同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡及方法

技术领域

本发明公开了一种禽蛋检测方法，具体地说，本发明公开了一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡以及方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

氟苯尼考是一种新型氯霉素类广谱抗生素，在安全性和有效性上优势明显，在畜禽养殖业中大量使用。甲氧苄啶全称三甲氧苄氨嘧啶甲氧苄啶，属于广谱抗菌增效剂，本身杀菌能力不强，但与磺胺类药物和一些抗生素联合使用具有显著的增效作用，在畜禽养殖业中使用广泛。

但是，氟苯尼考和甲氧苄啶的大量使用，在畜禽产品中有较高的检出率，严重威胁对公众健康，因此食品安全国家标准对这两种抗生素制定了严格的检测限，蛋鸡产蛋期禁用。

目前，现有技术中氟苯尼考、甲氧苄啶的检测有色谱法、酶联法、免疫层析法等，这些方法有的严重依赖高端设备，有的对待测样品要求高，前处理复杂，或只能检测其中的一种，严重降低了工作效率。

发明内容

针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种检测灵敏度高，操作简单省时，无需吹干，灵敏度高，适用于现场即时检测，并且能够同步检测禽蛋中氟苯尼考和甲氧苄啶含量的免疫荧光层检测卡。

本发明的另一个目的是提供一种同步检测禽蛋中氟苯尼考和甲氧苄啶含量的方法，该方法操作简单，能有效消除干扰项，提高检测的灵敏度，适用任何场所的禽蛋检测。

为了达到上述目的，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，包括底板，所述的底板上从左至右依次衔接有吸水纸垫、反应膜、结合垫、样品垫，所述的反应膜上划有氟苯尼考检测线T1、甲氧苄啶检测线T2和质控C线三条线，所述的结合垫上包被有氟苯尼考检测微球、甲氧苄啶检测微球、羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球；

所述的氟苯尼考检测微球是通过连结有聚乙二醇长链加长臂（-dPEG24-）的长链生物素化氟苯尼考单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球经生物素与链霉亲和素结合制成的；

所述的甲氧苄啶检测微球是通过连结有聚乙二醇长链加长臂（-dPEG24-）的长链生物素化甲氧苄啶单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球经生物素与链霉亲和素结合制成的。

进一步的，上述的一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，所述的反应膜通过下述步骤制得的：

（1）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到0.1mg/mL，作为质控C线工作液；

（2）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将氟苯尼考偶联抗原稀释到0.2mg/mL，作为氟苯尼考检测线工作液；

（3）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将甲氧苄啶偶联抗原稀释到0.2mg/mL，作为甲氧苄啶检测线工作液；

（4）用喷金划膜仪器在硝酸纤维膜上划氟苯尼考检测线T1、甲氧苄啶检测线T2和质控C线三条线，相邻两线间距5mm，划线浓度均为1μl/cm；划完后置在45℃干燥箱中干燥48小时。

进一步的，上述的一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，所述的样品垫通过下述步骤制得的：

（1）配备含1%酪蛋白、0.15M NaCl、1% PEG 8000和1.5%Triton X-100的pH7.4 的0.02M的磷酸盐缓冲液作为处理液；

（2）将步骤（1）制备的处理液以浓度50μl/cm

进一步的，上述的一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，所述的结合垫通过下述步骤制备的：将氟苯尼考检测微球、甲氧苄啶检测微球、羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球混合，均匀喷至1.2cm宽的玻璃纤维膜8964垫上，45℃，烘干。

进一步的，上述的一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，所述的羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球通过下述方法制得的：：

（1）取1mL 0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；在上述离心管中加入4μlNHS（25mg/ml）和4μlEDC（25mg/ml），涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（2）将活化后的荧光微球离心分离，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl 0.02MpH8.0硼酸盐缓冲液，超声2s，间歇5s，重复5次打散微球；

（3）加入100μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

（4）每管加入100μl 10%酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；再次离心分离，吸去上清液，保留沉淀，再加入1mL微球保存液，充分混匀，备用。

进一步的，上述的一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，所述的氟苯尼考检测微球和甲氧苄啶检测微球制备过程分为三个步骤：

第一步：长链生物素化氟苯尼考单克隆抗体、长链生物素化甲氧苄啶单克隆抗体的制备方法为：

（1）取出长链生物素（NHS-dPEG24-Biotin），室温平衡30min，用DMSO溶解至终浓度10mM备用；

（2）分别取1ml氟苯尼考单克隆抗体（2mg/ml）和1ml甲氧苄啶单克隆抗体（2mg/ml）至2ml离心管中，每管加入27μl上一步配制的生物素NHS-dPEG24-Biotin，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（3）反应完成后转移至超滤管中，12000g，离心15min，弃废液；

（4）向超滤管中加入2mlPBS缓冲液，12000g，离心15ml，弃废液；

（5）重复步骤（4）5次，200μlPBS复溶，收集标记抗体，BCA试剂盒测浓度。

第二步：链霉亲和素荧光微球的制备方法为：

（1）取1mL标记缓冲液0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；再加入4μl NHS（25mg/ml）和4μl的EDC（25mg/ml），涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（2）将活化后的荧光微球离心分离，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl硼酸盐缓冲液，超声2s，间歇5s，重复5次打散微球；

（3）取100μg链霉亲和素加入到活化好的微球中，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

（4）每管加入100μl 10%酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min后，离心分离，吸去上清液，留取沉淀；

（5）向上述沉淀加入1mL微球保存液，充分混匀，离心分离，吸去上清液，留取沉淀；

（6）重复步骤（5）2-3次，充分去除未反应的链霉亲和素；再加入1mL微球保存液，充分混匀，备用。

第三步：氟苯尼考检测微球和甲氧苄啶检测微球的制备过程：

（1）分别取长链生物素化氟苯尼考单克隆抗体和长链生物素化甲氧苄啶单克隆抗体各5μg加入2管均含1ml链霉亲和素荧光微球中，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（2）完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

（3）加入1mL微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

（4）重复步骤（3）3次，充分去除未反应的生物素标记抗体；

（5）加入1mL微球保存液，充分混匀，备用。

本发明提供的第二个技术方案是这样的：

一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的方法，包括下述步骤：

一）将样品进行前处理得到待测液；

二）将待测液加入到权利要求1所述的检测卡中，水平静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪中读取结果；

三）将结果带入到标曲中，即可计算出样品中氟苯尼考、甲氧苄啶的含量。

其中，步骤一）中所述的前处理的方法为：

（1）取充分均质的禽蛋待测液，加入提取液后手动震荡混匀进行萃取，离心后取上清液；

（2）在上清液中加入正己烷、复溶液震荡，静置分层，下层水相即为待测液；

上述的同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的方法，所述提取液为含0.5-1.5wt%三氯乙酸的乙酸乙酯。

上述的同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的方法，所述复溶液为含有0.15MNaCl，0.05M PB的PBS缓冲液，pH6.6。

上述的同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的方法，所述上清液、正己烷、复溶液的体积比为：1:5:0.5-1。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

1、本发明提供的技术方案是将长链生物素化单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球通过生物素与链霉亲和素亲和作用制备标记微球，所述的长链生物素（NHS-dPEG24-Biotin）连结有聚乙二醇长链加长臂（-dPEG24-），加长臂另一端连接有用于偶联标记单克隆抗体的NHS，能够有效降低空间位阻效应，提高标记效率，生物素链霉亲和素系统具有信号放大作用，可以进一步提高检测的灵敏度。

2、本发明提供的技术通过液液萃取的方法提取后可直接上样用于检测，前处理操作简单，无需吹干和过柱等过程，可同步检测氟苯尼考和甲氧苄啶的含量，应用范围广。

3、本发明提供的技术可同步检测氟苯尼考和甲氧苄啶的含量。

附图说明

图1是本申请提供的检测卡结构及检测原理示意图；

图2是本申请提供的长链生物素化单克隆抗体原理示意图；

图3是链霉亲和素荧光微球制备过程示意图；

图4是检测微球制备过程示意图

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的限制，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做出的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

本实施例提供的同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，包括底板，底板上从左至右依次衔接有吸水纸垫、反应膜、结合垫、样品垫，所述的反应膜上划有氟苯尼考检测线T1、甲氧苄啶检测线T2和质控C线三条线，所述的结合垫上包被有氟苯尼考检测微球、甲氧苄啶检测微球、羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球；

氟苯尼考检测微球是通过连结有聚乙二醇长链加长臂（-dPEG24-）的长链生物素化氟苯尼考单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球经生物素与链霉亲和素结合制成的；

甲氧苄啶检测微球是通过连结有聚乙二醇长链加长臂（-dPEG24-）的长链生物素化甲氧苄啶单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球经生物素与链霉亲和素结合制成的。

其中：

反应膜通过下述方法制得的：

（1）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到0.1mg/mL，作为质控C线工作液；

（2）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将氟苯尼考偶联抗原稀释到0.2mg/mL，作为氟苯尼考检测线工作液；

（3）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将甲氧苄啶偶联抗原稀释到0.2mg/mL，作为甲氧苄啶检测线工作液；

（4）用喷金划膜仪器在硝酸纤维膜上划氟苯尼考检测线、甲氧苄啶检测线和质控C线三条线，相邻两线间距5mm，划线浓度均为1μl/cm；划完后置在45℃干燥箱中干燥48小时。

样品垫的制备方法为：

（1）配备含1%酪蛋白、0.15M NaCl、1% PEG 8000和1.5%Triton X-100的pH7.4 的0.02M的磷酸盐缓冲液作为处理液；

（2）将步骤（1）制备的处理液以浓度50μl/cm

羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球通过下述步骤制得的：

（1）取1mL 0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；在上述离心管中加入4μl NHS（25mg/ml）和4μl的EDC（25mg/ml），涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（3）将活化后的荧光微球离心分离，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl 0.02MpH8.0硼酸盐缓冲液，超声2s，间歇5s，重复5次打散微球；

（4）加入100μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

（5）每管加入100μl 10%酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；再次离心分离，吸去上清液，保留沉淀，再加入1mL微球保存液，充分混匀，备用；

长链生物素化氟苯尼考单克隆抗体、长链生物素化甲氧苄啶单克隆抗体的方法如下：

（1）取出长链的生物素（NHS-dPEG24-Biotin），室温平衡30min，用DMSO溶解至终浓度10mM备用；

（2）分别取1ml浓度2mg/ml氟苯尼考单克隆抗体和1ml浓度2mg/ml甲氧苄啶单克隆抗体至2ml离心管中，每管加入27μl上一步配制长链的生物素，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（3）反应完成后转移至超滤管中，12000g，离心15min，弃废液；

（4）向超滤管中加入2mlPBS缓冲液，12000g，离心15ml，弃废液；

（5）重复步骤（4）5次，200μlPBS复溶，收集标记抗体，BCA试剂盒测浓度。

链霉亲和素荧光微球的方法为：

（1）取1mL标记缓冲液0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；再加入4μl NHS（25mg/ml）和4μl的EDC（25mg/ml），涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（2）将活化后的荧光微球离心分离，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl硼酸盐缓冲液，超声2s，间歇5s，重复5次打散微球；

（3）取100μg链霉亲和素加入到活化好的微球中，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

（4）每管加入100μl 10%酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min后，离心分离，吸去上清液，留取沉淀；

（5）向上述沉淀加入1mL微球保存液，充分混匀，离心分离，吸去上清液，留取沉淀；

（6）重复步骤（5）2-3次，充分去除未反应的链霉亲和素；再加入1mL微球保存液，充分混匀，备用。

氟苯尼考检测微球和甲氧苄啶检测微球的制备过程如下

（1）取长链生物素化抗体5μg加入到1ml链霉亲和素荧光微球中，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（2）完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

（3）加入1mL微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

（4）重复步骤（3）3次，充分去除未反应的生物素标记抗体；

（5）向上述沉淀加入1mL微球保存液，充分混匀，备用；

结合垫通过下述步骤制备的：将氟苯尼考检测微球、甲氧苄啶检测微球、羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球混合，使微球的终浓度分别为0.2mg/ml、0.1mg/ml和0.01mg/ml，超声波清洗仪中超声2min，按4μl/cm、20KPa喷至1.2cm宽的玻璃纤维膜8964垫上，45℃，烘干。

试纸条的制备

按照上述方法制备样品垫、结合垫、反应膜后，在硝酸纤维素膜的一边紧压硝酸纤维素膜边缘约1-2mm粘贴吸水纸垫，在硝酸纤维素膜的另一边紧压硝酸纤维素膜边缘约1-2mm粘贴结合垫，在结合垫的另一边紧压结合垫边缘约1-2mm粘贴样品垫。然后切成宽度为3.95mm的试纸条，装入检测卡下盖的试纸条槽内，盖上检测卡上盖就是一条完整的检测卡。

实施例2

本实施例提供一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的检测方法，具体包括下述步骤：

（1）先对样品进行前处理，其具体步骤为：取2g经高效液相色谱检测不含氟苯尼考和甲氧苄啶的均质禽蛋作为阴性对照品，每管加入3ml乙酸乙酯（含1wt%三氯乙酸），手动震荡30s，4000rpm，离心1min。取1ml上清液至15ml离心管中，加入5ml正己烷、0.5ml复溶液，静置分层后下层水相为待测液；

（2）将前处理提取的待测液加入到检测卡的样品孔中，水平静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪中读取结果。将结果带入到实施例3中所做的标曲中，即可计算出样品中氟苯尼考和甲氧苄啶的含量。

实施例3

检测标曲的制备

系列标准品配制：取16μl氟苯尼考标准品（10mg/kg）和16μl甲氧苄啶标准品（10mg/kg）加入到968μl甲醇溶液中，混匀得混合标准品1（氟苯尼考为160μg/kg、甲氧苄啶为160μg/kg），然后倍比稀释5次得混合标准品2、混合标准品3、混合标准品4、混合标准品5、混合标准品6；取7个15ml离心管，每管加入2ml不含氟苯尼考和甲氧苄啶的空白样本，取50μl混合标准品1-6加入其中6管，第7管加入50μl甲醇，混匀。

氟苯尼考浓度梯度为：4μg/kg、2μg/kg、1μg/kg、0.5μg/kg、0.25μg/kg、0.125μg/kg、0μg/kg；

甲氧苄啶浓度梯度为：4μg/kg、2μg/kg、1μg/kg、0.5μg/kg、0.25μg/kg、0.125μg/kg、0μg/kg；

每管加入3ml提取液，手动震荡30s，4000rpm，离心2min，取1ml上清液加入到15ml离心管中，再加入5ml正己烷，0.5ml复溶液，手动震荡10s，静置分层。取100μl下层水相加入到检测卡中，静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪读数，得到检测线与质控C线的比值（T/C）。以浓度梯度为横坐标，以对应的T/C值为纵坐标，绘制工作曲线：

氟苯尼考检测的标准曲线为：

y=3.95762/(1+(x/0.11053)^0.93504)+0.16273 R2=0.99994

线性范围：0.1-4μg/kg

甲氧苄啶检测的标准曲线为：y=-1.23982-2.17326*x R2=0.99728

线性范围：0.2-4μg/kg

实施例4

最低检出限：

取阴性样本，做10个重复，计算T/C均值和标准偏差（SD），然后用平均值减去2*SD，所得值代入剂量-反应曲线中，得出本方法氟苯尼考的灵敏度为0.05μg/kg；甲氧苄啶的灵敏度为0.1μg/kg。

相对标准偏差：

将标准品加入到阴性样本中至氟苯尼考终浓度为0.2μg/kg、0.4μg/kg、1.6μg/kg；甲氧苄啶终浓度为0.25μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg。每浓度重复测试10次，计算测试浓度的变异系数（CV）。结果如表1，由此可以看出，本检测的变异系数均小于15% ，本检测方法具有较高的精密度满足常规快速检测。

表1 氟苯尼考、甲氧苄啶的在不同浓度下的相对标准偏差

加标回收率：

将标准品加入到阴性样本中至氟苯尼考终浓度为0.2μg/kg、0.4μg/kg、1.6μg/kg；甲氧苄啶终浓度为0.25μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg。每浓度重复测试10次，计算测试浓度，除以加标浓度后得回收率。结果如表2，由此可以看出，因此本检测方法具有较高的准确度。

表2 氟苯尼考、甲氧苄啶的加标回收率

为了证明验证本申请提供的技术方案，下面给出本申请提供的技术的应用例。

应用例1

不同种类样本的检测

取鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋5种加标样本，氟苯尼考的加标终浓度均为0.2μg/kg，甲氧苄啶的加标终浓度均为0.25μg/kg。每种样本取10管，2ml/管，每管加入3ml提取液，手动震荡30s，4000rpm，离心2min，取1ml上清液加入到15ml离心管中，再加入5ml正己烷，0.5ml复溶液，手动震荡10s，静置分层。取100μl下层水相加入到检测卡中，静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪读数，得到两个检测线与质控C线的比值（T/C），T/C值代入标曲得反馈浓度，进而计算出加标回收率和重复性。结果如表3。

表3 不同样本氟苯尼考、甲氧苄啶的加标回收率和重复性实验结果

上表各种样本或因基质差异，回收率有所不同，整体回收率和重复性能够满足现场快速检测要求。