一种富含NMN毛豆肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然活性物质的提取技术领域，具体涉及一种富含NMN的毛豆肽及其制备方法和应用。

背景技术

毛豆(Glycine max)，属豆科(Leguminosa)，大豆属(Glycine)，也称采毛豆或青大豆；毛豆具养颜润肤、有效改善食欲不振与全身倦怠的功效；毛豆营养丰富均衡，含有有益的活性成分，经常食用，对女性保持苗条身材作用显著；对肥胖、高血脂、动脉粥样硬化、冠心病等疾病有预防和辅助治疗的作用。

烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD

有研究表明，毛豆中的NMN含量为天然食物中最高的，含量约为0.47～1.88mg/100g，以NMN为活性成分的功能性食品有着很大的开发潜力。然而毛豆中含有大量杂质，如何提高NMN的产率是目前要解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种富含NMN的毛豆肽及其制备方法和应用，所述毛豆肽不仅具备较高的抗氧化性而且含较高浓度的NMN，具有较高的应用价值。

本发明提供一种富含NMN的毛豆肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将脱皮鲜毛豆依次经破壁、匀浆和均质，得到匀浆液；

2)将所述匀浆液在22～30℃条件下搅拌1～2h，然后调节pH值至2～3，得到调酸后的匀浆液；

3)将所述调酸后的匀浆液在胃蛋白酶的作用下酶解，灭酶处理，得到酶解液；

4)将所述酶解液过30000Da陶瓷膜，然后过1KD有机膜，冷冻干燥，得到富含NMN的毛豆肽。

优选的，所述匀浆时，破壁后鲜毛豆的质量与水的体积比为1kg：1.8～2.2L。

优选的，所述匀浆液中颗粒的粒度为0.02mm～0.5mm。

优选的，所述匀浆液的温度为23～27℃；所述调酸后的匀浆液的pH值为2.2～2.7。

优选的，所述灭酶处理采用调节匀浆液的pH值进行；利用0.5M NaOH溶液调节pH值至7.0～7.4得到灭酶后的酶解液。

优选的，所述冷冻干燥进行梯度冷冻干燥，参数如下：

在-45℃冷冻4h，在-40℃冷冻2h，在-35℃冷冻2h，在-30℃冷冻2h，在-25℃冷冻2h，在-20℃冷冻6h，在-15℃冷冻4h，在-10℃冷冻2h，在-5℃冷冻2h，在0℃冷冻2h，在5℃冷冻2h，在15℃冷冻4h，在20℃冷冻4h，在25℃冷冻2h。

本发明提供了所述制备方法制备的富含NMN的毛豆肽，所述NMN占所述毛豆肽的总质量的1.5％～2.1％。

优选的，浓度10～60mg/mL的富含NMN的毛豆肽溶液对DPPH清除率为13.5％～61.2％。

本发明提供了所述富含NMN的毛豆肽在制备预防和/或治疗老年退行性疾病、2型糖尿病或脑出血的药物中的应用。

本发明提供的富含NMN的毛豆肽的制备方法，以新鲜毛豆为原料，经破壁、匀浆处理，得到颗粒粒径一致的匀浆液，再均质处理后，保证匀浆液质地细腻、不分层，同时提高匀浆液的稳定性；得到的匀浆液在22～30℃条件下搅拌，使NMN充分从细胞碎片中释放出来，通过特定的生物酶的酶解得到的毛豆肽，制备的毛豆肽不仅含有较高的抗氧化活性，而且NMN的含量较高，既保留了原有的营养物质，同时提高了NMN的含量，具有较高的应用价值。使用反向高效液相色谱仪对NMN的含量进行检测，实验结果表明，所述制备的毛豆肽中NMN的浓度达到1.5％～2.1％。浓度10～60mg/mL的富含NMN的毛豆肽水溶液对DPPH清除率为13.5％～61.2％，具有较高的抗氧化性。

附图说明

图1为NMN标准品的反向高效液相色谱检测结果；

图2为本发明制备的富含NMN的毛豆肽的反向高效液相色谱检测结果；

图3为不同浓度下毛豆肽α-葡萄糖苷酶的体外抑制曲线。

具体实施方式

本发明提供一种富含NMN的毛豆肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将脱皮鲜毛豆依次经破壁、匀浆和均质，得到匀浆液；

2)将所述匀浆液在22～30℃条件下搅拌1～2h，然后调节pH值至2～3，得到调酸后的匀浆液；

3)将所述调酸后的匀浆液在胃蛋白酶的作用下酶解，灭酶处理，得到酶解液；

4)将所述酶解液过30000Da陶瓷膜，然后过1KD有机膜，冷冻干燥，得到富含NMN的毛豆肽。

本发明将脱皮鲜毛豆依次经破壁、匀浆和均质，得到匀浆液。

本发明对所述鲜毛豆的脱皮方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的脱皮方法即可，例如人工脱皮或采用毛豆剥皮机脱皮均可。所述脱皮后，优选采用去离子水洗净毛豆。所述破壁优选采用粉碎机进行，所述破壁的时间优选为15min。所述匀浆时，破壁后鲜毛豆的质量与水的体积比优选为1kg：1.8～2.2L，更优选为1kg：2.0L。所述匀浆优选利用胶体磨进行，所述胶体磨的匀浆时间优选为30～35min，转速优选为5000～6000r/min。所述匀浆的目的使将经过粉碎机处理后的毛豆进一步破碎，保证匀浆液中的颗粒粒径一致。所述均质的压力优选为25兆帕。所述均质的时间优选为20～25min，更优选为23min。采用均质机进行处理，保证匀浆液质地细腻、不分层，提高匀浆液的稳定性。所述匀浆液中颗粒的粒度优选为0.02～0.05mm，更优选为0.03mm。

得到匀浆液后，本发明将所述匀浆液在22～30℃条件下搅拌1～2h，然后调节pH值至2～3，得到调酸后的匀浆液。

在本发明中，所述匀浆液的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。所述匀浆液在22～30℃条件下搅拌有利于充分释放溶出毛豆中NMN。搅拌时温度的高低直接影响NMN的提取效果，实验结果表明温度过低(例如低于20℃)影响NMN的溶出度，温度过高(例如超过40℃)容易造成NMN的降解。

在本发明中，所述调酸后的匀浆液的pH值优选为2.2～2.7，更优选为2.5。调节匀浆液的pH值的目的为后续酶解提供适宜的酶解pH值。

得到调酸后的匀浆液后，本发明将所述调酸后的匀浆液在胃蛋白酶的作用下酶解2～3h后，灭酶处理，得到酶解液。

在本发明中，所述胃蛋白酶的质量浓度优选为0.1％～0.2％，更优选为0.15％。本发明对所述胃蛋白酶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的胃蛋白酶即可，例如通过常规商品购买途径购买。所述酶解的时间优选为2.5h。所述酶解采用胃蛋白酶有利于得到得到抗氧化活性高的毛豆肽，不能采用其他种类的蛋白酶替代。

本发明对灭酶处理的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的灭酶方法即可。所述灭酶处理优选采用调节匀浆液的pH值进行。优选利用0.5M NaOH溶液调节pH值至7.0～7.4得到灭酶后的酶解液。

得到酶解液后，本发明将所述酶解液过30000Da陶瓷膜，然后过1KD有机膜，冷冻干燥，得到富含NMN的毛豆肽。

本发明将过30000Da陶瓷膜后收集的滤过酶解液进行有机膜过滤，收集小于1KD部分进行冷冻干燥。

在本发明中，所述冷冻干燥的参数优选如下：

。

本发明提供了所述制备方法制备的富含NMN的毛豆肽，所述NMN占所述毛豆肽的总质量的1.5～2.1％。在本发明中，浓度10～60mg/mL的富含NMN的毛豆肽溶液对DPPH清除率优选为13.5％～61.2％。

本发明提供了所述富含NMN的毛豆肽在制备预防和/或治疗老年退行性疾病、2型糖尿病或脑出血的药物中的应用。

在本发明中，所述药物中，所述富含NMN的毛豆肽的浓度优选为10～60mg/mL，更优选为45mg/mL。本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物剂型即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物的制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种富含NMN的毛豆肽及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

富含NMN的毛豆肽的制备方法

(1)前处理：将1000kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理，毛豆粒用无离子水清洗干净；利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎，然后加入2000L无离子水，利用胶体磨进行匀浆处理，再用高压均质机进行处理，保证匀浆液质地细腻、不分层，提高匀浆液的稳定性。

(2)将均质后的匀浆液在25℃条件下搅拌处理，保温1h。

(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.5，并保持25℃温度恒定。

(4)将步骤(3)的溶液加入0.1％的胃蛋白酶(1.0Kg)酶解2h，利用0.5MNaOH溶液调节pH值至7.2进行灭酶处理。

(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜，收集滤下物过1KD有机膜，收集小于1KD的多肽进行冷冻干燥，得到富含NMN的毛豆肽。

实施例2

(1)前处理：将2000kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理，毛豆粒用无离子水清洗干净；利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎，然后加入4000L无离子水，利用胶体磨进行匀浆处理，再用高压均质机进行处理，保证匀浆液质地细腻、不分层，提高匀浆液的稳定性。

(2)将均质后的匀浆液在30℃条件下搅拌处理，保温1.5h。

(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.8，并保持28℃温度恒定。

(4)将步骤(3)的溶液加入0.2％的胃蛋白酶(3Kg)酶解2h，利用0.5MNaOH溶液调节pH值至7.0进行灭酶处理。

(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜，收集滤下物过1KD有机膜，收集小于1KD的多肽进行冷冻干燥，得到富含NMN的毛豆肽。

实施例3

(1)前处理：将1500kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理，毛豆粒用无离子水清洗干净；利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎，然后加入3000L无离子水，利用胶体磨进行匀浆处理，再用高压均质机进行处理，保证匀浆液质地细腻、不分层，提高匀浆液的稳定性。

(2)将均质后的匀浆液在25℃条件下搅拌处理，保温1.5h。

(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.3，并保持25℃温度恒定。

(4)将步骤(3)的溶液加入0.15％的胃蛋白酶(2.25Kg)酶解1.5h，利用0.5M NaOH溶液调节pH值至7.5进行灭酶处理。

(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜，收集滤下物过1KD有机膜，收集小于1KD的多肽进行冷冻干燥，得到富含NMN的毛豆肽。

对比例1

富含NMN的毛豆肽的制备方法

(1)前处理：将1000kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理，毛豆粒用无离子水清洗干净；利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎，然后加入2000L无离子水，利用胶体磨进行匀浆处理，再用高压均质机进行处理，保证匀浆液质地细腻、不分层，提高匀浆液的稳定性。

(2)将均质后的匀浆液在40℃条件下搅拌处理，保温1h。

(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.5，并保持25℃温度恒定。

(4)将步骤(3)的溶液加入0.1％的胃蛋白酶(1.0Kg)酶解2h，利用0.5MNaOH溶液调节pH值至7.2进行灭酶处理。

(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜，收集滤下物过1KD有机膜，收集小于1KD的多肽冷冻干燥，得到含NMN的毛豆肽。

对比例2

富含NMN的毛豆肽的制备方法

(1)前处理：将1000kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理，毛豆粒用无离子水清洗干净；利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎，然后加入2000L无离子水，利用胶体磨进行匀浆处理，再用高压均质机进行处理，保证匀浆液质地细腻、不分层，提高匀浆液的稳定性。

(2)将均质后的匀浆液在25℃条件下搅拌处理，保温1h。

(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.5，并保持25℃温度恒定。

(4)将步骤(3)的溶液加入0.1％的酸性蛋白酶(1.0Kg)酶解2h，利用0.5MNaOH溶液调节pH值至7.2进行灭酶处理。

(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜，收集滤下物过1KD有机膜，收集小于1KD的多肽冷冻干燥，得到含NMN的多肽。

实施例4

将实施例1～3制备的富含NMN的毛豆肽对其基本理化性质进行测定，采用GB5009.9测定蛋白质含量，采用GB5009.3测定水分含量，采用GB5009.4测定灰分含量。测定结果见表1。

表1富含NMN的毛豆肽的基本理化性质

实施例5

NMA含量的检测

1)使用反向高效液相色谱仪对NMN的含量进行检测，使用C18填料的色谱柱，依据毛豆肽中不同成分化学性质的不同，对毛豆肽进行分析检测。在NMN的紫外吸收波长260nm条件下检测，对色谱图及其数据进行处理，通过外标法计算得到NMN的含量。

色谱柱:

HPLC流动相配制及分析方法

HPLC流动相的程序见表2。

表2 0～30min内HPLC流动相配比情况

其中A:含0.1％的三氟乙酸乙腈溶液；B:水；C：水；D：含0.1％三氟乙酸的水溶液。

检测波长:260nm；流速:0.5mL/min；检测时间:30min；进样体积:10μL。

2)标准品及样品的处理

称取NMN标准品1mg溶于1ml水，制成质量浓度为1mg/mL的肽标准品溶液，用孔径0.45μm有机膜过滤后进样，得到标准品的色谱图(见图1)。

准确称取毛豆肽样品100mg于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，超声10min，使样品充分溶解混匀，用孔径0.45μm有机膜过滤，得滤液并进行分析得到样品色谱图(见图2)。

毛豆肽中烟酰胺单核苷酸(NMN)含量的计算按照式I进行。

其中，X1是毛豆肽中NMN的含量％；

A1是样品中NMN的峰面积；

Ms是NMN标准品的质量，单位为克(g)；

Vs是NMN标准品的稀释体积，单位为毫升(ml)；

A2是NMN标准品的峰面积；

M称取毛豆肽样品的质量，单位为克(g)；

V样品的稀释体积，单位为毫升(ml)；

(计算结果保留小数点后两位有效数字)。

实施例1～3及对比例1～2的NMN得率检测结果如表3所示，其中NMN得率的计算公式II如下：

NMN得率(％)＝(毛豆肽/毛豆原料重量)*NMN含量 式II

表3 NMN得率检测结果

实施例1～3及对比例1～2制备的毛豆肽中NMN的含量结果见表4。

表4 NMN含量检测结果

实施例6

毛豆肽对DPPH自由清除能力的测定

实施例1制备的一定浓度的富含NMN的毛豆肽为研究对象，将2mL实施例1制备的一定浓度的富含NMN的毛豆肽溶液(10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL)和2mL的0.12mmol·L

A

A

A

DPPH清除率结果见表5。

表5不同浓度的毛豆肽溶液的DPPH清除率结果

实施例7

毛豆肽α-葡萄糖苷酶的体外抑制试验

实验原理：PNPG(对硝基苯酚葡萄糖苷)在α-葡萄糖苷酶作用下可水解释放出在碱性条件下显黄色的pNP，pNP在405nm处有最大吸收，通过测定405nm处的吸光度反应水解生成的pNP浓度来反应出不同抑制剂情况下α-葡萄糖苷酶的活性。

毛豆肽对-葡萄糖苷酶的抑制作用

A1为毛豆肽反应孔吸光度值(实施例1制备的富含NMN毛豆肽)；A2为药物对照孔吸光度值(阿卡波糖)；A3为空白反应孔吸光度值；A0为空白对照孔吸光度值。取10mL的试管若干，依次加入pH值6.8的磷酸缓冲液0.925mL、α-葡萄糖苷酶25μL，不同浓度样品溶液(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL)25μL和0.012mol/L的PNPG溶液25μL，混匀后37℃恒温反应30min后，立即加入0.1mol/L碳酸钠溶液4mL终止反应，在405nm处测定吸光度(OD)值，每组试验平行3次，以相同浓度的阿卡波糖为阳性对照；按下式IV计算毛豆肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中，A

结果见图3。由图3可知，以阿卡波糖作为阳性对照，本发明制备的毛豆肽在对α-葡萄糖苷酶的抑制率方面具有显著的优势，说明本发明制备的毛豆肽对α-葡萄糖苷酶具有较高的抑制作用。

由上述实施例可知，利用毛豆为原料通过生物酶解技术得到的毛豆肽，既具有毛豆肽的抗氧化活性，同时还提高了NMN的含量，具有较高的应用价值，为制备涉及NMN代谢的疾病治疗的药物及功能性食品或保健品提供材料基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。