一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法

技术领域

本发明属于农产品精深加工技术领域，涉及一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法。

背景技术

芸豆，学名菜豆，俗称二季豆或四季豆，属于蔷薇目豆科菜豆属的植物，一年生、缠绕或近直立草本植物。芸豆喜温暖，不耐霜冻，原产于美洲，现已在我国广泛栽培。芸豆是一种可以食用的豆科植物，嫩荚或种子可作鲜菜，也可加工制作罐头、腌渍、冷冻、干制等。芸豆的药用价值也很高，我国古代医籍记载，芸豆味甘平，具有温中下气、利肠胃、止呃逆、益肾补元等功用，是一种滋补食疗佳品；现代医学分析，芸豆含有凝集素等多种球蛋白，对多种病症具有一定疗效。

凝集素（Lectin）是指一种从各种植物、无脊椎动物或高等动物中提纯的一类能凝集细胞和沉淀单糖或多糖复合物的非免疫来源的非酶蛋白质。植物凝集素是凝集素的一类，由于其对于单糖或糖复合物特异性结合的能力，使得其在如信号转导、免疫反应、植物防御等诸多信号过程中均具有重要作用；同时植物凝集素具有细胞凝集、抗病毒、抗真菌及诱导细胞凋亡或自噬等多种能力；因此，植物凝集素在生命科学、医学及农业方面均有较好的研究价值和应用前景。

芸豆凝集素（Phytohemagglutinin PHA）是一类从芸豆中提取的四聚体糖蛋白，具有糖结合专一性、α-葡萄糖苷酶抑制活性、诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子以及抗HIV病毒等有益的生物学活性，在医药学领域有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：将芸豆放入浸泡清洗设备中，在浸泡清洗设备中注入温度为15-35℃的纯化水，使纯化水淹没芸豆，处理30-45min；清洗过程中，进水口匀速进水，出水口匀速出水，进水流量为每小时100-200倍芸豆质量；同时，清洗过程中每间隔5-7min，启动超声波处理一次；

步骤2：将步骤1得到的芸豆沥去表面水分，采用真空表压-0.09~-0.10 Mpa、温度35-40℃进行干燥处理30-60min；然后将干燥后的芸豆放入球磨机中，在氮气保护下研磨至物料细度低于60目，得到芸豆粉；

步骤3：将芸豆粉放入二氧化碳超临界萃取设备的萃取釜中，进行萃提除杂处理，收集萃提后留下的物质；

步骤4：将步骤3得到的萃提后留下的物质与中性pH缓冲溶液按质量比1:8-12混合；然后以60-120r/min对混合物料进行搅拌4-6h，接着对混合物料采用转速3000-4000 r/min离心处理5-10min，收集上清液，即为芸豆蛋白粗提液；

步骤5：向所述芸豆蛋白粗提液中加入酸液并不断搅拌，调节芸豆蛋白粗提液的pH值为3.4-3.8，然后静置沉淀30-45min；将静置后的溶液采用转速1000-2000 r/min离心处理5-10min，收集上清液；

步骤6：向步骤5得到的上清液中加入其质量0.75-1.5%的活性炭，搅拌90-180s后静置30-45min；将静置后的物料采用转速1000-2000 r/min离心处理5-10min，收集上清液；

步骤7：对步骤6得到的上清液采用sephacryls-200分子筛凝胶过滤柱层析处理，收集层析纯化后的物料，即为芸豆凝集素。

优选的技术方案为：步骤1中，超声波频率为25-35 KHz、功率密度为0.25-0.50W/cm

优选的技术方案为：所述萃提除杂处理包括采用2次连续的超临界萃取操作，第一次萃取的工艺参数为：萃取压力25-30Mpa、萃取温度37.0±0.3℃、萃取时间15-30min；第二次萃取的工艺参数为：萃取压力28-33Mpa、萃取温度45.0±0.3℃、萃取时间15-30min。

优选的技术方案为：所述中性pH缓冲溶液为pH 7.2 PBS缓冲溶液或者Tris-Hcl缓冲溶液。

优选的技术方案为：所述中性pH缓冲溶液的离子强度为10-20 mM。

优选的技术方案为：所述酸液为柠檬酸、醋酸、磷酸中的至少一种。

优选的技术方案为：所述活性炭为干燥的食品用活性炭，比表面积10-20m

优选的技术方案为：采用sephacryls-200分子筛凝胶过滤柱层析处理的操作为：pH 7.2 PBS缓冲溶液体系平衡凝胶色谱柱，不超过15%柱体积样品上样，继续采用pH 7.2PBS缓冲溶液洗脱，流速0.8 ml/min，收集第一个峰区域样品，冷冻干燥后即为高纯度芸豆凝集素。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1、本发明采用超声波辅助流水清洗和充氮气球磨处理芸豆，有效脱除芸豆表面杂质，避免粉碎中的氧化，为凝集素提取提供了洁净和无氧化的芸豆粉原料。

2、本发明采用2次二氧化碳超临界萃取处理，萃提除去了芸豆中的脂肪及脂溶性物质，有利于提高芸豆凝集素的提取效率和提取纯度。

3、本发明采用酸沉淀、活性炭吸附、分子筛层析等处理，精制纯化得到了高纯度芸豆凝集素。

附图说明

图1为芸豆凝集素样品液相图谱。

图2为上清液液相图谱。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-2。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法

一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法，包括以下技术步骤。

（1）芸豆超声波辅助流水清洗

芸豆原料，为成熟度适中、干燥、无虫害、无霉变的白芸豆、红芸豆、黑芸豆中的一种。

将芸豆放入带有超声波发生装置的浸泡清洗设备中，在设备中注入食品级纯化水，使水淹没芸豆；设备浸泡清洗罐的顶部设有进水口，底部设有带有滤网的出水口，清洗过程中，进水口匀速进水，出水口匀速出水，水温20℃，进水流量为每小时150倍芸豆质量，出水口的滤网能够截留芸豆；同时，清洗设备每间隔6min，启动超声波处理一次，超声波频率30 KHz、功率密度0.35/cm

（2）充氮气球磨

将清洗后的芸豆沥去表面水分，采用真空表压-0.09~-0.10 Mpa、温度35-40℃的真空低温干燥处理30-60min。

将真空低温干燥后的芸豆放入食品卫生级密闭型球磨设备中，抽去空气，充入氮气，开启球磨设备，充分研磨至物料细度低于60目，得到芸豆粉，备用。

（3）超临界除杂处理

将（2）中芸豆粉放入二氧化碳超临界萃取设备的萃取釜中，进行萃提除杂处理，收集萃提后留下的物质，备用。所述的萃提除杂处理，采用2次连续的超临界萃取操作，第一次萃取的工艺参数为：萃取压力28Mpa、萃取温度37.0℃、萃取时间20min；第二次萃取的工艺参数为：萃取压力30Mpa、萃取温度45.0℃、萃取时间20min。

（4）常温浸提

将（3）中芸豆粉萃提除杂后的物质、中性pH缓冲溶液，按质量比1:10混合；对混合物料保持常温和搅拌转速80r/min；浸提5h后，将混合物料采用转速3500 r/min离心处理8min，收集上清液，即为芸豆蛋白粗提液。

所述的中性pH缓冲溶液，为pH 7.2 PBS缓冲溶液，或者Tris-Hcl缓冲溶液，优选的，缓冲溶液离子强度为15mM。本实施例具体选择pH 7.2 PBS缓冲溶液。

（5）酸沉淀处理

向（4）中芸豆蛋白粗提液中缓慢加入酸液并不断搅拌，调节芸豆蛋白粗提液的pH值为3.6，然后静置沉淀35min；将静置后的溶液采用转速1500 r/min离心处理7min，收集上清液，备用。

优选的，酸液为柠檬酸、醋酸、磷酸中的一种或多种。本实施例具体选择柠檬酸。

（6）活性炭恒温吸附除杂

向（5）中上清液加入1%活性炭，充分搅拌150s，然后静置35min；将静置后的物料采用转速1500 r/min离心处理8min，收集上清液，备用。上清液液相图谱如图2所示。

所述的活性炭，为干燥的食品用活性炭，比表面积10-20m

（7）分子筛层析纯化

将（6）中上清液采用sephacryls-200分子筛凝胶过滤柱层析处理，收集层析纯化后的物料，即为芸豆凝集素。

所述的sephacryls-200分子筛凝胶过滤柱层析，具体操作为：pH 7.2缓冲溶液体系平衡凝胶色谱柱，不超过15%柱体积样品上样，继续采用pH 7.2缓冲溶液洗脱，流速0.8ml/min，收集第一个峰区域样品（第一个峰起点到终点之间样品），冷冻干燥，即为高纯度芸豆凝集素。

采用液相法检测发明方法制备的（6）中上清液，以sigma的芸豆凝集素样品；对比sigma的芸豆凝集素样品液相图谱与（6）中上清液液相图谱，可以发现，收集第一个峰值，可以得到高纯度芸豆凝集素。

分析液相方法为：凝胶色谱柱，采用的进口日本东曹的TSK G3000 SWXL （球蛋白分子量1W-50W Da），分析液相系统，流动相pH 7.2 20 mmol/l PBS缓冲溶液含0.05%叠氮化钠，流速0.8ml/min，上样量5-20μL，检测器紫外278nm。

实施例2：一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法

一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：将芸豆放入浸泡清洗设备中，在浸泡清洗设备中注入温度为15℃的纯化水，使纯化水淹没芸豆，处理30min；清洗过程中，进水口匀速进水，出水口匀速出水，进水流量为每小时100倍芸豆质量；同时，清洗过程中每间隔5min，启动超声波处理一次；

步骤2：将步骤1得到的芸豆沥去表面水分，采用真空表压-0.09 Mpa、温度35℃进行干燥处理30min；然后将干燥后的芸豆放入球磨机中，在氮气保护下研磨至物料细度低于60目，得到芸豆粉；

步骤3：将芸豆粉放入二氧化碳超临界萃取设备的萃取釜中，进行萃提除杂处理，收集萃提后留下的物质；

步骤4：将步骤3得到的萃提后留下的物质与中性pH缓冲溶液按质量比1:8混合；然后以60r/min对混合物料进行搅拌4h，接着对混合物料采用转速3000r/min离心处理5min，收集上清液，即为芸豆蛋白粗提液；

步骤5：向所述芸豆蛋白粗提液中加入酸液并不断搅拌，调节芸豆蛋白粗提液的pH值为3.4，然后静置沉淀30min；将静置后的溶液采用转速1000r/min离心处理5min，收集上清液；

步骤6：向步骤5得到的上清液中加入其质量0.75%的活性炭，搅拌90s后静置30min；将静置后的物料采用转速1000 r/min离心处理5min，收集上清液；

步骤7：对步骤6得到的上清液采用sephacryls-200分子筛凝胶过滤柱层析处理，收集层析纯化后的物料，即为芸豆凝集素。

优选的实施方式为：步骤1中，超声波频率为25KHz、功率密度为0.25W/cm

优选的实施方式为：所述萃提除杂处理包括采用2次连续的超临界萃取操作，第一次萃取的工艺参数为：萃取压力25Mpa、萃取温度36.7℃、萃取时间15min；第二次萃取的工艺参数为：萃取压力28Mpa、萃取温度44.7℃、萃取时间15min。

优选的实施方式为：所述中性pH缓冲溶液为Tris-Hcl缓冲溶液。

优选的实施方式为：所述中性pH缓冲溶液的离子强度为10 mM。

优选的实施方式为：所述酸液为醋酸。

优选的实施方式为：所述活性炭为干燥的食品用活性炭，比表面积10-20m

优选的实施方式为：采用sephacryls-200分子筛凝胶过滤柱层析处理的操作为：pH 7.2 PBS缓冲溶液体系平衡凝胶色谱柱，不超过15%柱体积样品上样，继续采用pH 7.2PBS缓冲溶液洗脱，流速0.8 ml/min，收集第一个峰区域样品，冷冻干燥后即为高纯度芸豆凝集素。

实施例3：一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法

一种高纯度芸豆凝集素的提取与精制方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：将芸豆放入浸泡清洗设备中，在浸泡清洗设备中注入温度为35℃的纯化水，使纯化水淹没芸豆，处理45min；清洗过程中，进水口匀速进水，出水口匀速出水，进水流量为每小时200倍芸豆质量；同时，清洗过程中每间隔7min，启动超声波处理一次；

步骤2：将步骤1得到的芸豆沥去表面水分，采用真空表压-0.10 Mpa、温度40℃进行干燥处理60min；然后将干燥后的芸豆放入球磨机中，在氮气保护下研磨至物料细度低于60目，得到芸豆粉；

步骤3：将芸豆粉放入二氧化碳超临界萃取设备的萃取釜中，进行萃提除杂处理，收集萃提后留下的物质；

步骤4：将步骤3得到的萃提后留下的物质与中性pH缓冲溶液按质量比1:12混合；然后以120r/min对混合物料进行搅拌6h，接着对混合物料采用转速4000 r/min离心处理10min，收集上清液，即为芸豆蛋白粗提液；

步骤5：向所述芸豆蛋白粗提液中加入酸液并不断搅拌，调节芸豆蛋白粗提液的pH值为3.8，然后静置沉淀45min；将静置后的溶液采用转速2000 r/min离心处理10min，收集上清液；

步骤6：向步骤5得到的上清液中加入其质量1.5%的活性炭，搅拌180s后静置45min；将静置后的物料采用转速2000 r/min离心处理10min，收集上清液；

步骤7：对步骤6得到的上清液采用sephacryls-200分子筛凝胶过滤柱层析处理，收集层析纯化后的物料，即为芸豆凝集素。

优选的实施方式为：步骤1中，超声波频率为35 KHz、功率密度为0.50W/cm

优选的实施方式为：所述萃提除杂处理包括采用2次连续的超临界萃取操作，第一次萃取的工艺参数为：萃取压力30Mpa、萃取温度37.3℃、萃取时间30min；第二次萃取的工艺参数为：萃取压力33Mpa、萃取温度45.3℃、萃取时间30min。

优选的实施方式为：所述中性pH缓冲溶液为pH 7.2 PBS缓冲溶液。

优选的实施方式为：所述中性pH缓冲溶液的离子强度为20 mM。

优选的实施方式为：所述酸液为磷酸。

优选的实施方式为：所述活性炭为干燥的食品用活性炭，比表面积10-20m

优选的实施方式为：采用sephacryls-200分子筛凝胶过滤柱层析处理的操作为：pH 7.2 PBS缓冲溶液体系平衡凝胶色谱柱，不超过15%柱体积样品上样，继续采用pH 7.2PBS缓冲溶液洗脱，流速0.8 ml/min，收集第一个峰区域样品，冷冻干燥后即为高纯度芸豆凝集素。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。