一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物、制备及应用

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体为一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物、制备方法及其在皮肤损伤修复中的应用。

背景技术

皮肤作为人体的最大器官，具有屏障、保护、调节体温和感觉的功能。由于炎症、溃疡、烫伤、烧伤等因素造成的皮肤缺损，严重的可危及生命。受损皮肤只有经过炎性细胞的趋化、肉芽组织的形成、局部成纤维细胞的增殖、角质形成细胞的迁移等几个步骤，才能顺利完成损伤修复，目前临床常见的治疗皮肤损伤方法主要是皮肤移植，但也让患者形成新的损伤。

众所周知，间充质干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，在一定条件下能分化成多种成体细胞，在促进皮肤损伤修复、减轻炎症反应、促进血管再生等方面有重要作用，其可作为重要的“种子”组分参与受损皮肤的修复再生。随着人们对间充质干细胞的深入研究，发现间充质干细胞对皮肤的修复是通过外泌体发挥作用的。外泌体(Exosome)是间充质干细胞释放至胞外环境中的囊泡类小体，直径约为30-150纳米之间，其内含有大量不同种类的蛋白质、脂类、DNA和RNA等，其中以微小核糖核酸(miRNA)为主，可存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水以及其它生物体液中，可以将脂类、碳水化合物、蛋白质、mRNA、miRNA和DNA等生物分子从一个细胞传递到另一个细胞，从而交换遗传信息、重编程宿主细胞，进行细胞间通讯。相关研究认为，人脐带间充质干细胞分泌的外泌体介导WNT4信号通路，在小鼠体内，介导的Wnt/b-连环蛋白活性在上皮形成和细胞增殖过程中发挥重要作用，参与皮肤损伤修复，而当外泌体Wnt4被敲除后，b-连环蛋白活性也消失，在体内的皮肤修复疗效也明显下降。

因此如何避免损伤已有的完整健康的皮肤，利用外泌体，充分发挥其“种子”作用，使受损皮肤尽快修复愈合，是本领域技术人员的努力方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何避免损伤已有的完整健康的皮肤，又充分利用外泌体，发挥其“种子”作用，使受损皮肤尽快修复愈合。

为解决上述问题，本发明提供了一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物，并将其应用在皮肤损伤的修复中。

一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物，所述混合物包括脐带间充质干细胞外泌体、CGF和磷酸盐溶液，所述的脐带间充质干细胞外泌体、CGF和磷酸盐溶液的体积比为2:(0.5～1):(2～4)。

CGF(Concentrate Growth Fact，浓缩生长因子)中富含有大量的生长因子及白细胞等生物活性成分。其中，生长因子在促进组织新生、再生及血管化等多个方面发挥着重要作用，可作为皮肤修复重要的“肥料”组分；白细胞在抗炎、抗感染等方面作用显著，可作为皮肤修复重要的“防腐剂”组分。通过将脐带间充质干细胞外泌体作为“种子”组分、CGF同时作为“肥料”组分和“防腐剂”组分混合，以适当的方式导入受损皮肤组织中，共同作用于受损皮肤，对受损皮肤进行修复，通过CGF的“肥料”作用和“防腐剂”作用进一步充分发挥脐带间充质干细胞外泌体的“种子”作用，最终达到外泌体与CGF协同对受损皮肤的修复速度明显快于外泌体单独的修复速度的效果。

进一步地，所述混合物还包括透明质酸。透明质酸是一种生物相容性很好的生物材料，可在人体内降解成葡萄糖被直接吸收，其本身能够通过氢键与水分大量结合，进而调节渗透压、血管壁的通透性、蛋白质和水电解质的扩散及运转，同时，其还可以促进成纤维细胞的增殖，加速伤口愈合。将混合物中添加透明质酸，既能加速伤口愈合，也能发挥透明质酸的生物支架作用，使得混合物以凝胶的形式粘附在皮肤创面上，避免脐带间充质干细胞外泌体和CGF的磷酸盐混合溶液在皮肤创面上流动，造成脐带间充质干细胞外泌体和CGF的流失而不能充分发挥皮肤修复作用。

进一步地，所述的脐带间充质干细胞外泌体、CGF、磷酸盐溶液和透明质酸的体积比为2:(0.5～1):(2～4):1。

进一步地，所述脐带间充质干细胞外泌体的浓度为3μg/ml～8μg/ml。

进一步地，所述CGF的浓度为40ng/ml～120ng/ml。

进一步地，分泌所述脐带间充质干细胞外泌体的脐带间充质干细胞是通过采用含有脐静脉内皮细胞外泌体的培养基培养同源脐带间充质干细胞获得。外泌体携带特定miRNA，具有增强干细胞的生物学作用。因此通过在培养基中添加外泌体，促进脐带间充质干细胞的增殖及迁移，快速增加脐带间充质干细胞数量，保证生存活性，避免多代培养数量增加活性降低，为其分泌更多的外泌体提供前提条件。且通过采用含有脐静脉内皮细胞外泌体使得同源细胞间能够减小移植免疫排斥。

进一步地，所述脐带间充质干细胞是用miR-525-3p过表达腺病毒感染修饰的miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞。通过对脐带间充质干细胞修饰使其高表达miR-525-3p后提高外泌体活性，进而促进外泌体对皮肤的修复作用。

进一步地，所述脐带间充质干细胞外泌体是通过采用含有VCAM1试剂的培养基培养所述miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞获得。通过VCAM1试剂提高外泌体产量。

进一步地，所述混合物通过以下制备方法获得：

步骤(1)：将脐带剪切并分离，得到脐动脉、脐静脉和脐带胶质；

步骤(2)：将步骤(1)中得到的脐静脉，采用0.1％Ⅰ型胶原酶脐带静脉灌注消化法，分离得到脐静脉内皮细胞，取脐静脉内皮细胞的培养上清液，采用超速离心法，分离、提取得到脐静脉内皮细胞外泌体；

步骤(3)：将步骤(2)中得到的脐静脉内皮细胞外泌体，加入至DMEM-F12培养基中，得到含有脐静脉内皮细胞外泌体的DMEM-F12培养基；

步骤(4)：将步骤(1)中得到的脐带胶质剪碎成组织块，并加入至步骤(3)得到的含有脐静脉内皮细胞外泌体的DMEM-F12培养基中进行培养，得到第2代脐带间充质干细胞；

步骤(5)：用miR-525-3p过表达腺病毒感染步骤(4)得到的第2代脐带间充质干细胞得到miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞；

步骤(6)：将VCAM1试剂加入至DMEM-F12培养基中，得到含有VCAM1试剂的DMEM-F12培养基；

步骤(7)：将步骤(5)得到的miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞接种至步骤(6)得到的含有VCAM1试剂的DMEM-F12培养基中进行培养，取miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞的培养上清液，采用超速离心法，分离、提取得到脐带间充质干细胞外泌体；

步骤(8)：采集静脉血进行差速离心，自上而下分为血清层、CGF层、分离胶层、红细胞层，吸取CGF层的液体，得到CGF液体；

步骤(9)：将步骤(7)得到的脐带间充质干细胞外泌体与步骤(8)得到的CGF液体分别加入至磷酸盐溶液中，混合均匀后得到混合溶液；

步骤(10)：将透明质酸加入至步骤(9)得到的混合溶液中，混合均匀后得到混合物。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一种混合物，通过将脐带间充质干细胞外泌体作为“种子”组分、CGF同时作为“肥料”组分和“防腐剂”组分混合，以适当的方式导入受损皮肤组织中，共同作用于受损皮肤，对受损皮肤进行修复，通过CGF的“肥料”作用和“防腐剂”作用进一步充分发挥脐带间充质干细胞外泌体的“种子”作用，最终达到外泌体与CGF协同对受损皮肤的修复速度明显快于外泌体单独的修复速度的效果。

2、本发明提供一种混合物，通过将混合物中添加透明质酸，既能加速伤口愈合，也能发挥透明质酸的生物支架作用，使得混合物以凝胶的形式粘附在皮肤创面上，避免脐带间充质干细胞外泌体和CGF的磷酸盐混合溶液在皮肤创面上流动，造成脐带间充质干细胞外泌体和CGF的流失而不能充分发挥皮肤修复作用。

3、本发明提供一种混合物，在制备过程中，通过在培养基中添加脐静脉内皮细胞外泌体提高脐带间充质干细胞的产量及活性，为快速制备大量脐带间充质干细胞外泌体做准备；通过在培养基添加VCAM1试剂，以提高脐带间充质干细胞外泌体的产量；通过对脐带间充质干细胞修饰使其高表达miR-525-3p后提高外泌体活性，进而促进外泌体对皮肤的修复作用。

附图说明

图1为对比组1、对比组2与空白组的创面愈合率曲线图；

图2为空白组与实验组1的第0天、第5天、第14天和第21天的创面愈合图；

图3为实验组1～12和对比组1～2的创面愈合率曲线图；

图4为实验组1与实验组13的创面愈合率曲线图；

图5为实验组1与实验组14的创面愈合率曲线图；

图6为实验组1与实验组15的创面愈合率曲线图；

图7为实验组1与实验组16的创面愈合率曲线图。

具体实施方式

实施例1

本实施例中的应用于皮肤损伤修复中的一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物，通过以下制备方法获得：

步骤(1)：将脐带剪切并分离，得到脐动脉、脐静脉和脐带胶质；

步骤(2)：将步骤(1)中得到的脐静脉，采用0.1％Ⅰ型胶原酶脐带静脉灌注消化法，分离得到脐静脉内皮细胞，取脐静脉内皮细胞的培养上清液，采用超速离心法，分离、提取得到脐静脉内皮细胞外泌体；

步骤(3)：将步骤(2)中得到的脐静脉内皮细胞外泌体，加入至DMEM-F12培养基中，得到含有脐静脉内皮细胞外泌体的DMEM-F12培养基；

步骤(4)：将步骤(1)中得到的脐带胶质剪碎成组织块，并加入至步骤(3)得到的含有脐静脉内皮细胞外泌体的DMEM-F12培养基中进行培养，得到第2代脐带间充质干细胞；

步骤(5)：用miR-525-3p过表达腺病毒感染步骤(4)得到的第2代脐带间充质干细胞得到miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞；

步骤(6)：将VCAM1试剂加入至DMEM-F12培养基中，得到含有VCAM1试剂的DMEM-F12培养基；

步骤(7)：将步骤(5)得到的miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞接种至步骤(6)得到的含有VCAM1试剂的DMEM-F12培养基中进行培养，取miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞的培养上清液，采用超速离心法，分离、提取得到脐带间充质干细胞外泌体；

步骤(8)：采集静脉血进行差速离心，自上而下分为血清层、CGF层、分离胶层、红细胞层，吸取CGF层的液体，得到CGF液体；

步骤(9)：将步骤(7)得到的脐带间充质干细胞外泌体与步骤(8)得到的CGF液体分别加入至磷酸盐溶液中，混合均匀后得到混合溶液；

步骤(10)：将透明质酸加入至步骤(9)得到的混合溶液中，混合均匀后得到混合物。

本实施例中的混合物为包括脐带间充质干细胞外泌体、CGF、磷酸盐和透明质酸的凝胶。

其中，本实施例中的脐带间充质干细胞外泌体、CGF、磷酸盐溶液和透明质酸的体积比为2:0.7:3.5:1。

其中，本实施例中的脐带间充质干细胞外泌体的浓度为4μg/ml。

其中，本实施例中的CGF的浓度为85ng/ml。

实施例2～实施例12

本实施例中的应用于皮肤损伤修复中的一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物，与实施例1的区别在于如下：

其中，脐带间充质干细胞外泌体(Exo)、CGF、磷酸盐(PBS)溶液和透明质酸(HA)的体积比，脐带间充质干细胞外泌体的浓度，CGF的浓度各不同，各实施例混合物组分配比详见表1。

实施例13

本实施例中的应用于皮肤损伤修复中的一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物，其制备方法与实施例1的区别在于，省略相关使得培养基中含有脐静脉内皮细胞外泌体(HUVECs-Exo)的制备步骤，将步骤(1)中得到的脐带胶质剪碎成组织块，直接加入至DMEM-F12培养基中进行培养，得到第2代脐带间充质干细胞。其余设置与实施例1相同。

实施例14

本实施例中的应用于皮肤损伤修复中的一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物，其制备方法与实施例1的区别在于，省略相关miR-525-3p过表达腺病毒感染第2代脐带间充质干细胞的修饰制备步骤，不用miR-525-3p过表达腺病毒感染第2代脐带间充质干细胞，将第2代脐带间充质干细胞直接接种至含有VCAM1试剂的DMEM-F12培养基中进行培养，取培养上清液，采用超速离心法，分离、提取得到脐带间充质干细胞外泌体。其余设置均与实施例1相同。

实施例15

本实施例中的应用于皮肤损伤修复中的一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物，其制备方法与实施例1的区别在于，省略相关使得培养基中含有VCAM1试剂的制备步骤，将miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞直接接种至DMEM-F12培养基中进行培养，取培养上清液，采用超速离心法，分离、提取得到脐带间充质干细胞外泌体。其余设置与实施例1相同。

实施例16

本实施例中的应用于皮肤损伤修复中的一种CGF和脐带间充质干细胞外泌体混合物，其制备方法与实施例1的区别在于，省略相关混合透明质酸的制备步骤，也就是混合物中不含有透明质酸。其余设置均与实施例1相同。

本实施例中的混合物为包括脐带间充质干细胞外泌体、CGF和磷酸盐溶液的混合溶液。

对比例1

仅使用含有脐带间充质干细胞外泌体的磷酸盐溶液修复皮肤损伤。

对比例2

仅使用含有CGF的磷酸盐溶液修复皮肤损伤。

实施例13～实施例16、对比例1、对比例2的混合物制备相关步骤有无或组分有无详见表2。

修复实验

将实施例1～实施例16获得的混合物及对比例1、对比例2中的混合物用于裸鼠皮肤损伤的修复。

(1)建立裸鼠创面模型：裸鼠全麻后，剪除裸鼠背部全层皮肤及筋膜，暴露出肌层，制出直径1cm圆形皮肤缺损。创面周围用硅胶垫缝合固定。无菌防水辅料覆盖创面。

(2)混合物干预修复：

将创面裸鼠随机分为19组，每组3只。每天定时定量使用医用酒精消毒创面裸鼠背部，然后在创面均匀涂抹混合物100μL，再使用无菌防水敷料贴于创面，一天一次。

第1组涂抹实施例1获得的混合物，第2组涂抹实施例2获得的混合物，依次类推设置至第16组，上述16组依次为实验组1、实验组2...实验组16。第17组涂抹对比例1中的混合物，为对比组1，第18组涂抹对比例2中的混合物，为对比组2，第19组涂抹生理盐水，为空白组。

(3)修复结果观察：

对实验组、对比组和空白组每只裸鼠的创面面积进行计算，并跟进计算分析各组用药后的第5、14、21天平均创面残余面积，绘制愈合曲线。对比组1～2与空白组的创面愈合率曲线如图1所示，实验组1某裸鼠与空白组某裸鼠的第0天、第5天、第14天和第21天的创面愈合情况如图2所示，实验组1～12和对比组1～2的创面愈合率曲线如图3所示，实验组13与实验组1的创面愈合率曲线如图4所示，实验组14与实验组1的创面愈合率曲线如图5所示，实验组15与实验组1的创面愈合率曲线如图6所示，实验组16与实验组1的创面愈合率曲线如图7所示，各组均有统计学差异(P<0.05)。

实验组1～12的混合物组分及修复结果见下表1：

表1实验组1～12混合物组分及修复结果数据汇总表

实验组1、13～16、对比组1～2和空白组的混合物组分或制备参数及修复结果见下表2：

表2实验组1、13～16、对比组1～2和空白组混合物组分或制备参数及修复结果数据汇总表

注：表2中+表示有相关制备步骤或组分，-表示没有相关制备步骤或组分。

(4)结果分析：

如图1、表2所示，通过对比组1～2与空白组的对比分析，可发现，当对裸鼠的创面进行修复时，单独使用Exo或单独使用CGF修复创面的愈合速度要快于裸鼠创面自动愈合的速度，且单独使用Exo修复创面的愈合速度要快于单独使用CGF修复创面的愈合速度，由此可见，Exo和CGF均能在裸鼠创面修复中发挥促进愈合的作用，且Exo作用大于CGF作用。

实验组1某裸鼠与空白组某裸鼠的第0天、第5天、第14天和第21天的创面愈合情况如图2所示，实验组1某裸鼠第0天、第5天、第14天和第21天的创面愈合情况均好于空白组某裸鼠的，由此可见，Exo和CGF混合使用作用于裸鼠的创面，能够修复裸鼠创面，加快创面的愈合。

如图3、表1、表2所示，通过实验组1～12与对比组1～2的对比分析，可发现，当对裸鼠的创面进行修复时，Exo和CGF混合使用修复裸鼠的创面，其愈合速度远快于单独使用Exo或单独使用CGF修复创面的愈合速度。因此，Exo可作为皮肤修复的“种子”组分，CGF同时作为皮肤修复的“肥料”组分和“防腐剂”组分，共同作用于受损皮肤，对其进行修复，通过发挥CGF的“肥料”作用和“防腐剂”作用进一步充分发挥脐带间充质干细胞外泌体的“种子”作用，加快皮肤愈合。且在表1中，通过实验组1～12之间的对比分析，可知Exo和CGF配比有最优值，当配比最优时，创面愈合最快，皮肤修复效果最好。

如图4、表2所示，通过实验组13与实验组1的对比分析，可发现当在培养脐带间充质干细胞时，不使用含有同源HUVECs-Exo的培养基培养，其最终获得的混合物作用于裸鼠创面后，裸鼠创面的愈合速度不如使用含有同源HUVECs-Exo的培养基培养并最终获得的混合物作用于裸鼠创面后裸鼠创面的愈合速度，这可能是因为使用同源HUVECs-Exo的培养基培养脐带间充质干细胞获得的脐带间充质干细胞产量高、活性好，为后续Exo的产量打下了基础。

如图5、表2所示，通过实验组14与实验组1的对比分析，可发现，在获得Exo之前，不使用miR-525-3p过表达腺病毒感染修饰脐带间充质干细胞，其最终获得的混合物作用于裸鼠创面后，裸鼠创面的愈合速度不如使用miR-525-3p过表达腺病毒感染修饰脐带间充质干细胞并最终获得的混合物作用于裸鼠创面后裸鼠创面的愈合速度，这可能是因为使用miR-525-3p过表达腺病毒感染修饰脐带间充质干细胞后，其产生的Exo活性高，促进了成纤维细胞的增殖，进而加快了愈合速度。

如图6、表2所示，通过实验组15与实验组1的对比分析，可发现当培养miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞时，不使用含有VCAM1试剂的培养基培养，其最终获得的混合物作用于裸鼠创面后，裸鼠创面的愈合速度不如使用含有VCAM1试剂的培养基培养并最终获得的混合物作用于裸鼠创面后裸鼠创面的愈合速度，这可能是因为使用含有VCAM1试剂的培养基培养miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞后，其Exo产量高，进而加快了愈合速度。

如图7、表2所示，通过实验组16与实验组1的对比分析，可发现混合物中不含有透明质酸时，其作用于裸鼠创面后，裸鼠创面的愈合速度不如含有透明质酸的混合物作用于裸鼠创面后裸鼠创面的愈合速度，这可能是因为混合物中含有透明质酸后混合物以凝胶的形式粘附在皮肤创面上，使得Exo和CGF充分发挥皮肤修复作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。