。

6.在每个离心管中加入100μL冰中预冷的Solution B，轻轻弹动离心管使沉淀悬浮，避免剧烈振荡。

7.感受态细胞制作完成。本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。

实施例1FPPR重组质粒的构建

本实施例为本发明所述FPPR重组质粒的构建

1)引物的设计

根据质粒进行FPPR1、FPPR2片段的扩增，具体引物设计为：

FPPR1-F：tagagaaagaggagaaatactagATGTCAAAGATAGAGGAAGGAAAACTAGT

FPPR1-R：ctttcgactgagcctttcgtttcaTTTGTAACGTTCATCCATACCCA

FPPR2-F：gaaagaggagaaatactagATGGTATCAAAAGGAGAAGAGAC

FPPR2-R：gtatttctcctctttctctagtattaCGCTGCTTTTTGCAGA

2)PCR扩增

扩增反应体系为：PCR反应组成液(50ul)

PCR反应的条件：98℃30s，58℃30s，72℃1.5min，35个循环，得到PCR产物最后保存于4℃中。

PCR产物经过胶回收试剂盒回收后测序，测序所得序列如SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10所示

3)双酶切和连接

将pSB1C3质粒进行双酶切，酶切体系为

上述反应在37℃反应3h后进行核酸胶回收，然后与PCR回收产物进行连接。

连接体系为：

上述反应在37℃反应30min，然后冰浴5min，准备转化。

4)转化

1.取1管上述制得的JM109感受态置于冰上融化。

2.将连接反应液全部转入JM109感受态中，并吹打均匀。

3.冰浴30min。

4.在42℃水浴中热激90s，然后冰浴2min。

5.加入1mL LB培养基，在37℃条件下培养1h复壁。

6.5000r/min离心5min，弃900ul上清，剩余菌体和培养液吹打均匀，涂布含有Amp抗性的平板。

7.37℃过夜倒置培养。

8.挑选6个单克隆重组质粒进行菌落PCR阳性鉴定，并将阳性克隆进行测序。测序引物为pSB1C3上抗性启动子序列TTTGTTTATTTTTCTAAATA。

9.比对测序结果，得到阳性重组质粒，其图谱如图1所示。

10.将阳性重组质粒转入BL21(DE3)感受态得到重组菌株备用。

实施例2将实施例1构建的质粒在工程菌株E.coli BL21(DE3)中组成性表达，FPPR结合FPP时的结构示意图如图2所示，并于6h发酵后使用酶标仪/流式细胞仪进行荧光检测。具体参数为Ex 492nm，Em 510nm。

实施例3本实施例为本发明所述的报告系统随着菌株FPP水平的变化进行FPP进行实时检测。分别测定不同的FPP水平(MVA，MVA+FPPR，FPPR)条件下的荧光强度。如图3所示，FPPR用于检测不同FPP水平的菌株，FPPR报告系统可以对菌株中FPP进行实时检测。

实施例4本实施例为本发明所述的报告系统随着菌株OD变化的进行FPP进行实时检测。分别测定不同的发酵时间值(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5h)条件下的荧光强度。如图4所示，FPPR荧光强度随发酵时间的变化情况，FPPR报告系统可以对菌株中FPP进行实时检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干优化改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。