一种解磷假单胞菌及其应用

技术领域：

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种解磷假单胞菌及其应用。

背景技术：

磷是植物生长所必需的大量元素，也是农业生产中最重要的养分限制因子。我国土壤中全磷含量约为40～2500mg/kg，但能够被植物直接吸收利用的有效磷平均含量不足10mg/kg。而外施的磷肥当季的利用率仅10％～15％，绝大部分磷素都与土壤中Ca

大量研究表明溶磷细菌能通过分泌有机酸、胞外酶等方式将土壤中的难溶性磷活化，提高土壤有效磷的含量，促进植物对磷素的吸收和利用，从而提高植物的产量，在农业生产上有着重要的应用潜力和经济价值。目前大多溶磷细菌在NBRIP培养基中溶磷量约100～500mg/L，已报道的有芽胞杆菌(Bacillus)、类芽胞杆菌(Panebacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、微杆菌(Microbacterium)等30多个属，对植物生长均表现出了显著的促进作用。除溶解土壤中难溶性的磷素外，部分解磷细菌还能够通过分泌ACC脱氨酶、铁载体、植物生长素(IAA)等作用促进植物的生长。因此，不断发掘高效的溶磷微生物新资源，利用其制备的微生物菌剂、微生物肥料等产品将难溶态磷转化为植物可吸收利用的有效磷，提高土壤磷素的有效性，这对于改善土壤肥力，保护农业生态环境和支撑农业可持续发展都具有十分重要的意义。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种具有高效溶磷能力的解磷假单胞菌(Pseudomonas phosphatilytica)PD171，其于2020年10月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：61233。

本发明的第二个目的是提供解磷假单胞菌PD171在制备溶解无机磷制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种溶解无机磷制剂，其含有解磷假单胞菌PD171作为活性成分。

所述的溶解无机磷制剂可以为微生物菌剂或生物肥料等。

与现有技术相比，本发明有如下优势：

①溶磷假单胞菌PD171是不同于其他溶磷细菌的假单胞菌新物种；

②溶磷假单胞菌PD171在NBRIP中培养4天能溶解无机磷量高达607.37mg/L，溶磷能力显著优于大多已报道的溶磷细菌(溶磷量100～500mg/L)。

因此，本发明公开的溶磷假单胞菌PD171可用于提高土壤中磷的有效性，在促进植物生长，制备微生物菌剂和生物肥料等方面具有重要的应用潜力。

附图说明：

图1是溶磷假单胞菌PD171细胞透射电镜观察图。

图2是基于溶磷假单胞菌PD171的16S rRNA基因序列构建的NJ系统进化树。

图3是溶磷假单胞菌PD171溶磷效果及培养液pH变化。

具体实施方式：

以下实施例用于解释本发明，但不用来限制本发明的保护范围。以下实施方式除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例1溶磷菌株PD171的分离

从广东省韶关市大宝山矿区采集重金属污染土壤样品。称取土壤样品10g于90mL灭菌双蒸水中，180r/min振荡30min，后采用10倍梯度逐级稀释土壤溶液为10

PVK固体培养基：葡萄糖10g，Ca

TSA培养基：胰蛋白胨15.0g，大豆胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.3，将各成分混合均匀，调pH值，121℃灭菌20min备用。

实施例2菌株PD171的分类鉴定

表型特征：将菌株PD171采用三区划线方式接种于TSA培养基上，30℃培养3天后观察其菌落形态。取培养的菌落进行革兰氏染色，制备透射电镜观察样本，采用HitachiH7650透射电镜观察菌株的细胞形态。荧光素、绿脓素、氧化酶、过氧化氢酶、甲基红、水解淀粉试验方法参考《常见细菌鉴定手册》，硝酸盐还原、吲哚、β-半乳糖苷酶、水解明胶、水解七叶灵、精氨酸双水解酶等测试则采用API 20NE试剂条(法国梅里埃生物)。溶血试验则采用血平板接种后30℃培养7天观察有无溶血圈。

菌株PD171在TSA上呈浅黄色，规则圆形，表面湿润光滑，边缘整齐。菌株PD171革兰氏染色为阴性，细胞呈短杆状，具有端生鞭毛(图1)。产荧光素、氧化酶、过氧化氢酶和精氨酸双水解酶等均为阳性；β-半乳糖苷酶、绿脓菌素、甲基红、硝酸盐还原、吲哚、水解淀粉、水解明胶、水解七叶灵、溶血试验等反应均为阴性(表1)。

表1菌株PD171的表型特征

系统进化分析：采用细菌DNA提取试剂盒提取菌株PD171的基因组DNA。以提取的DNA为模板，采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR反应体系(25μL)：2×PCRMix 12.5μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，模板DNA 1μL，ddH

比较基因组学分析：基因组提取采用细菌基因组提取试剂盒(Magen)，后经16SrRNA基因扩增验证后由上海派森诺生物技术有限公司完成基因组测序，PE文库构建和上机测序均由其完成，测序采用Illumina Hiseq 2500平台。采用SPAdes v3.13.0完成下机数据的基因组组装。从NCBI数据库中搜集拟用于比较的已发表模式种的基因组序列，基于基因组序列采用FastANI计算平均核苷酸一致性(ANI)。采用在线工具GGDC 2.1(http://ggdc.dsmz.de/home.php)计算基于基因组序列的模拟DNA-DNA杂交值(dDDH)。菌株PD171的基因组大小约5.08Mb，GC含量60.62mol％。基于比较基因组分析结果如表2所示，菌株PD171与亲缘关系最近的21个已发表模式菌株的ANI值为77.73％～85.55％，显著低于目前公认的95％～96％ANI作为物种界限的阈值，而与之相应的dDDH值则分别为21.90％～29.90％，显著低于70％dDDH作为物种界限的阈值。这些证据表明菌株PD171代表了假单胞菌属的一个不同的新物种，本发明将该菌株PD171命名为解磷假单胞菌(Pseudomonasphosphatilytica)PD171，于2020年10月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：61233。

表2菌株PD171与21个近缘模式种的比较基因组分析

实施例3溶磷假单胞菌PD171在NBRIP培养基中溶磷能力分析

采用R2A液体培养基对溶磷假单胞菌PD171活化，30℃培养生长至对数期后按1％(v/v)的接种量接种到含40mL NBRIP液体培养基的三角瓶中，30℃摇床180r/min振荡培养，并以加入未接种溶磷假单胞菌PD171的灭菌R2A液体培养基作为对照，每个处理设置4个重复。从第3天开始，每隔24小时取样，监测至振荡培养7天。不同时间采集样品先经过12000r/min离心后，取上清用0.02μm的无菌滤膜过滤除菌后-30℃冷冻存储，待测定。采用钼锑抗比色法测定不同时间采集样品中的水溶性磷(ws-p)的含量，并用pH测定上清液的pH值变化，溶磷假单胞菌PD171溶磷量的计算中扣除了空白对照。

溶磷假单胞菌PD171对Ca

R2A液体培养基：酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K

NBRIP液体培养基：葡萄糖10g，Ca

序列表

<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120> 一种解磷假单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1513

<212> DNA

<213> 解磷假单胞菌(Pseudomonas phosphatilytica)

<400> 1

gccctttacg gctaccttgt tacgacttca ccccagtcat gaatcacacc gtggtaaccg 60

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