一种富含NMN毛豆肽及其制备方法和应用
文献发布时间:2023-06-19 09:58:59
技术领域
本发明属于天然活性物质的提取技术领域,具体涉及一种富含NMN的毛豆肽及其制备方法和应用。
背景技术
毛豆(Glycine max),属豆科(Leguminosa),大豆属(Glycine),也称采毛豆或青大豆;毛豆具养颜润肤、有效改善食欲不振与全身倦怠的功效;毛豆营养丰富均衡,含有有益的活性成分,经常食用,对女性保持苗条身材作用显著;对肥胖、高血脂、动脉粥样硬化、冠心病等疾病有预防和辅助治疗的作用。
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,NMN)是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD
有研究表明,毛豆中的NMN含量为天然食物中最高的,含量约为0.47~1.88mg/100g,以NMN为活性成分的功能性食品有着很大的开发潜力。然而毛豆中含有大量杂质,如何提高NMN的产率是目前要解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种富含NMN的毛豆肽及其制备方法和应用,所述毛豆肽不仅具备较高的抗氧化性而且含较高浓度的NMN,具有较高的应用价值。
本发明提供一种富含NMN的毛豆肽的制备方法,包括以下步骤:
1)将脱皮鲜毛豆依次经破壁、匀浆和均质,得到匀浆液;
2)将所述匀浆液在22~30℃条件下搅拌1~2h,然后调节pH值至2~3,得到调酸后的匀浆液;
3)将所述调酸后的匀浆液在胃蛋白酶的作用下酶解,灭酶处理,得到酶解液;
4)将所述酶解液过30000Da陶瓷膜,然后过1KD有机膜,冷冻干燥,得到富含NMN的毛豆肽。
优选的,所述匀浆时,破壁后鲜毛豆的质量与水的体积比为1kg:1.8~2.2L。
优选的,所述匀浆液中颗粒的粒度为0.02mm~0.5mm。
优选的,所述匀浆液的温度为23~27℃;所述调酸后的匀浆液的pH值为2.2~2.7。
优选的,所述灭酶处理采用调节匀浆液的pH值进行;利用0.5M NaOH溶液调节pH值至7.0~7.4得到灭酶后的酶解液。
优选的,所述冷冻干燥进行梯度冷冻干燥,参数如下:
在-45℃冷冻4h,在-40℃冷冻2h,在-35℃冷冻2h,在-30℃冷冻2h,在-25℃冷冻2h,在-20℃冷冻6h,在-15℃冷冻4h,在-10℃冷冻2h,在-5℃冷冻2h,在0℃冷冻2h,在5℃冷冻2h,在15℃冷冻4h,在20℃冷冻4h,在25℃冷冻2h。
本发明提供了所述制备方法制备的富含NMN的毛豆肽,所述NMN占所述毛豆肽的总质量的1.5%~2.1%。
优选的,浓度10~60mg/mL的富含NMN的毛豆肽溶液对DPPH清除率为13.5%~61.2%。
本发明提供了所述富含NMN的毛豆肽在制备预防和/或治疗老年退行性疾病、2型糖尿病或脑出血的药物中的应用。
本发明提供的富含NMN的毛豆肽的制备方法,以新鲜毛豆为原料,经破壁、匀浆处理,得到颗粒粒径一致的匀浆液,再均质处理后,保证匀浆液质地细腻、不分层,同时提高匀浆液的稳定性;得到的匀浆液在22~30℃条件下搅拌,使NMN充分从细胞碎片中释放出来,通过特定的生物酶的酶解得到的毛豆肽,制备的毛豆肽不仅含有较高的抗氧化活性,而且NMN的含量较高,既保留了原有的营养物质,同时提高了NMN的含量,具有较高的应用价值。使用反向高效液相色谱仪对NMN的含量进行检测,实验结果表明,所述制备的毛豆肽中NMN的浓度达到1.5%~2.1%。浓度10~60mg/mL的富含NMN的毛豆肽水溶液对DPPH清除率为13.5%~61.2%,具有较高的抗氧化性。
附图说明
图1为NMN标准品的反向高效液相色谱检测结果;
图2为本发明制备的富含NMN的毛豆肽的反向高效液相色谱检测结果;
图3为不同浓度下毛豆肽α-葡萄糖苷酶的体外抑制曲线。
具体实施方式
本发明提供一种富含NMN的毛豆肽的制备方法,包括以下步骤:
1)将脱皮鲜毛豆依次经破壁、匀浆和均质,得到匀浆液;
2)将所述匀浆液在22~30℃条件下搅拌1~2h,然后调节pH值至2~3,得到调酸后的匀浆液;
3)将所述调酸后的匀浆液在胃蛋白酶的作用下酶解,灭酶处理,得到酶解液;
4)将所述酶解液过30000Da陶瓷膜,然后过1KD有机膜,冷冻干燥,得到富含NMN的毛豆肽。
本发明将脱皮鲜毛豆依次经破壁、匀浆和均质,得到匀浆液。
本发明对所述鲜毛豆的脱皮方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的脱皮方法即可,例如人工脱皮或采用毛豆剥皮机脱皮均可。所述脱皮后,优选采用去离子水洗净毛豆。所述破壁优选采用粉碎机进行,所述破壁的时间优选为15min。所述匀浆时,破壁后鲜毛豆的质量与水的体积比优选为1kg:1.8~2.2L,更优选为1kg:2.0L。所述匀浆优选利用胶体磨进行,所述胶体磨的匀浆时间优选为30~35min,转速优选为5000~6000r/min。所述匀浆的目的使将经过粉碎机处理后的毛豆进一步破碎,保证匀浆液中的颗粒粒径一致。所述均质的压力优选为25兆帕。所述均质的时间优选为20~25min,更优选为23min。采用均质机进行处理,保证匀浆液质地细腻、不分层,提高匀浆液的稳定性。所述匀浆液中颗粒的粒度优选为0.02~0.05mm,更优选为0.03mm。
得到匀浆液后,本发明将所述匀浆液在22~30℃条件下搅拌1~2h,然后调节pH值至2~3,得到调酸后的匀浆液。
在本发明中,所述匀浆液的温度优选为23~27℃,更优选为25℃。所述匀浆液在22~30℃条件下搅拌有利于充分释放溶出毛豆中NMN。搅拌时温度的高低直接影响NMN的提取效果,实验结果表明温度过低(例如低于20℃)影响NMN的溶出度,温度过高(例如超过40℃)容易造成NMN的降解。
在本发明中,所述调酸后的匀浆液的pH值优选为2.2~2.7,更优选为2.5。调节匀浆液的pH值的目的为后续酶解提供适宜的酶解pH值。
得到调酸后的匀浆液后,本发明将所述调酸后的匀浆液在胃蛋白酶的作用下酶解2~3h后,灭酶处理,得到酶解液。
在本发明中,所述胃蛋白酶的质量浓度优选为0.1%~0.2%,更优选为0.15%。本发明对所述胃蛋白酶的来源没有特殊限制,采用本领域所熟知的胃蛋白酶即可,例如通过常规商品购买途径购买。所述酶解的时间优选为2.5h。所述酶解采用胃蛋白酶有利于得到得到抗氧化活性高的毛豆肽,不能采用其他种类的蛋白酶替代。
本发明对灭酶处理的方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的灭酶方法即可。所述灭酶处理优选采用调节匀浆液的pH值进行。优选利用0.5M NaOH溶液调节pH值至7.0~7.4得到灭酶后的酶解液。
得到酶解液后,本发明将所述酶解液过30000Da陶瓷膜,然后过1KD有机膜,冷冻干燥,得到富含NMN的毛豆肽。
本发明将过30000Da陶瓷膜后收集的滤过酶解液进行有机膜过滤,收集小于1KD部分进行冷冻干燥。
在本发明中,所述冷冻干燥的参数优选如下:
。
本发明提供了所述制备方法制备的富含NMN的毛豆肽,所述NMN占所述毛豆肽的总质量的1.5~2.1%。在本发明中,浓度10~60mg/mL的富含NMN的毛豆肽溶液对DPPH清除率优选为13.5%~61.2%。
本发明提供了所述富含NMN的毛豆肽在制备预防和/或治疗老年退行性疾病、2型糖尿病或脑出血的药物中的应用。
在本发明中,所述药物中,所述富含NMN的毛豆肽的浓度优选为10~60mg/mL,更优选为45mg/mL。本发明对所述药物的剂型没有特殊限制,采用本领域所熟知的药物剂型即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的药物的制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种富含NMN的毛豆肽及其制备方法和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
富含NMN的毛豆肽的制备方法
(1)前处理:将1000kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理,毛豆粒用无离子水清洗干净;利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎,然后加入2000L无离子水,利用胶体磨进行匀浆处理,再用高压均质机进行处理,保证匀浆液质地细腻、不分层,提高匀浆液的稳定性。
(2)将均质后的匀浆液在25℃条件下搅拌处理,保温1h。
(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.5,并保持25℃温度恒定。
(4)将步骤(3)的溶液加入0.1%的胃蛋白酶(1.0Kg)酶解2h,利用0.5MNaOH溶液调节pH值至7.2进行灭酶处理。
(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜,收集滤下物过1KD有机膜,收集小于1KD的多肽进行冷冻干燥,得到富含NMN的毛豆肽。
实施例2
(1)前处理:将2000kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理,毛豆粒用无离子水清洗干净;利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎,然后加入4000L无离子水,利用胶体磨进行匀浆处理,再用高压均质机进行处理,保证匀浆液质地细腻、不分层,提高匀浆液的稳定性。
(2)将均质后的匀浆液在30℃条件下搅拌处理,保温1.5h。
(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.8,并保持28℃温度恒定。
(4)将步骤(3)的溶液加入0.2%的胃蛋白酶(3Kg)酶解2h,利用0.5MNaOH溶液调节pH值至7.0进行灭酶处理。
(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜,收集滤下物过1KD有机膜,收集小于1KD的多肽进行冷冻干燥,得到富含NMN的毛豆肽。
实施例3
(1)前处理:将1500kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理,毛豆粒用无离子水清洗干净;利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎,然后加入3000L无离子水,利用胶体磨进行匀浆处理,再用高压均质机进行处理,保证匀浆液质地细腻、不分层,提高匀浆液的稳定性。
(2)将均质后的匀浆液在25℃条件下搅拌处理,保温1.5h。
(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.3,并保持25℃温度恒定。
(4)将步骤(3)的溶液加入0.15%的胃蛋白酶(2.25Kg)酶解1.5h,利用0.5M NaOH溶液调节pH值至7.5进行灭酶处理。
(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜,收集滤下物过1KD有机膜,收集小于1KD的多肽进行冷冻干燥,得到富含NMN的毛豆肽。
对比例1
富含NMN的毛豆肽的制备方法
(1)前处理:将1000kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理,毛豆粒用无离子水清洗干净;利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎,然后加入2000L无离子水,利用胶体磨进行匀浆处理,再用高压均质机进行处理,保证匀浆液质地细腻、不分层,提高匀浆液的稳定性。
(2)将均质后的匀浆液在40℃条件下搅拌处理,保温1h。
(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.5,并保持25℃温度恒定。
(4)将步骤(3)的溶液加入0.1%的胃蛋白酶(1.0Kg)酶解2h,利用0.5MNaOH溶液调节pH值至7.2进行灭酶处理。
(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜,收集滤下物过1KD有机膜,收集小于1KD的多肽冷冻干燥,得到含NMN的毛豆肽。
对比例2
富含NMN的毛豆肽的制备方法
(1)前处理:将1000kg市售普通新鲜毛豆利用毛豆剥皮机进行脱皮处理,毛豆粒用无离子水清洗干净;利用粉碎机将毛豆粒破壁粉碎,然后加入2000L无离子水,利用胶体磨进行匀浆处理,再用高压均质机进行处理,保证匀浆液质地细腻、不分层,提高匀浆液的稳定性。
(2)将均质后的匀浆液在25℃条件下搅拌处理,保温1h。
(3)将步骤(2)的溶液用0.5M HCl溶液调pH值至2.5,并保持25℃温度恒定。
(4)将步骤(3)的溶液加入0.1%的酸性蛋白酶(1.0Kg)酶解2h,利用0.5MNaOH溶液调节pH值至7.2进行灭酶处理。
(5)将步骤(4)中的灭酶后的酶解液过30000Da陶瓷膜,收集滤下物过1KD有机膜,收集小于1KD的多肽冷冻干燥,得到含NMN的多肽。
实施例4
将实施例1~3制备的富含NMN的毛豆肽对其基本理化性质进行测定,采用GB5009.9测定蛋白质含量,采用GB5009.3测定水分含量,采用GB5009.4测定灰分含量。测定结果见表1。
表1富含NMN的毛豆肽的基本理化性质
实施例5
NMA含量的检测
1)使用反向高效液相色谱仪对NMN的含量进行检测,使用C18填料的色谱柱,依据毛豆肽中不同成分化学性质的不同,对毛豆肽进行分析检测。在NMN的紫外吸收波长260nm条件下检测,对色谱图及其数据进行处理,通过外标法计算得到NMN的含量。
色谱柱:
HPLC流动相配制及分析方法
HPLC流动相的程序见表2。
表2 0~30min内HPLC流动相配比情况
其中A:含0.1%的三氟乙酸乙腈溶液;B:水;C:水;D:含0.1%三氟乙酸的水溶液。
检测波长:260nm;流速:0.5mL/min;检测时间:30min;进样体积:10μL。
2)标准品及样品的处理
称取NMN标准品1mg溶于1ml水,制成质量浓度为1mg/mL的肽标准品溶液,用孔径0.45μm有机膜过滤后进样,得到标准品的色谱图(见图1)。
准确称取毛豆肽样品100mg于10mL容量瓶中,加水稀释至刻度,超声10min,使样品充分溶解混匀,用孔径0.45μm有机膜过滤,得滤液并进行分析得到样品色谱图(见图2)。
毛豆肽中烟酰胺单核苷酸(NMN)含量的计算按照式I进行。
其中,X1是毛豆肽中NMN的含量%;
A1是样品中NMN的峰面积;
Ms是NMN标准品的质量,单位为克(g);
Vs是NMN标准品的稀释体积,单位为毫升(ml);
A2是NMN标准品的峰面积;
M称取毛豆肽样品的质量,单位为克(g);
V样品的稀释体积,单位为毫升(ml);
(计算结果保留小数点后两位有效数字)。
实施例1~3及对比例1~2的NMN得率检测结果如表3所示,其中NMN得率的计算公式II如下:
NMN得率(%)=(毛豆肽/毛豆原料重量)*NMN含量 式II
表3 NMN得率检测结果
实施例1~3及对比例1~2制备的毛豆肽中NMN的含量结果见表4。
表4 NMN含量检测结果
实施例6
毛豆肽对DPPH自由清除能力的测定
实施例1制备的一定浓度的富含NMN的毛豆肽为研究对象,将2mL实施例1制备的一定浓度的富含NMN的毛豆肽溶液(10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL)和2mL的0.12mmol·L
A
A
A
DPPH清除率结果见表5。
表5不同浓度的毛豆肽溶液的DPPH清除率结果
实施例7
毛豆肽α-葡萄糖苷酶的体外抑制试验
实验原理:PNPG(对硝基苯酚葡萄糖苷)在α-葡萄糖苷酶作用下可水解释放出在碱性条件下显黄色的pNP,pNP在405nm处有最大吸收,通过测定405nm处的吸光度反应水解生成的pNP浓度来反应出不同抑制剂情况下α-葡萄糖苷酶的活性。
毛豆肽对-葡萄糖苷酶的抑制作用
A1为毛豆肽反应孔吸光度值(实施例1制备的富含NMN毛豆肽);A2为药物对照孔吸光度值(阿卡波糖);A3为空白反应孔吸光度值;A0为空白对照孔吸光度值。取10mL的试管若干,依次加入pH值6.8的磷酸缓冲液0.925mL、α-葡萄糖苷酶25μL,不同浓度样品溶液(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL)25μL和0.012mol/L的PNPG溶液25μL,混匀后37℃恒温反应30min后,立即加入0.1mol/L碳酸钠溶液4mL终止反应,在405nm处测定吸光度(OD)值,每组试验平行3次,以相同浓度的阿卡波糖为阳性对照;按下式IV计算毛豆肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
式中,A
结果见图3。由图3可知,以阿卡波糖作为阳性对照,本发明制备的毛豆肽在对α-葡萄糖苷酶的抑制率方面具有显著的优势,说明本发明制备的毛豆肽对α-葡萄糖苷酶具有较高的抑制作用。
由上述实施例可知,利用毛豆为原料通过生物酶解技术得到的毛豆肽,既具有毛豆肽的抗氧化活性,同时还提高了NMN的含量,具有较高的应用价值,为制备涉及NMN代谢的疾病治疗的药物及功能性食品或保健品提供材料基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
- 一种富含NMN毛豆肽及其制备方法和应用
- 一种富含苯丙氨酸抗菌肽及其制备方法和应用