具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及铜配合物技术领域，具体的说是一种具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物及其制备方法和应用。

背景技术

肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，具有侵袭性强、进展迅速、发病率和死亡率高等特点。顺铂是肝癌的经典化疗药物。铂类化疗耐药是肝癌细胞预后不良和复发的关键因素。肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药性会迅速诱导对其他化疗药物的获得性耐受性，最终导致多药耐药。DNA损伤修复和规避细胞凋亡是肿瘤细胞对铂类药物产生耐药性的主要因素。因此，开发新的药物或治疗策略来缓解或克服铂类药物在肝癌治疗中的耐药性是迫切需要解决的临床问题。

自噬作为一种关键的细胞内降解机制，在细胞应激条件下可将受损细胞器、蛋白和其他不需要的细胞质物质等运输聚集于溶酶体中进行降解。近年来，已有不少研究报道，多种类型的化疗试剂能够在不同肿瘤细胞中通过直接或间接的方式触发过度激活的自噬，诱导非凋亡性的程序性细胞死亡或自噬性细胞死亡来抑制肿瘤细胞增殖或提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。故自噬可以充当潜在的肿瘤抑制因子，可诱导癌细胞发生非凋亡性细胞死亡，从而为治疗肝癌耐药癌细胞药物开发提供新的思路。

利用优势药效团骨架进行杂环小分子药效化合物的构建是经济、有效的新药合成策略。喹啉作为一种多功能药效团，是药物化学中的多功能支架，在抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒药物等方面具有广泛的药理应用前景。因此，如何以喹啉多功能药效团作为骨架，制备出具有肿瘤自噬诱导作用的金属基配合物，对于克服传统铂金属药物的毒性及耐药性问题来说具有重要意义。

发明内容

本发明的技术目的为：通过简单的步骤操作，快速、高效，且高收率的制备出具有肿瘤细胞自噬诱导作用，在铂类耐药肿瘤细胞水平上表现出较强的抑制肿瘤细胞增殖效果，且具有较小的正常小鼠急性毒性的全新化合物——三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物，以克服传统金属药物的毒性及耐药性问题，提高缩氨基硫脲铜配合物在改善耐药性，提高金属基药物在抗肿瘤方面的应用效果。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物，其结构式如式Ⅰ或式II所示：

其中，R基团选自下列结构中的任意一种：

具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、三氟甲基苯硫脲-喹啉配体的制备：

取原料N-(4-(三氟甲基)苯基)-肼基硫代酰胺))和喹啉-8-甲醛置于反应容器中，加入反应溶剂乙醇溶液和催化剂冰醋酸，充分混合后，于60-80℃温度条件下进行加热回流反应2-12h，静置处理后，经过滤得到配体粗品，将所得配体粗品提纯后，制得三氟甲基苯硫脲-喹啉配体，备用；

S2、式I结构铜配合物的制备：

按照摩尔比为1:(1～2)的比例，分别称取步骤S1制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体和CuI作为原料，之后，将称取的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体溶于二氯甲烷中，制成反应溶液A，再将称取的CuI溶于乙腈中，制成反应溶液B，将制得的反应溶液A加入到反应溶液B中，充分混合后，采用封层剂对所得反应体系进行封层处理，然后，置于22～27℃恒温环境下进行反应3-7天，对所得反应产物进行除杂处理后，所得长方形块状的黑绿色晶体即为式I结构的铜配合物；

S3、式II结构铜配合物的制备：

按照摩尔比为1:(1～2)的比例，分别称取步骤S1制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体和Cu(Ac)2作为原料，之后，将称取的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体溶于二氯甲烷中，制成反应溶液A，再将称取的Cu(Ac)2溶于乙腈中，制成反应溶液C，将制得的反应溶液A加入到反应溶液C中，充分混合后，采用封层剂对所得反应体系进行封层处理，然后，置于22～27℃恒温环境下进行反应3-7天，对所得反应产物进行除杂处理后，所得正方形块状的绿色晶体即为式II结构的铜配合物。

进一步的，在步骤S1中，所述反应原料N-(4-(三氟甲基)苯基)-肼基硫代酰胺))和喹啉-8-甲醛的摩尔配比为1：1。

进一步的，在步骤S1中，所述乙醇溶液为无水乙醇，且乙醇溶液的添加量为(0.6～1)L/mol反应原料。

进一步的，在步骤S1中，所述冰醋酸和乙醇溶液的添加体积配比为(0.75-1.25)：100。

进一步的，在步骤S1中，所述静置处理的时间为4-12h；配体粗品的提纯方法为，将配体粗品溶解于二氯甲烷中进行重结晶。

进一步的，在步骤S2和步骤S3中，所述的封层剂为甲醇。

进一步的，在步骤S2和步骤S3中，所述除杂处理的具体方式为，对所得反应产物依次进行过滤、洗涤、挑选和干燥。

具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物在作为抗肿瘤药物方面的应用。

具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物的衍生物，包括式Ⅰ或式II所述铜配合物的立体异构体以及其药学上可以接受的盐。

有益效果：

1、本发明提供的一种具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物，是针对肿瘤细胞对传统铂类药物产生耐药性和毒副作用的问题而开展的。本发明设计制备的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物具有优异的抗肿瘤性能，其能够诱导肿瘤细胞的DNA损伤，但不引发细胞凋亡，还能够诱导肿瘤细胞内活性氧(ROS)和Ca2+水平的稳态升高、ATP含量的降低，从而导致线粒体产生功能障碍。三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物中的Cu2+还可将机体内的谷胱甘肽(GSH)氧化为谷胱甘肽(GSSG)，进而导致GSH耗竭，并将H2O2转化为具有高度细胞毒性的活性氧(ROS)；此外，三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物还会在机体内发生类芬顿反应，被还原为Cu+，以将细胞内的GSH氧化为GSSG，并催化内源性H2O2产生剧毒羟基自由基(·OH)，引起氧化应激，从而引起肿瘤细胞的自噬，以实现较好的肿瘤治疗效果。相关研究测定显示：本发明的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物在铂类耐药肿瘤细胞水平上表现出较强的抑制肿瘤细胞增殖效果，并具有较小的正常小鼠急性毒性。可较好地改善肿瘤细胞的耐药性，提高金属基药物的抗肿瘤应用效果。

2、本发明的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物制备工艺，步骤简单易行，操作安全可靠，其以喹啉这种多功能药效团作为骨架，以具有结构多样性、易于修饰性，具有有效的供体能力参与金属配位的缩氨基硫脲衍生物作为药效团，通过特定步骤化学拼合的方式，制备出了具有不同结构药效团的杂合分子与人内源性铜离子进行有效结合，具有较好的抗肿瘤活性，可通过诱导肝癌细胞发生非凋亡性细胞死亡——自噬，来实现其抗肿瘤活性及克服耐药性的目标配合物三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物。本发明制备得到的目标铜配合物产品稳定性好，产率高，其能够通过非凋亡性细胞死亡方式显著抑制肝癌细胞SMMC7721的增殖，克服了铂类药物用于肝癌治疗的耐药性问题。具有逆转肿瘤耐药性的功用和显著的抗肿瘤功效，应用前景广泛。

3、本发明的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物制备工艺，在三氟甲基苯硫脲-喹啉配体的制备步骤中，于反应体系中添加有特定比例的催化剂冰醋酸。特定含量冰醋酸的添加，能够使配体制备步骤的反应时间明显缩短，同时，目标配体的产率也会显著提高，使制备工艺可控性更好，经济效益显著。

附图说明

图1是实施例1所制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体的1H-NMR谱图(CDCl3，400MHz)；

图2为实施例1制得的化合物1的晶体结构示意图；

图3为实施例2制得的化合物2的晶体结构示意图；

图4为实施例1制得的化合物1对正常小鼠的体重及存活率的影响图；

图5为实施例1制得的化合物1和实施例2制得的化合物2对肝癌细胞SMMC7721死亡方式的影响图；

图6为实施例1制得的化合物1和实施例2制得的化合物2处理SMMC7721细胞后的细胞形态学观察TEM图；

图7为实施例1制得的化合物1、实施例2制得的化合物2以及自噬抑制剂3-MA对肝癌细胞SMMC7721处理后细胞存活率变化图；

图8为实施例1制得的化合物1和实施例2制得的化合物2对肝癌细胞SMMC7721内自噬相关蛋白表达量的影响结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明：

本发明针对传统金属药物的毒性及耐药性问题，提供一种具有肿瘤细胞自噬诱导作用、提高抗肿瘤效果的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物的设计及制备方法。设计思路为：以氨基硫脲类衍生物与含有醛或酮的分子构建的缩氨基硫脲衍生物因其结构多样性、易于修饰性及其有效的供体能力参与金属配位，可作为药效团使用，将喹啉骨架与缩氨基硫脲药效团通过化学拼合形成的具有不同结构药效团的杂合分子与人内源性铜离子进行可以显著提高其抗肿瘤活性。本发明合成的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物可通过诱导肝癌细胞发生非凋亡性细胞死亡——自噬实现其抗肿瘤活性及克服耐药性。

制备工艺中，三氟甲基苯硫脲-喹啉有机配体在制备过程中通过在反应体系中加入冰醋酸催化剂，能够显著缩短反应时间及提高产率。目标配合物在铂类耐药肿瘤细胞水平上表现出较强的抑制肿瘤细胞增殖效果，且具有较小的正常小鼠急性毒性。

本发明的一种具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物，其结构式如式Ⅰ或式II所示：

其中，R基团选自下列结构中的任意一种：

即，式I表示的铜基配合物为以下结构式中的任意一种：

式II表示的铜基配合物为以下结构式中的任意一种：

上述具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、三氟甲基苯硫脲-喹啉配体的制备：

称取等摩尔量的反应原料N-(4-(三氟甲基)苯基)-肼基硫代酰胺))和喹啉-8-甲醛置于反应容器三口烧瓶内，之后，按照(0.6～1)L/mol反应原料的添加量，向三口烧瓶中加入反应溶剂——无水乙醇进行混合，然后，按照冰醋酸和乙醇溶液的添加体积配比为(0.75-1.25)：100的比例，再向其中加入冰醋酸作为催化剂，充分混合后，于60-80℃加热回流2-12h，静置4-12h，将反应混合物进行过滤，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体粗品，将粗品溶解于二氯甲烷进行重结晶后，制得三氟甲基苯硫脲-喹啉配体，备用；

S2、式I结构铜配合物的制备：

按照摩尔比为1:(1～2)的比例，分别称取步骤S1制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体和CuI作为原料，之后，将称取的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体溶于二氯甲烷中，制成反应溶液A，再将称取的CuI溶于乙腈中，制成反应溶液B，将制得的反应溶液A加入到反应溶液B中，充分混合后，采用封层剂甲醇对所得反应体系进行封层处理，以防止溶液挥发太快导致晶体不稳定，将半密封玻璃容器中的混合物置于于22～27℃的恒温箱中进行反应3-7天，对所得反应产物依次进行过滤、洗涤、挑选和干燥后，可得长方形块状的黑绿色晶体，即为式I结构的铜配合物，其结构如式I所示：

S3、式II结构铜配合物的制备：

按照摩尔比为1:(1～2)的比例，分别称取步骤S1制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体和Cu(Ac)2作为原料，之后，将称取的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体溶于二氯甲烷中，制成反应溶液A，再将称取的CuI溶于乙腈中，制成反应溶液B，将制得的反应溶液A加入到反应溶液B中，充分混合后，采用封层剂甲醇对所得反应体系进行封层处理，以防止溶液挥发太快导致晶体不稳定，将半密封玻璃容器中的混合物置于于22～27℃的恒温箱中进行反应3-7天，对所得反应产物依次进行过滤、洗涤、挑选和干燥后，可得正方形块状的绿色晶体，即为式II结构的铜配合物，其结构如式II所示：

具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物在作为抗肿瘤药物方面的应用。

具有肿瘤自噬诱导作用的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物的衍生物，包括式Ⅰ或式II所述铜配合物的立体异构体以及其药学上可以接受的盐，以及以所述衍生物为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的辅料制成的抗肿瘤药剂。

本发明提供的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物，结构式如式Ⅰ或式II：

实施例一

本实施例制备的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物(式Ⅰ)，以下简称化合物1，其结构式如下所示：

该化合物1的具体制备步骤如下：

(1)三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qfhc)的制备：

称取N-(4-(三氟甲基)苯基)-肼基硫代酰胺))(1mmol)和喹啉-8-甲醛(1mmol)于三口烧瓶内，向烧瓶中加无水乙醇(15mL)进行混合后，加入3滴冰醋酸作为催化剂，于70℃加热回流3h，静置4h将反应混合物进行过滤，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体粗品，将粗品溶解于二氯甲烷进行重结晶，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qfhc)，该过程的产率为89％。相比于不加入冰醋酸的对比例合成方法，配体的产率可从75％提高到89％，反应时间从16h缩短至3h。

所制得三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qfhc)1H数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.96(dd,J＝4.2,1.8Hz,1H),8.79(s,2H),8.73–8.65(m,4H),8.23(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),7.94(dd,J＝7.1,1.5Hz,1H),7.92–7.84(m,3H),7.64(dd,J＝8.2,7.1Hz,1H),7.44(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.32(ddd,J＝7.4,4.7,1.3Hz,2H)。

(2)将步骤(1)制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qfhc)(0.0036g，0.01mmol)溶于3mL二氯甲烷中，并加入到溶于3mL乙腈的CuI(0.0028g，0.015mmol)溶液中。然后，向玻璃培养瓶中加入3mL甲醇进行封层，以防止溶液挥发过快导致晶体不稳定。最后，将半密封玻璃容器中的混合物置于25℃的恒温箱中反应5天，对所得反应产物依次进行过滤、洗涤、挑选和干燥后，可得长方形块状的黑绿色晶体，即为化合物1，其晶胞参数为：

实施例二

本实施例制备的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物(式II)，以下简称化合物2，其结构式如下所示：

该化合物2的具体制备步骤如下：

(1)三氟甲基苯硫脲-喹啉配体的制备：

称取N-(4-(三氟甲基)苯基)-肼基硫代酰胺))(1mmol)和喹啉-8-甲醛(1mmol)于三口烧瓶内，向烧瓶中加无水乙醇(15mL)进行混合后，加入3滴冰醋酸作为催化剂，于70℃加热回流3h，静置4h将反应混合物进行过滤，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qfhc)粗品，将粗品溶解于二氯甲烷进行重结晶，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体，该过程的产率为89％。相比于不加入冰醋酸的对比例合成方法，配体的产率可从75％提高到89％，反应时间从16h缩短至3h。

所制得三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qfhc)1H数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.96(dd,J＝4.2,1.8Hz,1H),8.79(s,2H),8.73–8.65(m,4H),8.23(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),7.94(dd,J＝7.1,1.5Hz,1H),7.92–7.84(m,3H),7.64(dd,J＝8.2,7.1Hz,1H),7.44(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.32(ddd,J＝7.4,4.7,1.3Hz,2H)。

(2)将步骤(1)制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qfhc)(0.0036g，0.01mmol)溶于3mL二氯甲烷中，并加入到溶于3mL乙腈的Cu(Ac)2(0.0028g，0.015mmol)溶液中。然后，向玻璃培养瓶中加入3mL甲醇进行封层，以防止溶液挥发过快导致晶体不稳定。最后，将半密封玻璃容器中的混合物置于25℃的恒温箱中反应5天，对所得反应产物依次进行过滤、洗涤、挑选和干燥后，可得正方形块状绿色晶体，即为化合物2，其晶胞参数为：

实施例三

本实施例制备的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物(式Ⅰ)，以下简称化合物3，其结构式如下所示：

该化合物3的具体制备步骤如下：

(1)三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qffhc)的制备：

称取N-(4氟-3-(三氟甲基)苯基)-肼基硫代酰胺))(1mmol)和喹啉-8-甲醛(1mmol)于三口烧瓶内，向烧瓶中加无水乙醇(15mL)进行混合后，加入4滴冰醋酸作为催化剂，于60℃加热回流2h，静置5h将反应混合物进行过滤，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qffhc)粗品，将粗品溶解于二氯甲烷进行重结晶，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体，该过程的产率为80％。相比于不加入冰醋酸的对比例合成方法，配体的产率可从65％提高到80％，反应时间从13h缩短至2h。

(2)将步骤(1)制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qffhc)(0.0040g，0.01mmol)溶于3mL二氯甲烷中，并加入到溶于3mL乙腈的CuI(0.0028g，0.015mmol)溶液中。然后，向玻璃培养瓶中加入3mL甲醇进行封层，以防止溶液挥发过快导致晶体不稳定。最后，将半密封玻璃容器中的混合物置于27℃的恒温箱中反应3天，对所得反应产物依次进行过滤、洗涤、挑选和干燥后，可得长方形块状的黑绿色晶体，即为化合物3。

实施例四

本实施例制备的三氟甲基苯硫脲-喹啉铜配合物(式II)，以下简称化合物4，其结构式如下所示：

该化合物4的具体制备步骤如下：

(1)三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qdfhc)的制备：

称取N-(3,5-双(三氟甲基)苯基)肼硫代甲酰胺(1.5mmol)和喹啉-8-甲醛(1.5mmol)于三口烧瓶内，向烧瓶中加无水乙醇(20mL)进行混合后，加入4滴冰醋酸作为催化剂，于80℃加热回流4h，静置6h将反应混合物进行过滤，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qdfhc)粗品，将粗品溶解于二氯甲烷进行重结晶，得到三氟甲基苯硫脲-喹啉配体，该过程的产率为60％。相比于不加入冰醋酸的对比例合成方法，配体的产率可从60％提高到75％，反应时间从17h缩短至6h。

(2)将步骤(1)制得的三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qdfhc)(0.0046g，0.01mM)溶于3mL二氯甲烷中，并加入到溶于3mL乙腈的Cu(Ac)2(0.0028g，0.015mM)溶液中。然后，向玻璃培养瓶中加入3mL甲醇进行封层，以防止溶液挥发过快导致晶体不稳定。最后，将半密封玻璃容器中的混合物置于22℃的恒温箱中反应7天，对所得反应产物依次进行过滤、洗涤、挑选和干燥后，可得正方形块状的绿色晶体，即为化合物4。

实验测定：

以下将通过具体的实验来对本发明实施例1所制备的化合物1，以及实施例2所制备的化合物2进行性能测试。

1、化合物1和化合物2在细胞水平的毒活性测试

对本发明实施例1和实施例2制备的化合物1和化合物2进行细胞毒活测试，分别选择SMMC7721、A549、Caov-3细胞为模型，采用MTT法评估了三氟甲基苯硫脲-喹啉配体(qfhc)、顺铂、化合物1和化合物2的体外抗肿瘤活性。测试结果如下表1所示：

表1实施例1和实施例2所制备的化合物1和化合物2以及对照药物顺铂、配体对不同细胞的IC50值(24h)

由表1中的数据可知：与顺铂处理组相比，本发明实施例制备的化合物1和化合物2对所测试的肿瘤细胞株有显著的细胞毒性，且化合物1对SMMC7721的毒性大于化合物2。尤其地，对SMMC7721细胞的细胞毒性更强，经化合物1孵育24h后的细胞毒性比顺铂高出了14倍。此外，配体qfhc对所有测试的细胞系几乎无毒(IC50＞50μM)，这表明配体与铜离子的协同作用能提高配合物的细胞毒性。

2、实施例1所制备化合物1的体内急性毒性测试

对正常小鼠经尾静脉注射不同剂量的化合物1，测定两周后正常小鼠的死亡及体重变化情况，通过半数致死剂量(LD50)评估化合物1的急性毒性。测试结果如附图4所示。其中，A图为不同剂量的化合物1注射后，四组小鼠的体重变化图，其中的对照组小鼠注射生理盐水；B图为不同剂量的化合物1注射后，四组小鼠的存活数量变化图，其中的对照组小鼠注射生理盐水。

由图4可知：药物注射15天后，四组小鼠的体重均有所增加。5mg kg-1和10mg kg-1剂量组均无老鼠死亡，高剂量20mg kg-1组老鼠在第三天死亡一只，第五天死亡1只，在随后的测定时间内无死亡。表明随着配合物浓度的增加，小鼠的死亡数增多。经计算，得出其LD50值为21.4±1.3mg Kg-1，明显高于文献中报道的顺铂的LD50(4mg kg-1)值，说明化合物1相比于顺铂来说，对机体的毒性较低，有助于降低毒副作用。

3、化合物1和化合物2诱导的细胞死亡方式分析

操作步骤：将SMMC7721细胞接种到6孔板中，孵化过夜使其贴壁；将含有不同浓度的化合物1和化合物2的培养液加入6孔板中，在37℃下培养12h，收集细胞；将细胞进行凋亡染色后分析细胞死亡方式。具体测试结果如附图5所示。

由图5可知：与对照组细胞(只添加等量培养液)相比，经不同浓度的化合物1和化合物2处理后，SMMC7721细胞虽然出现了死亡，但并不是明显的细胞早期和晚期凋亡，说明其并未诱导肿瘤细胞发生经典的细胞死亡方式——细胞凋亡。这一结果表明，三氟甲基苯硫脲-喹啉铜诱导的不同于传统铂类的细胞死亡方式有望克服肿瘤细胞的耐药性问题。

4、化合物1和化合物2诱导的肿瘤细胞形态学检测

操作步骤：将SMMC7721细胞接种到10cm培养皿中孵化过夜，使其贴壁；将含有不同浓度化合物1和化合物2的培养液加入10cm培养皿中，在37℃下分别培养12h，收集细胞并使用戊二醛进行预固定；固定并切片的细胞进行透射电镜分析，以确定细胞形态。具体测试结果如附图6所示。图中，A:对照组，B:化合物1(2μΜ)，C:化合物2(10μM)，D:化合物1(4μΜ)，E:化合物2(4μM)。

由图6可知：与对照组细胞(只添加等量培养液)相比，经不同浓度的化合物1和化合物2处理后的肿瘤细胞内可观察到明显的自噬空泡，且随着浓度增加，自噬现象更加显著。说明化合物1和化合物2能够诱导肿瘤细胞发生自噬性细胞死亡。

5、化合物1和化合物2诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡的调控分析

操作步骤：将SMMC7721细胞接种在96孔板上，并在37℃下孵育过夜。分别用含有不同浓度的化合物1和化合物2的培养液处理细胞。将化合物1和化2的浓储溶液及自噬抑制剂3-MA在完全培养基中稀释(DMSO<0.5％)并加入孔中。孵育24h后，每孔加入MTT(20μL，5mg/mL在PBS中)并继续孵育4h。去除每孔中的培养液与MTT混合溶液，并加入DMSO(150μL)溶解甲瓒，于水平摇床上摇动96孔板直至溶液均匀。用酶标仪测量每个孔在570nm处的OD值，并计算半数抑制浓度值(μM)。通过使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别与化合物1和化合物2共孵育SMMC7721细胞24h后的细胞增殖情况。具体测试结果如附图7所示。

由图7可知：在加入3-MA后，化合物1和化合物2处理的细胞其细胞活力明显提高，表明化合物1和化合物2诱导的自噬能够显著杀死肿瘤细胞，增强其细胞毒性效果。

进一步通过Western Blot实验对自噬相关蛋白LC3进行检测

操作步骤：将SMMC7721细胞接种在10cm的培养皿中，并分别使用含有不同浓度的化合物1和化合物2的培养液处理细胞24h。然后用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液于冰上对细胞进行裂解，使用蛋白质测定试剂定量蛋白浓度，将等量的蛋白质进行电泳及转膜实验，最后进行蛋白变化分析。具体测试结果如附图8所示。

由图8可知：经化合物1和化合物2处理后的细胞内LC3-II蛋白表达量与对照组相比明显上调。这一结果表明三氟甲基苯硫脲-喹啉铜化合物1和化合物2可激活肝癌细胞SMMC7721细胞内的自噬通量，发生不同于顺铂的新的细胞死亡方式—自噬性细胞死亡，从而具备新型金属基细胞自噬诱导剂用于高效提高抗肿瘤效果、克服耐药性的潜力。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。