一种促进作物根系发育的微生物菌剂及其制备与应用

技术领域

本发明涉及微生物菌剂技术领域，特别是涉及一种促进作物根系发育的微生物菌剂及其制备与应用。

背景技术

氮是所有活生物体必不可少的元素，也是关键细胞成分(如蛋白质和核酸)生物合成所必需的。由于真核生物没有能力固定其自身所需要的氮，因此其在土壤中氮的生物利用率是植物生长的主要限制因素，农民通常使用氮肥来确保作物的生产力。但超过50％的合成氮肥不仅没有被农作物吸收，而流失到环境中，从而导致富营养化、温室气体和酸雨的产生。然而，在田间或农作物中接种微生物可以减轻氮污染带来的影响，因为这些微生物会将氮固定在植物根部或植物根部附近土壤中。根通过吸收水分和养分将植物锚固在土壤中并支持植物的营养生长。根的结构受到环境因素的极大影响，其中包括有益微生物，这些微生物可以促进植物生长并提高植物对逆境的耐受性，增加植物在恶劣环境下的存活率，如喀斯特石漠化地区。

因此，开发一种能固氮、促进作物根系发育、改善土壤质量的微生物菌剂对促进植物在不利的环境条件下长期存活具有重要意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种促进作物根系发育的微生物菌剂及其制备与应用，以实现有效提高土壤中有效氮的含量，促进植株根系发育，增加作物产量，提高土壤中氮的有效利用率，改善土壤质量的目的。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有类芽孢杆菌和/或类芽孢杆菌的代谢物，所述微生物菌剂用于促进作物根系发育，所述类芽孢杆菌已于2015年12月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其生物保藏编号为CGMCC No.1.15561。

进一步，所述作物为十字花科植物和/或谷物。

可选地，所述十字花科植物选自拟南芥、油菜、萝卜、卷心菜、白菜、甘蓝中的至少一种，所述谷物选自水稻、小麦中的至少一种。

进一步，所述类芽孢杆菌来源于喀斯特经果林根际土壤。

本发明第二方面提供一种如第一方面所述的类芽孢杆菌和/或类芽孢杆菌的代谢物的获取方法，包括如下步骤：

(1)取喀斯特经果林根际土壤加入无菌水中，震荡，放置至澄清，取上清液稀释后涂布至阿须贝氏无氮培养基上；

(2)挑取单菌落，平板画线纯化后得到类芽孢杆菌，随后在Luria-Bertani(LB)液体培养基中扩大培养。

进一步，所述步骤(1)中，喀斯特经果林根际土壤与无菌水的用量比为1g：10-20mL。

进一步，所述步骤(1)中，震荡时间为2-4小时。

进一步，所述步骤(1)中，上清液稀释800-1200倍后涂布至阿须贝氏无氮培养基上。

进一步，所述步骤(1)中，所述阿须贝氏(Ashby)无氮培养基成分组成为：磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙5.0g，甘露醇10.0g，硫酸钙0.1g，琼脂18.0g，pH值6.8-7.0，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟。

进一步，所述步骤(2)中，所述Luria-Bertani(LB)液体培养基成分组成及制备方法为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。

本发明第三方面提供一种利用如第一方面所述的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将类芽孢杆菌接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基中，培养至对数生长期，震荡培养，获得种子液；

(2)将步骤(1)培养好的种子液接种于Luria-Bertani液体培养基中，进行发酵，发酵结束后，所得培养液即为所述微生物菌剂。

进一步，所述步骤(1)中，培养条件为：温度35-38℃、转速150-200rpm，培养时间12-16h。

进一步，所述步骤(1)中，培养至对数生长期时，菌量为1.0×10

进一步，所述Luria-Bertani(LB)培养基成分组成及制备方法为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。

进一步，所述步骤(2)中，种子液在Luria-Bertani液体培养基中的接种量为1-5％。

进一步，所述步骤(2)中，发酵条件为：初始pH 7.0，温度35-38℃，转速150-200rpm，发酵12-16h。

本发明第四方面提供一种如第一方面所述的微生物菌剂或如第三方面所述的方法制备得到的微生物菌剂在作物培育上的应用。

如上所述，本发明的促进作物根系发育的微生物菌剂及其制备与应用，具有以下有益效果：

本发明的类芽孢杆菌(CGMCC No.1.15561)来源于喀斯特经果林根际土壤，可以固定大气中的氮，使土壤中获得更多的有效氮，以便拟南芥等作物能够获得足够的氮。本发明通过建立固氮菌与植物的互作系统发现，类芽孢杆菌能够促进拟南芥根系发育，具体表现为拟南芥主根变短，侧根增多。将类芽孢杆菌制备成微生物菌剂，可广泛用于农业生产中，有效提高土壤中有效氮的含量，促进植株根系发育，增加作物产量，提高土壤中氮的有效利用率，改善土壤质量，对农业、经济和环境具有非常重要的意义。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中不同浓度的类芽孢杆菌处理拟南芥不同时间后根系的生长发育情况图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有类芽孢杆菌和/或类芽孢杆菌的代谢物，所述微生物菌剂用于促进作物根系发育，所述类芽孢杆菌已于2015年12月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其生物保藏编号为CGMCC No.1.15561。

本发明中类芽孢杆菌和/或类芽孢杆菌的代谢物的获取方法为：

(1)取喀斯特经果林根际土壤加入无菌水中，震荡2-4小时，放置至澄清，取上清液稀释800-1000倍后涂布至阿须贝氏无氮培养基上；

(2)挑取单菌落，平板画线纯化后得到类芽孢杆菌，随后在Luria-Bertani(LB)液体培养基中扩大培养。

具体的，步骤(1)中，喀斯特经果林根际土壤与无菌水的用量比为1g∶10-20mL。

其中，喀斯特经果林根际土壤具体是指喀斯特地貌地区(如贵州印江流域)经济果树林的根际土壤，主要有李子树、梨树、桃树等树下除腐殖质以外，深越50厘米的左右的根际土壤(需除去石块和根系)。

本发明所述的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将类芽孢杆菌接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基中，培养至对数生长期(菌量为1.0×10

(2)按照接种量为1-5％将步骤(1)培养好的种子液接种于Luria-Bertani液体培养基中，进行发酵，发酵条件为：初始pH 7.0，温度35-38℃，转速150-200rpm，发酵12-16h；发酵结束后，所得培养液即为所述微生物菌剂。

其中，本发明使用的阿须贝氏(Ashby)无氮培养基是一种缺乏结合态无机或有机氮源的培养基，其成分组成及制备方法为：磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙5.0g，甘露醇10.0g，硫酸钙0.1g，琼脂18.0g，pH值6.8-7.0，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟。

其中，本发明使用的Luria-Bertani(LB)液体培养基成分组成及制备方法为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。

下面通过具体的实施例来对本发明的内容进行进一步说明。

以下实施例中，以拟南芥为研究对象进行试验。拟南芥是一种实验常用的模式生物，与油菜、萝卜、卷心菜等同为十字花科植物，对于水稻、小麦等谷物也有借鉴意义(侧重于基因功能)。

实施例1

固氮菌的筛选和对拟南芥根系发育的影响

首先从10g喀斯特经果林根际土壤加到100mL无菌水中，震荡三小时，放置至澄清，取上清稀释1000倍涂布至阿须贝氏无氮培养基上。挑取单菌落，平板画线纯化后得到固氮菌，随后在Luria-Bertani(LB)液体培养基中扩大培养。经16SrRNA基因测序确定该固氮菌为类芽孢杆菌(CGMCC No.1.15561)。

其中，所述阿须贝氏(Ashby)无氮培养基成分组成及制备方法为：磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙5.0g，甘露醇10.0g，硫酸钙0.1g，琼脂18.0g，pH值6.8-7.0，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟。

其中，所述Luria-Bertani(LB)培养基成分组成及制备方法为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min。

将类芽孢杆菌接入LB液体培养基，37℃、160rpm振荡培养12h后。分别接种1mL种子液于装有100mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，以不加任何菌的培养基作为空白对照，每个处理三个重复，37℃、160rpm振荡培养12h后，分别取培养液200μl、400μl、600μl处理拟南芥幼苗，并在0天、2天、4天、6天拍照记录拟南芥幼苗根的生长情况，结果如图1所示。由图1可知，类芽孢杆菌能够促进拟南芥根系发育，具体表现为拟南芥主根变短，侧根增多，这表明类芽孢杆菌能够有效帮助拟南芥生长并获得足够的营养。

实施例2

类芽孢杆菌的提取，步骤如下：

(1)首先10g喀斯特经果林根际土壤加到200mL无菌水中，震荡2小时，放置至澄清，取上清稀释800倍涂布至阿须贝氏无氮培养基(与实施例1相同)上。

(2)挑取单菌落，平板画线纯化后得到固氮菌，随后在Luria-Bertani(LB)液体培养基(与实施例1相同)中扩大培养。

(3)16SrRNA通用引物测序，比对结果为类芽孢杆菌(CGMCC No.1.15561)。

利用上述类芽孢杆菌生产微生物菌剂，具体步骤如下：

(1)将类芽孢杆菌接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基(与实施例1相同)中，培养至对数生长期(菌量约10

(2)按照1％接种量将培养好的种子液接种于LB液体培养基(与实施例1相同)中，初始pH7.0，温度37℃，转速160rpm，发酵12h。

(3)发酵结束后，培养液罐装成微生物菌剂。

实施例3

类芽孢杆菌的提取，步骤如下：

(1)首先10g喀斯特经果林根际土壤加到200mL无菌水中，震荡4小时，放置至澄清，取上清稀释1000倍涂布至阿须贝氏无氮培养基(与实施例1相同)上。

(2)挑取单菌落，平板画线纯化后得到固氮菌，随后在Luria-Bertani(LB)液体培养基(与实施例1相同)中扩大培养。

(3)16SrRNA通用引物测序，比对结果为类芽孢杆菌(CGMCC No.1.15561)。

利用上述类芽孢杆菌生产微生物菌剂，具体步骤如下：

(1)将类芽孢杆菌接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基(与实施例1相同)中，培养至对数生长期(菌量约10

(2)按照3％接种量将培养好的种子液接种于LB液体培养基(与实施例1相同)中，初始pH7.0，温度35℃，转速200rpm，发酵16h。

(3)发酵结束后，培养液罐装成微生物菌剂。

实施例4

类芽孢杆菌的提取，步骤如下：

(1)首先10g喀斯特经果林根际土壤加到150mL无菌水中，震荡2小时，放置至澄清，取上清稀释1200倍涂布至阿须贝氏无氮培养基(与实施例1相同)上。

(2)挑取单菌落，平板画线纯化后得到固氮菌，随后在Luria-Bertani(LB)液体培养基(与实施例1相同)中扩大培养。

(3)16SrRNA通用引物测序，比对结果为类芽孢杆菌(CGMCC No.1.15561)。

利用上述类芽孢杆菌生产微生物菌剂，具体步骤如下：

(1)将类芽孢杆菌接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基(与实施例1相同)中，培养至对数生长期(菌量约10

(2)按照5％接种量将培养好的种子液接种于LB液体培养基(与实施例1相同)中，初始pH7.0，温度38℃，转速150rpm，发酵14h。

(3)发酵结束后，培养液罐装成微生物菌剂。

本发明的类芽孢杆菌(CGMCC No.1.15561)来源于喀斯特经果林根际土壤，可以促进植物生长，以及固定大气中的氮，使土壤中获得更多的有效氮，以便植株能够获得足够的氮，提高存活率。此外，其作为能够形成内生孢子的细菌接种田间的好处之一是它们能够在不利的环境条件下在土壤中长期存活。在作物种植时，施用以类芽孢杆菌制备的微生物菌剂，能丰富土壤(尤其是喀斯特地区土壤)中固氮菌的菌种资源，减少氮肥的用量，改善土壤肥力，促进植物根系发育和生长，提高农作物存活率及产量，从而降低环境污染，这对农业、经济和环境具有非常重要的意义。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。